多模态纳米载体SAMN@TA@BSAO递送牛血清胺氧化酶作为治疗性酶对结直肠腺癌细胞的靶向杀伤研究

《International Journal of Molecular Sciences》：A Multimodal Nano-Vehicle for the Transport of Biologically Active Amine Oxidase as a Therapeutic Enzyme

高多胺（PA）浓度源于代谢改变，是靶向PA富集癌细胞的"阿喀琉斯之踵"，其原理在于可通过胺氧化酶（AO）催化PA氧化生成毒性副产物。然而，AO的胞内递送仍是一个未解决的难题。近期，一项针对Caco-2细胞的广泛研究显示，一种新型磁性荧光纳米粒子（SAMN@TA）可作为牛血清胺氧化酶（BSAO）的载体。本研究在两种不同的人结直肠腺癌细胞系（LoVo WT与DX）上测试了SAMN@TA@BSAO多模态纳米器件，证实了显著的细胞结合以及剂量依赖性的细胞活力丧失，单次处理分别达到43%与60%。该工作为进一步探究SAMN@TA@BSAO作为潜在抗癌工具的应用提供了依据。

研究背景方面，合成纳米材料进入生物流体后，其命运由硬蛋白冠（hard protein corona）的形成所决定，该蛋白冠决定其转运、蓄积与毒性。在生理环境中，外来物体经历Vroman效应，即先被低亲和力蛋白构成的动态云（软冠，soft corona）包裹，随后逐渐被丰度较低但结合更稳定的蛋白壳层（硬冠）所取代，赋予纳米粒子独特的生物学身份。由于该包膜是有机体实际交互的对象，理性设计硬蛋白冠成为获得高功能性、更佳生物相容性及细胞识别性纳米粒子的突破性策略。在众多氧化铁纳米粒子中，表面活性磁赤铁矿纳米粒子（SAMNs）因兼具内在荧光性、胶体稳定性及简便的表面功能化而脱颖而出；此外，SAMNs可经单宁酸（TA）修饰构建高亲和力蛋白纳米载体。研究人员此前已通过自组装反应，以SAMN@TA作为磁性荧光纳米载体对BSAO进行纳米固定化，所得SAMN@TA@BSAO外层赋予纳米复合物化学与胶体稳定性以及生物催化与隐身特性；尽管BSAO分子量大（180 kDa），仍被有效递送至人结直肠腺癌Caco-2细胞内，并展现出跨越模拟上皮的显著能力，其细胞摄取途径被鉴定为网格蛋白介导的内吞（CME）。此外，SAMN@TA@BSAO通过PA的氧化脱氨诱导细胞毒性，取决于胞内PA含量、杂化纳米材料浓度与孵育时间，单次处理细胞活力丧失接近50%。BSAO催化PA氧化脱氨生成毒性副产物，包括氨、过氧化氢及相应醛类。因此，在靶向癌细胞的酶基治疗背景下，SAMN@TA@BSAO是传统抗癌药物的竞争性替代方案，尤其针对以高胞内PA水平为特征的结直肠腺癌。本研究另选用两种人结直肠腺癌LoVo细胞系：LoVo WT（野生型）与LoVo DX（多药耐药，MDR）。LoVo DX因对多柔比星（DX）、长春新碱和依托泊苷等常见抗癌药物具有多药耐药性而具药理学研究价值，其DX的IC50值在亲本与LoVo DX细胞中分别为0.7 ± 0.2与5 ± 1 μg mL^?1。LoVo DX细胞MDR能力的既有机制与P-糖蛋白相关，后者是一种多特异性ABC（ATP结合盒）转运系统，可将抗癌药物泵出细胞；此外，LoVo DX细胞在氧化应激下具有限制活性氧（ROS）水平的能力，此氧化损伤保护作用与胞内相对高浓度的镁有关，镁促进ATP用于经P-糖蛋白ABC转运系统主动清除抗癌药物。在AO治疗潜力研究方面，Ohkùbo等已证实玉米来源多胺氧化酶（ZmPAO）对LoVo WT与DX的作用，该处理依赖外源性PA给药，以剂量与时间依赖方式随精胺或亚精胺增加细胞凋亡与死亡率；BSAO对LoVo WT与DX的细胞毒性亦被研究，单独给药不引起不良结局，但与递增外源PA联用显示出良好前景，尤其LoVo DX亚系对精胺氧化脱氨产物表现出显著更高的敏感性，这促使研究人员利用小鼠模型开展进一步体内研究，尝试通过将游离酶固定于水凝胶微粒中以克服其化学不稳定性。本研究以LoVo WT与LoVo DX模型考察SAMN@TA@BSAO纳米器件的结合及其在无任何外源PA条件下的效应，以证明该系统的普适性。电感耦合等离子体发射光谱（ICP-OES）用于估算纳米粒子与细胞的结合，结果显示与既往发表的Caco-2细胞数据量级十分相近，且最重要的是对LoVo DX的细胞毒性较LoVo WT更显著，细胞活力分别丧失60%与43%。本文为SAMN@TA@BSAO治疗潜力的体内探索奠定了基础。

