猪ANPEP N783A编辑细胞克隆对传染性胃肠炎病毒易感性降低的研究

《Microorganisms》：Reduced Susceptibility to Transmissible Gastroenteritis Virus in Porcine ANPEP N783A-Edited Cell Clone

传染性胃肠炎病毒（transmissible gastroenteritis virus, TGEV）以由丙氨酰氨基肽酶基因（alanyl aminopeptidase gene, ANPEP）编码的猪氨基肽酶N（porcine aminopeptidase N, pAPN）作为细胞受体。完全破坏ANPEP可限制TGEV感染，但可能损害APN相关功能。本研究探讨了在N783位点对pAPN进行有限修饰是否能在不消除APN蛋白表达或本研究检测的氨基肽酶活性的情况下降低细胞对TGEV的易感性。随后，研究人员使用Prime editing在表达PE7的PK15细胞中生成了ANPEP N783A编辑克隆。该编辑克隆保留了APN蛋白表达、细胞归一化的氨基肽酶活性以及膜相关APN染色。在感染复数（multiplicity of infection, MOI）为0.01、0.1和1的TGEV暴露后，感染后24小时含有TGEV核衣壳（N）基因序列的细胞内RNA分别减少约83%、73%和74%。在大多数感染条件下，编辑细胞还维持较高的相对细胞活力，其中在感染后36小时（hours post-infection, hpi）且MOI为1时差异最大（83%对42%）。在MOI为0.1和1时，相对乳酸脱氢酶（lactate dehydrogenase, LDH）释放分别减少约28%和22%。编辑细胞还表现出较弱的死细胞荧光和较轻的形态学损伤。这些发现提供了初步的、克隆特异性的证据，表明ANPEP N783A编辑克隆可以在保留所检测的APN相关表型的同时表现出对TGEV的易感性降低。

传染性胃肠炎病毒（transmissible gastroenteritis virus, TGEV）是一种α冠状病毒，可引起猪急性肠道疾病，表现为呕吐、水样腹泻和脱水，新生仔猪死亡率尤其高。尽管疫苗接种和猪群管理已在部分地区减少典型TGEV疫情，但疫苗介导的控制并不完全；TGEV通过纤突（spike, S）基因突变与重组持续多样化，可能影响疫苗匹配和田间保护。猪氨基肽酶N（porcine aminopeptidase N, pAPN）由丙氨酰氨基肽酶基因（ANPEP）编码，是肠道上皮细胞表达的一种膜结合外肽酶，也是TGEV的主要细胞受体。TGEV-pAPN相互作用所需决定簇位于pAPN第717–813位残基，且不同于催化位点；ANPEP缺失猪不能支持TGEV感染，但完全敲除会同时消除氨基肽酶活性。因此，研究人员探究能否通过有限修饰pAPN N783位点，在保留APN相关功能的同时降低TGEV易感性。该位点位于已定位的TGEV相关区域，且猪呼吸道冠状病毒（porcine respiratory coronavirus, PRCV）受体结合域（receptor-binding domain, RBD）与pAPN的晶体结构中，Asn783骨架羰基与对应TGEV Trp571的色氨酸形成氢键，提示N783可能参与受体识别。

在本研究中，研究人员通过Prime editing在PK15细胞中引入ANPEP N783A替换，获得编辑克隆。该克隆保留APN蛋白表达、氨基肽酶活性和膜相关APN染色；TGEV感染后病毒RNA积累和感染相关细胞损伤均降低。这些结果提供了初步、克隆特异性的证据，表明ANPEP N783A编辑克隆可在保留所检测APN相关表型的同时降低TGEV易感性，也说明精准受体编辑可能成为替代完全基因敲除的策略。

