《International Journal of Molecular Sciences》：Gene Expression Signatures in Endometriosis: Molecular Insights and Potential Clinical Applications
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二硫键死亡（disulfidptosis）是一种调节性细胞死亡形式，由NADPH耗竭以及高表达SLC7A11细胞的肌动蛋白细胞骨架上的二硫键应激所引发。基于二硫键死亡相关基因（DRGs）构建的评分日益被提出作为预后标志物，然而其内部结构与代谢背景仍界定不清。研
二硫键死亡（disulfidptosis）是一种调节性细胞死亡形式，由NADPH耗竭以及高表达SLC7A11细胞的肌动蛋白细胞骨架上的二硫键应激所引发。基于二硫键死亡相关基因（DRGs）构建的评分日益被提出作为预后标志物，然而其内部结构与代谢背景仍界定不清。研究人员在10,242例原发肿瘤（33种TCGA癌症类型）和722份正常组织中考察了24个DRGs，并结合生存、纯度及基因组数据。SLC7A11在18种癌症中的14种呈上调，而多数细胞骨架DRGs在肿瘤中处于较低水平。DRG评分与较短总生存期的合并关联呈现异质性（每标准差HR 1.15，95% CI 1.06–1.25；预测区间0.78–1.70），在校正可获得的临床协变量和纯度后，该关联在6种癌症中仍然存在（FDR < 0.05）：其中5种为不良关联，包括低级别胶质瘤（HR 1.68；在校正IDH及1p/19q状态、分级和纯度后衰减至1.24，p = 0.046）和间皮瘤，而在透明细胞肾细胞癌中为保护性关联。预设的核心亚群与细胞骨架亚群几乎不相关（中位ρ = ?0.04）：SLC7A11表达与磷酸戊糖途径（PPP）/NADPH基因相关且独立于纯度（中位ρ = 0.32），而细胞骨架亚群则与氧化磷酸化（OXPHOS）基因呈相反关系。然而，在校正NRF2靶基因表达后，SLC7A11与核心PPP酶基因的偶联并不强于表达匹配的随机基因。在联合模型中，各亚群均被证明具有独立预后价值，但见于不同癌症。该复合评分在更多癌症类型中具有预后价值，优于同等大小的随机基因集（9 vs. 3；p = 0.04）；而在4种具有稳健模型的癌症中，基于DRG的LASSO-Cox模型并不优于由随机24基因集构建的模型。DRG评分宜被分解解读，而非作为单一二硫键死亡轴来解读。
研究背景方面，细胞死亡逃逸与细胞代谢重编程是癌症hallmarks中紧密交织的两大特征。近十年来，多种调节性细胞死亡程序被证实源于代谢失衡而非专门的死亡机器，如铁死亡（ferroptosis）和铜死亡（cuproptosis）。2023年Liu等将二硫键死亡（disulfidptosis）加入这一列表：当高表达胱氨酸/谷氨酸逆向转运体SLC7A11（xCT）的细胞缺乏葡萄糖时，输入的胱氨酸还原消耗胞质NADPH池，肌动蛋白细胞骨架蛋白间形成二硫键，F-actin网络崩溃。肿瘤代谢与二硫键死亡紧密相连：SLC7A11高表达癌细胞依赖葡萄糖经磷酸戊糖途径（PPP）产生的NADPH来还原胱氨酸，其谷氨酸外排收窄代谢灵活性并加深葡萄糖依赖；NRF2和ATF4在转录水平诱导SLC7A11，该转运体在多种癌症中过表达并防御铁死亡。功能上，与二硫键死亡相关的基因并非单一群体：Liu等的葡萄糖饥饿CRISPR筛选显示，最强抑制性命中（其缺失保护细胞）为SLC7A11、SLC3A2、RPN1和NCKAP1；GYS1及线粒体基因NUBPL、NDUFA11、NDUFS1、LRPPRC和OXSM为协同性命中（其缺失放大细胞死亡）；二硫键蛋白质组学另检出FLNA、FLNB、MYH9、TLN1和ACTB等获得异常二硫键的肌动蛋白-细胞骨架蛋白。