研究人员开展的研究及结论与意义方面，本研究在两种结直肠腺癌细胞系上验证了SAMN@TA@BSAO多模态纳米器件的细胞结合与杀伤效应，证实该纳米器件可被细胞大量摄取并诱导剂量依赖性细胞活力丧失，且多药耐药LoVo DX细胞较亲本LoVo WT细胞更为敏感，为后续体内研究评估该多模态诊疗工具的actual治疗潜力奠定基础。

关键技术方法方面（不超过250字）：研究人员以自组装反应在水相中将BSAO纳米固定于SAMN@TA，无需额外试剂；采用透射电子显微镜（TEM）表征形貌，动态光散射（DLS）测定流体力学尺寸与zeta电位，UV-Vis评估MTT检测干扰；以ICP-OES测定细胞与上清中铁含量以评估纳米杂化物结合；以气相色谱-质谱联用（GC-MS）测定胞内精胺（SPM）、亚精胺（SPD）与腐胺（PUT）水平；以MTT法评估细胞活力，并以双因素方差分析（ANOVA）结合Dunnett与Sidak多重比较进行统计。样本队列来源为Caco-2细胞（帕多瓦大学外科、肿瘤与胃肠病学系惠赠）及LoVo WT与LoVo DX细胞（米兰大学生物与健康遗传学系惠赠），LoVo DX由亲本LoVo WT在多柔比星（DX）培养基中长期培养获得。

研究结果方面，第一，纳米材料的合成与表征：通过TEM观察到SAMN经TA修饰及BSAO固定后壳层依次增厚，DLS显示流体力学半径由126 ± 20 nm依次增至362 ± 30 nm与555 ± 40 nm，zeta电位由+26 ± 2 mV变为?22 ± 1 mV与19 ± 2 mV；UV-Vis证实SAMN@TA@BSAO与MTT试剂及甲臜盐无显著光谱干扰，排除细胞活力检测中的化学干扰。第二，纳米杂化物与细胞的结合：ICP-OES显示孵育后上清残余铁含量下降约两个数量级，提示纳米杂化物被大量内化，处理后LoVo WT与LoVo DX胞内铁浓度分别达359 μg mL^?1与328 μg mL^?1，对照细胞约为1 μg mL^?1，且LoVo细胞铁水平高于Caco-2细胞，反映更强的纳米粒子结合倾向。第三，多胺胞内水平：GC-MS显示所有细胞系中精胺（SPM）丰度最高，其次为亚精胺（SPD）与腐胺（PUT），由于内源性精胺是BSAO主要底物，所测PA水平支持将上述模型作为诱导细胞毒性的选择性代谢靶点。第四，细胞活力：10 μg mL^?1 SAMN@TA@BSAO处理24 h，LoVo DX细胞活力显著下降23%，而LoVo WT仅下降11%；处理延长至48 h时，10 μg mL^?1使LoVo WT与DX细胞活力分别下降18%与45%，50 μg mL^?1则分别诱导43%与60%的细胞活力丧失；而无酶的纳米载体SAMN@TA与无载体的BSAO均未显示显著细胞毒性，与既往关于BSAO作为潜在抗癌治疗剂的研究相符。

