合成LWTX4在标准柱后氧化（PCOX）与HILIC–MS/MS条件下的色谱及质谱分析特征

《Toxins》：Chemical Characteristics of Synthetic LWTX4 and Paralytic Shellfish Toxins Under Standard Post–Column Oxidation (PCOX) and HILIC–MS/MS Conditions

Lyngbya wollei toxin 4（LWTX4）作为石房蛤毒素（STX）的一种稀有衍生物，因其可获得性有限，其分析特征至今仍缺乏充分记载。因此，本研究采用Looper先前报道的合成路线合成LWTX4，以阐明其基本色谱行为。此外，另三种麻痹性贝类毒素类似物STX、脱氨甲酰基石房蛤毒素（dcSTX）及12-epi-LWTX4由共同中间体制备而成。采用AOAC OMA 2011.02 HPLC–PCOX–FLD方法分析合成LWTX4，得到保留时间为19.8 min，与STX的保留时间重叠，并揭示其FLD响应为STX的十四分之一。同时，在AOAC 2021 HILIC–MS/MS条件下，LWTX4于7.29 min洗脱，产生主要产物离子m/z 205.1204、182.0926、164.0822和110.0720。这些色谱与质谱特征为在生物样品PST谱图分析中评估LWTX4的可能存在提供了有价值的参考数据。合成STX与dcSTX在标准HPLC–PCOX条件下表现出与相应有证参考物质（CRMs）一致的色谱行为，支持将合成作为从甲藻中分离PSTs以制备CRMs的补充途径。