目前存在的问题是：已有大量泛癌和癌种特异性研究将这些基因合并为预后signature和评分，但多数工作仍将DRG集视为单一程序，三个问题鲜受关注：（i）DRG集中功能不同的组分在人类肿瘤中是否协同变化；（ii）DRG表达与代谢的关联是否真正反映定义二硫键死亡的SLC7A11-NADPH轴，抑或受肿瘤纯度和共调控线粒体基因混杂；（iii）基于DRG的预后模型在样本外评估时表现如何。为此研究人员开展了本项研究。研究结论为：常用作二硫键死亡相关的24个基因在人类癌症中形成两个功能不同且转录上不耦合的亚群；SLC7A11表达持续上调，且如若干线粒体DRGs一样独立于肿瘤纯度地与PPP/NADPH基因相关，但在校正NRF2靶基因表达后并不特异性地与核心PPP酶基因相关；肌动蛋白-细胞骨架亚群与低OXPHOS、糖酵解的expression profile相关；复合DRG评分呈现异质性预后关联，在LGG、MESO及若干癌中为不良、在KIRC中为保护，且在若干癌症中这些关联可归因于某一亚群；然而在DRG多基因模型表现稳健的癌症中，其并不优于随机基因集构建的模型，提示其预后价值并非二硫键死亡特异。将DRG评分分解为其组分应能改善二硫键死亡signature的生物学解读与实验检验。其重要意义在于提示复合评分在作任何生物学解读前应予分解，并提供可应用于TCGA未涵盖癌种与队列的亚群层面框架。
关键技术方法方面（不超过250字）：研究采用TCGA Pan-Cancer Atlas经批次校正的RNA-seq表达数据（EB++ adjusted，log2[normalised count + 1]）、TCGA临床数据资源（含OS、DSS、DFI、PFI）及样本注释，均来自UCSC Xena PanCanAtlas hub；肿瘤纯度取自PanCanAtlas ABSOLUTE call set，非同义体细胞突变取自MC3 call set，基因水平拷贝数取自PanCanAtlas SNP6数据；每个患者保留单个原发肿瘤，共10,242例肿瘤（33种癌症类型），18种癌症的722份正常组织纳入肿瘤-正常比较。DRG活性以单样本基因集富集分析（ssGSEA）量化；采用Cox比例风险模型、DerSimonian–Laird随机效应meta分析、LASSO-Cox模型（100次重复分层70/30训练-测试拆分）、表达匹配随机基因集零模型及Schoenfeld残差检验等。
研究结果方面：2.1 SLC7A11持续上调而多数细胞骨架DRGs在肿瘤中低表达——通过18种癌症类型的肿瘤-正常比较（Mann–Whitney U检验，FDR < 0.05）得出，432个基因-癌种比较中304个（70%）差异显著；SLC7A11在14种癌症上调、无下调（中位log2 fold change 2.01），其核心亚群伙伴RPN1（13升1降）和SLC3A2（12升2降）同向变化；DSTN和NDUFS1各在14种癌症中降低，FLNA和IQGAP1各在11种中降低；复合DRG评分在9种癌症中升高、在KICH和KIRC中降低（|Δ| ≤ 0.08）。肿瘤内细胞骨架DRGs彼此正共表达（中位ρ = 0.11），存在强FLNA-MYH9-TLN1模块（ρ = 0.53–0.59）；核心亚群整体共表达弱（中位ρ = 0.04）；预设分区捕获的共表达结构超出随机（置换p = 0.0006），但核心亚群是功能分组而非共表达模块。