讨论部分总结：近年来酶作为治疗剂被提出用于包括心血管疾病与癌症在内的多种疾病，但体内半衰期短、免疫原性及缺乏组织靶向性等缺陷仍阻碍酶类药物实际应用，脂质体、病毒体、真核穹窿、红细胞及纳米粒子等创新递送系统相继开发。酶在纳米粒子上的固定化是同时保护治疗载荷免受降解、延长体内半衰期并赋予靶向递送与细胞示踪特性的关键步骤，但有效的治疗性酶运输仍具挑战。本文补充了近期关于以SAMN@TA作为智能纳米载体在Caco-2细胞中递送BSAO的研究。SAMN@TA与BSAO的自发相互作用可归因于合成与生物对应物之间的物理化学适配性，需要尺寸与形状相容性及化学亲和力；BSAO缺乏高密度羧基区域，不能直接与裸SAMNs相互作用，而蛋白在SAMN@TA上的固定可依赖大量氢键以及带负电TA基团与带正电氨基酸侧链间的静电相互作用；具有适当三级结构的酶可匹配SAMN@TA曲率并锚定于纳米载体表面而无需剧烈结构适应，从而避免构象与生物活性丧失。BSAO三级结构中可识别两个主要部分，短轴约6 nm、长轴约10 nm，与SAMN@TA直径相当，两部分带负电与带正电氨基酸侧链分布均等；该几何特征使承载催化位点的部分与理想连接纳米载体的部分明显区分，结合部分因缺乏催化位点而能最大化与纳米粒子的接触，热力学驱动的多点结合可解释其优先的纳米固定取向，这与纳米固定化BSAO生物功能得到广泛证实的保留相符：若结合区对应催化结构域，纳米材料的空间位阻将不可逆抑制酶活性。因此BSAO无需任何结构适应即可被容纳并牢固结合于纳米载体，在不损害治疗载荷生物活性的前提下赋予杂化物稳健性；自组装蛋白壳层可能充当硬蛋白冠，防止内源性蛋白在其跨生物系统递送中干扰。进入Caco-2细胞后，BSAO保持活性，氧化胞内多胺并生成细胞毒性醛类与过氧化氢，该细胞毒性效应呈时间与剂量依赖性，且在高多胺水平细胞中更明显，此为许多癌细胞的共同特征。综上，该亲和性纳米固定化策略的主要新颖性在于开发出能将大分子酶（180 kDa）有效转运至不同癌细胞并保持其催化活性的纳米载体。本研究中胞内铁水平的显著升高可 plausibly 由细胞体积远小于介质体积、结合现象涉及实际浓缩效应来解释，LoVo细胞铁水平显著高于Caco-2细胞，反映纳米粒子与细胞结合倾向更强；尽管ICP-OES不能区分表面结合与实际内化的金属或金属氧化物纳米粒子，如此高的铁水平及与Caco-2的相似性提示发生了显著的SAMN@TA@BSAO摄取。纳米粒子聚集行为可导致纳米材料优先蓄积于细胞表面并与实际胞内内化过程竞争，但该替代负载模式源于高一个数量级的氧化铁纳米粒子浓度暴露，而本研究中纳米材料剂量系为授予生物应用所需足够胶体稳定性而选择；将磁核近似为半径5 nm球体并按磁赤铁矿密度4.86 g cm^?3估算，纳米粒子胞内分布约为10²个 μm^?3。尽管本研究未证实SAMN@TA@BSAO的作用机制，LoVo细胞活力丧失很可能归因于BSAO对多胺的胞内氧化；除SAMN@TA@BSAO结合倾向与内源性PA水平差异外，特定细胞系对BSAO催化产物的敏感性是重要因素，与既往揭示LoVo DX弱点的研究一致，多药耐药细胞对纳米递送的酶治疗表现出更高易感性。除PA高含量外，SAMN@TA@BSAO预期还通过两种额外机制展现靶向能力：肿瘤微环境典型的酸性pH下催化活性增强（已在近期研究中证实），以及纳米粒子对实体瘤常见的增强渗透与滞留（EPR）效应。

研究结论部分翻译：本研究利用Caco-2与LoVo两种替代性结直肠腺癌细胞系考察了SAMN@TA@BSAO作为潜在抗癌工具的multifaceted性能。与SAMN@TA@BSAO的尺寸相反，两种LoVo细胞系均表现出与杂化纳米材料相互作用的显著倾向，胞内浓度达数百μg g^?1，并超越Caco-2细胞的负载能力。尽管LoVo DX亚系在受检细胞中胞内PA水平最低，却成为最易感的细胞系，细胞活力丧失达60%；有趣的是，与亲本LoVo WT相比，该结果与既往报道的LoVo DX对AO催化毒性副产物更高敏感性完全一致。总体而言，本文结果有助于为未来旨在评估这一新型多模态诊疗工具实际治疗潜力的体内研究奠定基础。