关键技术方法：研究人员先以AlphaFold3对TGEV S蛋白RBD与pAPN复合物进行探索性建模；随后在稳定表达PE7（一种Prime editor变体）的PK15细胞中，通过Prime editing将ANPEP中Asn783编码密码子AAC编辑为GCT，经单细胞克隆与Sanger测序获得杂合编辑克隆。TGEV WH-1株由上海兽医研究所提供。检测方法包括Western blot、细胞归一化氨基肽酶活性测定、未透化免疫荧光、RT-qPCR、CCK-8细胞活力检测、LDH释放检测、死细胞染色及形态学观察。统计采用双尾非配对t检验。

3.1 N783A编辑克隆的生成及APN相关表型评估
通过AlphaFold3探索性建模，研究人员比较了TGEV S-RBD与野生型或N783A pAPN的复合物；模型结果显示两者预测全局结构高度相似（Cα RMSD=0.154 ?），但界面置信度较低，故仅作为探索性结构背景。通过Prime editing和单细胞克隆，Sanger测序显示目标密码子同时存在AAC和GCT信号，符合杂合编辑。Western blot及灰度分析显示，N783A PE7-PK15细胞与PE7-PK15细胞的APN蛋白表达无显著差异；细胞归一化氨基肽酶活性在两种细胞中相当；未透化免疫荧光显示APN染色部分与DiD（一种膜荧光染料）标记的质膜重叠，说明编辑克隆表面存在可及APN。由此证实N783A编辑未消除APN蛋白表达、氨基肽酶活性或膜相关分布。

3.2 N783A编辑克隆TGEV RNA积累降低且感染相关细胞损伤减轻
通过RT-qPCR检测感染后24 hpi细胞内TGEV N基因RNA，在MOI 0.01、0.1和1条件下，编辑细胞较对照分别降低约83%、73%和74%。通过CCK-8细胞活力检测，MOI为1时编辑细胞在24、36、48 hpi的相对细胞活力约为101%、83%和52%，对照组为72%、42%和41%；36 hpi时，MOI 0.01和0.1条件下编辑细胞相对活力也高于对照。LDH释放检测显示，MOI 0.1和1时编辑细胞相对LDH释放显著低于对照（103%对143%；136%对174%）。死细胞染色显示编辑细胞绿色荧光更弱；明场图像显示其细胞脱落和形态学改变更轻。由此证明编辑克隆在TGEV感染后病毒RNA积累更低、细胞损伤更轻。

讨论部分指出，已有通过ANPEP编辑抗TGEV的策略大多依赖完全破坏受体，而CD163（一种清道夫受体）的SRCR5结构域（scavenger receptor cysteine-rich domain 5，清道夫受体富含半胱氨酸结构域5）缺失或点突变可限制猪繁殖与呼吸综合征病毒（porcine reproductive and respiratory syndrome virus, PRRSV）感染而不去除整个受体，为精细编辑宿主受体提供了先例。Reguera等发现，N736A或T738V突变破坏Asn736的N-连接糖基化位点后，TGEV RBD与细胞表面pAPN的结合消失；Li等随后在内源ANPEP中引入纯合N736A/T738V，获得抗TGEV的PK15细胞。本研究关注的N783位点可在保留APN相关功能的同时降低TGEV易感性，拓展了除N736糖基化基序外可供精准修饰的pAPN区域。讨论同时提出，目前仅检测一个杂合克隆，该位点对TGEV易感性的贡献是否具有等位基因剂量依赖性尚待验证；未来需要独立来源的野生型、杂合和纯合克隆，结合拯救实验和直接病毒学试验，确定可重复性、剂量关系及受影响的感染阶段，并在猪肠道上皮细胞和体内模型中进一步验证N783的生理相关性。

研究结论：本研究利用Prime editing生成了ANPEP N783A编辑的PK15克隆。编辑细胞在保留APN蛋白表达、细胞归一化氨基肽酶活性和膜相关APN染色的同时，表现出TGEV N RNA积累降低和感染相关细胞损伤减轻。这些发现为N783作为TGEV易感性进一步评估位点提供了初步的、克隆特异性的证据，并初步证明精准受体编辑可在保留所检测的APN相关表型的同时降低病毒易感性。