2.2 DRG评分与生存呈异质性、多为不良的关联——通过单因素Cox分析得出，在28种可评估癌症中11种较高DRG评分伴随较短OS（p < 0.05；8种FDR < 0.05），KIRC中伴随较长OS；效应量最大见于MESO（每SD HR 1.83）、UVM（1.76）、LGG（1.57）、PAAD（1.47）和CESC（1.43）；随机效应meta分析合并OS的HR为1.15（1.06–1.25），DSS为1.16、PFI为1.11，DFI无显著关联；异质性显著（I2 71–79%），OS的95%预测区间（0.78–1.70）跨1；基因水平672个基因-癌种OS关联中53个达FDR < 0.05（40不良、13保护），集中于LGG（13个基因）、KIRC（11）、MESO（7）和PAAD（5）；在LGG中11个不良基因中8个属细胞骨架亚群，MESO中全部7个显著基因均为细胞骨架基因；SLC7A11本身在ACC、KIRP、KIRC和LIHC中为不良因素；与1000个表达匹配随机24基因集比较，DRG评分在9/28种癌症达FDR显著（随机集中位数3，经验p = 0.041），而任一亚群单独均未超出随机预期。2.3 核心与细胞骨架亚群几乎不相关并携带互补预后信息——通过亚群评分相关分析和联合Cox模型得出，两亚群评分在肿瘤内基本不相关（中位ρ = ?0.04，33种癌症中22种|ρ| < 0.2），肿瘤-正常行为常相反（8种癌症中方向相反）；纯度与细胞骨架评分负相关（中位ρ = ?0.25）、与核心评分弱正相关（0.15）；单因素分析中细胞骨架亚群在LGG（HR 1.69）、MESO（1.99）、PAAD（1.46）和UVM（2.09）达FDR显著，核心亚群仅名义关联；联合模型中各亚群独立贡献但见于不同癌症：细胞骨架亚群在LGG、MESO、UVM、PAAD和CESC显著，核心亚群在LUAD、LIHC和BRCA显著，两者在KIRC均保护；校正纯度和四种微环境评分后，细胞骨架亚群在LGG和MESO仍不良（FDR < 0.05）、在UVM和LAML于FDR < 0.1水平，核心亚群在BLCA、LIHC和LAML不良、在KIRC保护。2.4 DRG表达追踪PPP/NADPH基因且独立于肿瘤纯度——通过控制ABSOLUTE纯度的偏Spearman相关得出，DRG评分与PPP/NADPH程序相关性最强（中位偏ρ = 0.29；33种癌症中26种FDR < 0.05为正、无一为负），其次为糖原代谢（0.25）、糖酵解（0.23）、缺氧（0.22）和脂肪酸合成（0.22）；OXPHOS（?0.06）和半胱氨酸/硫代谢（?0.06）为主要负相关程序；纯度校正几乎不改变这些相关性（未校正与校正中位数r = 0.99）。两亚群代谢谱不同：核心亚群与TCA循环（0.43）、PPP/NADPH（0.40）、硫氧还蛋白系统（0.35）、谷氨酰胺（0.34）等正相关，基因水平分解显示TCA和OXPHOS偶联由线粒体协同性命中携带（NDUFA11-OXPHOS ρ = 0.58等），而SLC7A11与PPP/NADPH基因相关（中位ρ = 0.32）但与TCA（0.04）和OXPHOS（?0.04）无关；然而LRPPRC和NDUFS1与PPP/NADPH集的相关性同样强（各0.30），且该集含NRF2靶基因和线粒体一碳基因；限定于PPP氧化和非氧化分支酶的核心PPP集时，SLC7A11相关性在校正纯度后为0.08、再校正NRF2靶点评分后为0.03，处于表达匹配随机基因范围内（经验p = 0.30），其与更广NADPH集的相关在校正后持续（0.21），推测归因于PPP外的NADPH生成酶（ME1、IDH1、NNT、H6PD）和一碳基因；细胞骨架亚群与OXPHOS（?0.39）、硫氧还蛋白（?0.26）等负相关、与葡萄糖摄取（0.20）、糖原代谢（0.17）和糖酵解（0.16）正相关，符合糖酵解、低呼吸表达谱；三个评分×通路交互作用修饰DRG评分与OS的关联：LGG中谷胱甘肽代谢（交互HR 1.32，FDR = 0.013）和硫氧还蛋白系统（1.36，FDR = 0.045），LUAD中糖原代谢（1.24，FDR = 0.025）。2.5 DRG模型的独立预后价值与样本外表现——通过多变量Cox模型和100次重复分层70/30拆分的LASSO-Cox模型得出，校正可获得临床协变量和ABSOLUTE纯度并多重检验校正后，DRG评分在6种癌症中仍与OS相关（FDR < 0.05）：LGG（HR 1.68）、MESO（1.80）、LAML（1.40）、HNSC（1.31）、LUAD（1.23，因比例风险假设违反需谨慎解读）和KIRC（保护性，0.84）；在胶质瘤中校正IDH状态使LGG的DRG评分HR降至1.29，进一步校正1p/19q共缺失为1.20（p = 0.068）、校正分级为1.19（p = 0.094）、校正纯度为1.24（p = 0.046），细胞骨架亚群在各步均保持关联（完全校正HR 1.29），而核心亚群则否（1.03）；IDH突变型LGG中细胞骨架亚群不良（1.64）、核心亚群保护（0.67）；Schoenfeld检验显示LGG细胞骨架项在q < 0.1水平有一处违反（前2.2年HR 2.18，此后1.26）。21种癌症中多基因LASSO-Cox模型样本外区分度总体有限（中位测试C-index 0.56），7种癌症中位C-index ≥0.6，4个模型满足全部稳健性标准：KIRP（0.76）、LGG（0.75）、MESO（0.64）和KIRC（0.64），最稳定选择的基因与亚群结果呼应（LGG中IQGAP1 100%选择、ACTN4 81%、FLNA 60%；MESO中FLNB 90%、ACTN4 73%；KIRP中SLC7A11 99%；KIRC中LRPPRC 93%为保护系数、SLC7A11 89%和ACTB 90%为不良系数）；与临床模型基准比较，加入DRG LASSO风险评分使LGG中位测试C-index从0.75升至0.81（96%拆分改善）、MESO从0.51升至0.62（94%），而KIRC和KIRP中临床协变量单独表现相当，无癌症类型中增益的95%范围排除零；四个稳健模型均不优于由100个表达匹配随机24基因集构建的LASSO模型（经验p 0.40–0.80）。2.6 临床亚组与基因组改变——通过UALCAN式亚组分析得出，KIRC中DRG评分随病理分期（趋势ρ = ?0.24）和组织学分级（?0.19）下降，HNSC中随分级下降（?0.24）尽管评分为不良因素，LGG中较高级别伴较高评分（3级vs 2级，FDR = 0.002）、PAAD中亦然（ρ = 0.22）；基因水平219个基因-亚组关联显著，多数涉及分级（85个）；DRGs体细胞突变罕见（每基因中位频率<3%），最高见于超突变肿瘤如UCEC（FLNA 16.7%、FLNB 13.5%）和SKCM（FLNB 12.3%）；拷贝数改变更常见，最突出为ACTB获得（跨癌症中位17.5%的肿瘤，GBM中高达70%）和MYH10缺失（中位20.5%）；拷贝数与表达在73%的基因-癌种对中正相关（中位ρ = 0.31），显著例外为SLC7A11（中位ρ = 0.11，表达最不依赖拷贝数）。
讨论部分总结：复合二硫键死亡相关基因评分日益被用作单一预后生物标志物，本研究结果提示此类评分结合了两个生物学上不同的程序，这对其机制解读和向其他肿瘤类型转化均很重要。核心亚群反映CRISPR筛选中鉴定的胱氨酸转运和线粒体机器，细胞骨架亚群反映作为二硫键应激最终靶点的肌动蛋白网络；由于两组分在肿瘤中转录上不耦合，高复合评分可源于任一者，其生物学含义因此在癌种间不同。与表达匹配随机基因集的基准比较限定了这一图景：复合评分在更多癌症类型中具有预后价值，但任一亚群单独则否，且亚群间近零相关处于随机基因集对所见范围内，故分解在单个癌种内最具信息量。关于SLC7A11：其为最持续上调的DRG，表达 largely 独立于拷贝数（符合NRF2和ATF4的转录诱导），并在多数癌症类型中独立于肿瘤纯度地与PPP/NADPH基因相关；然而LRPPRC和NDUFS1与PPP/NADPH基因集的相关性同样强，且若干PPP基因本身为NRF2靶点，故该偶联并非SLC7A11特异，可能部分反映共享转录调控而非NADPH通量；校正NRF2靶基因表达后，SLC7A11与核心PPP酶基因的偶联不强于表达匹配随机基因，其与更广NADPH基因集的残余关联推测反映PPP外NADPH生成酶和一碳基因；转录组数据因此未提供肿瘤中SLC7A11-PPP轴的独立支持；核心亚群与TCA和OXPHOS基因的强偶联由线粒体协同性命中驱动，不应解读为二硫键死亡相关代谢重编程的证据；因核心亚群混合了缺失抑制与缺失敏化二硫键死亡的基因，基因水平分析优于核心亚群评分。细胞骨架亚群行为不同：其基因在肿瘤中多低于正常组织表达，但较高表达在LGG、MESO、UVM、PAAD和CESC中独立于核心亚群地与不良生存相关，稳健LGG和MESO模型中最稳定选择的基因为IQGAP1、ACTN4、FLNA和FLNB；这些蛋白既是二硫键应激底物也是迁移和侵袭效应器，该亚群与OXPHOS基因反相关、与葡萄糖摄取和糖酵解基因正相关，符合运动性、糖酵解表型；因其与肿瘤纯度负相关且部分基因在成纤维细胞和平滑肌中高表达，部分信号可能源于基质细胞，但其预后关联在校正纯度后（LGG、MESO、UVM、CESC）及在校正成纤维细胞、平滑肌、内皮和白细胞标志评分后（LGG、MESO）仍持续；LGG中该亚群关联在校正IDH和1p/19q状态后衰减但仍存在、仅在IDH突变型肿瘤中显著且随访早期最强。KIRC为一致例外：DRG评分在肿瘤中低于正常肾、随分期和分级下降、独立于临床协变量和纯度地与较长生存相关，两亚群在联合模型中均保护；ccRCC以VHL缺失、假性缺氧信号和线粒体呼吸抑制为特征，侵袭性肿瘤显示TCA循环基因下调，故保护性关联可能反映保留更分化、氧化的肿瘤状态（由LRPPRC等线粒体基因捕获）而非抗细胞死亡；同一癌症中SLC7A11单独为不良因素，说明单个DRG与复合评分可指向相反方向。验证结果降低了对DRG风险模型的期望：多数模型区分度仅略优于随机，稳健表现见于4种癌症，更重要的是这四个模型均未优于表达匹配随机24基因集构建的LASSO模型，DRG风险评分在LGG、MESO和PAAD中最一致地为临床协变量增加区分度，但无癌症类型中增益的95%范围排除零；这提示样本外表现本身不能确立signature捕获二硫键死亡生物学，随机基因集和临床基准应伴随此类signature。研究局限性包括：所有分析基于bulk转录组关联，不能确立所分析肿瘤中发生二硫键死亡；mRNA水平不能捕获定义该过程的蛋白二硫键状态；亚群为基于功能证据的先验定义而非从数据发现，核心亚群混合功能相反的基因；微环境校正依赖标志基因评分而非正式去卷积；PPP酶转录水平仅为NADPH生成的间接代理；除胶质瘤外多变量模型限于可获得临床协变量、未含分子亚型；若干癌症正常样本或事件数少，LUAD中DRG评分的比例风险假设违反，LGG中细胞骨架亚群有时变效应，LASSO模型的随机基因集基准限于四个稳健癌症；通过UALCAN可获得的蛋白水平（CPTAC）和启动子甲基化数据未分析，且未使用独立外部队列；需要在葡萄糖限制下操纵SLC7A11和单个细胞骨架DRG的实验研究以及蛋白质组学和外部验证。
研究结论部分翻译：常用作二硫键死亡相关的24个基因在人类癌症中形成两个功能不同且转录上不耦合的亚群。SLC7A11表达持续上调，且如若干线粒体DRGs一样独立于肿瘤纯度地与PPP/NADPH基因相关，但在校正NRF2靶基因表达后并不特异性地与核心PPP酶基因相关，而肌动蛋白-细胞骨架亚群与低OXPHOS、糖酵解表达谱相关。复合DRG评分呈现异质性预后关联，在LGG、MESO及若干癌中为不良、在KIRC中为保护，且在若干癌症中这些关联可归因于某一亚群或另一亚群。然而在基于DRG的多基因模型表现稳健之处，其并不优于随机基因集构建的模型，表明其预后价值并非二硫键死亡特异。将DRG评分分解为其组分应能改善二硫键死亡signature的生物学解读与实验检验。