麻痹性贝类毒素（Paralytic Shellfish Toxins, PSTs）是一类由亚历山大藻属（Alexandrium）、裸甲藻属（Gymnodinium）和原甲藻属（Pyrodinium）等海洋甲藻产生的天然海洋生物毒素，以石房蛤毒素（saxitoxin, STX）及其衍生物为代表。PSTs经海洋食物网由藻类蓄积于滤食性无脊椎动物，尤其是双壳贝类体内。因此，有害藻华（harmful algal blooms, HAB）期间食用贝类体内PSTs的高水平蓄积可导致人类致死性中毒，并给水产养殖业造成重大经济损失。为此，许多国家定期监测贝类中PSTs水平以预防中毒事件。自1975年通过单晶X射线衍射阐明STX结构以来，已从多种藻类中分离并结构表征了50余种类似物。STX衍生物具有携带胍基部分的独特三环骨架，结构变异主要发生在N-1、C-11、C-12和C-13位，据此可分为不同结构亚型。STX被认为是除毒液肽外毒性最强的天然分子之一，其所致麻痹源于STX的胍基选择性结合神经元电压门控钠通道（voltage-gated sodium channels, VGSCs）位点1，阻断钠离子传导孔道，从而破坏神经元信号传导。STX类似物的毒性随取代基与净电荷不同而变化，一般而言，PST衍生物毒性随净极性降低而减弱；双阳离子型氨基甲酸酯毒素如STX和neoSTX毒性最高，而引入带负电荷硫酸基团（如GTXs和C-毒素）则趋于降低其对VGSC的结合亲和力与毒性。PSTs的强神经毒性与有限可获得性引起了合成化学家的广泛兴趣。自Kishi课题组于1977年首次报道STX全合成以来，已开发出多种合成STX衍生物的有用路线。尽管多数全合成最终旨在支持天然产物的药理学研究，化学合成的天然产物亦可用作生物样品中其定性定量的参考物质。尤其对于LWTXs和GC毒素等目前无参考物质供应、且在标准分析条件下特征未知的稀有STX衍生物，全合成是获取此类化合物的有前景途径。本研究聚焦于评估LWTX4的分析特征，该化合物为在C-12位带有羟基的稀有PST，由Onodera等1997年首次从美国阿拉巴马州Guntersville水库采集的淡水蓝细菌Lyngbya wollei中分离得到。由于天然来源的LWTX4可获得性有限，其在标准化PST分析条件下的色谱与质谱特征尚未得到充分研究。为此，研究人员采用先前报道的合成路线合成了LWTX4，同时制备dcSTX与STX，随后采用AOAC OMA 2011.02（HPLC–柱后氧化–荧光检测，HPLC–PCOX–FLD）方法与AOAC 2021 HILIC–MS/MS方法建立LWTX4的分析轮廓。此外，将合成dcSTX与STX与相应有证参考物质（certified reference materials, CRMs）进行比较，以评估其作为分析参考物质的潜在用途。在合成方面，研究人员以Looper的STX全合成策略为基础设计LWTX4合成路线，制备关键三环中间体2，该中间体与已报道相应中间体仅N-7位保护基不同；由炔烃1经银(I)/碘介导的环化序列获得化合物2，设想2中C-12酮的还原从位阻较小的β面传递氢负离子以得到α-羟基，随后经常规脱保护步骤制得LWTX4；参照Looper合成，dcSTX可由2经脱保护便捷获得；STX则由dcSTX在水介质中经氨甲酰化直接制得。中间体2的制备自炔烃7与硝酮6在i-PrMgCl作用下偶联开始，以10 g规模得到烯丙胺8（产率80%）；经Zn/AcOH还原断裂8中N–O键，继以Boc基脱保护暴露二胺，再与N,N'-二-Boc-S-甲基异硫脲进行胍基化，得到双胍中间体1（产率74%）。化合物1经Ag(I)介导环化得到含PST骨架五元B环的化合物10；10的碘胍基化形成双环化合物11需在5 h内分三批加入4.5当量碘以实现完全转化与高产率；11经分子内SN2反应在C-12位引入氧原子，最初按报道条件使用AgOAc进行，但伴随不明副反应，产物12产率仅30%；经筛选银(I)盐（Ag2O、AgOTf、CF3CO2Ag）与极性溶剂（DMF、DMSO、MeCN），确定CF3CO2Ag/DMF为最优条件，以66%产率得到环状氨基甲酸酯12；12经碱性水解触发N-3与C-10间SN2反应，以92%产率得到13；13经氧化并脱除TBDPS基团得到关键中间体2，该序列效率与Looper报道几乎一致。随后研究N-7位PMB基的脱除：模型研究中脱除13的TBDPS基得到化合物15（非天然C-12差向异构体LWTX4的高级中间体），在多种氢解条件下脱除15的PMB基均需延长反应时间且伴随副反应，包括C-4–N-9键意外断裂及N-9位Boc基脱除；DDQ、CAN、Na/NH3等常规PMB脱除条件亦仅得非目标产物。为此采用酸性条件同时脱除PMB与Boc基：以TFA配茴香醚为阳离子捕获剂和溶剂可脱除15的全部Boc基但PMB基不受影响；单用TfOH亦不成功；而将第二步粗产物再用TFA处理可裂解PMB基，以50%产率得到12-epi-LWTX4，表明TfOH与TFA二者均为成功脱保护所必需；因此最优条件为单瓶中使用TfOH与TFA，以70%产率得到目标产物16。在既定PMB裂解条件下，由中间体2合成LWTX4：NaBH4还原2中酮从位阻较小的β面进行，以77%产率得到单一非对映异构体17，经与15的1H NMR谱比较确定C-12羟基构型；17经优化条件全局脱除Boc与PMB基，以90%产率得到LWTX4，此情形下不加茴香醚亦不影响反应效率；相同条件应用于由2合成dcSTX，以77%产率得到目标产物；合成STX时，于0 °C使用氯磺酰异氰酸酯（chlorosulfonyl isocyanate, CSI）对4进行氨甲酰化，1H NMR监测显示转化率3 h达最大后因氨基甲酸酯水解而下降，得到STX与dcSTX混合物，故在最大转化点以54%产率获得STX并含痕量dcSTX。在分析表征方面，尽管LWTX4的分析特征曾在1997年自蓝细菌Lyngbya wollei分离时采用Oshima开发的HPLC条件测定，但其在OMA 2011.02规定条件下的色谱特征仍属未知，因此对合成LWTX4进行分析以确定其在官方HPLC条件下的保留时间与相对荧光强度等分析行为。考虑LWTX4的电荷，分析采用GTX与STX/NEO系列所规定的流动相；在此条件下LWTX4于19.8 min以尖锐单峰洗脱，无展宽或拖尾，但其保留时间与STX（tR = 19.7 min）相近，仅凭OMA 2011.02方法难以可靠区分二者，需辅以HILIC–MS/MS分析；同时分析非天然差向异构体12-epi-LWTX4以评估C-12构型对保留时间的影响，其于21.5 min与LWTX4分开洗脱，提示C-12羟基的β取向降低了LWTX4骨架在给定色谱条件下的表观极性；值得注意的是，C-12带羟基的LWTX4与12-epi-LWTX4较带C-12偕二醇（酮的水合形式）的常规PSTs表现出更低的检测效率；与既往报道一致，经计入进样浓度比较LWTX4与dcSTX、STX的峰面积，STX与dcSTX的荧光检测灵敏度分别高出14倍与12倍；虽未研究荧光响应降低的原因，研究人员推测可能源于PCOX体系中氧化效率的差异，亦不能排除衍生化效率与氧化产物荧光量子产率的差异。对合成的STX与dcSTX进行分析以考察其作为参考物质开发的适用性：合成化合物的1H与13C NMR谱与既往报道数据一致，未见明显杂质信号；鉴于STX与dcSTX的CRMs目前由加拿大国家研究委员会（NRCC）供应，可通过HPLC与CRMs直接比较对合成毒素进行定性与定量分析；因此制备约1.0 mg合成dcSTX与STX小份样品，以DMF为内标采用定量1H NMR（quantitative 1H NMR, qNMR）估算各毒素量；依据NMR确定量，样品以1.0 mM HCl稀释配制5.63 μM dcSTX与3.60 μM STX溶液，各取10 μL工作液注入HPLC–PCOX–FLD系统；HPLC分析显示合成毒素保留时间与标准混合物中相应毒素良好吻合；合成dcSTX仅经Sep-Pak C18过滤纯化，其色谱轮廓仍与CRM相当；如前所述，合成STX含少量dcSTX及约14 min洗脱的未鉴定杂质，因NMR检测灵敏度低于HPLC–FLD而未在5的NMR谱中清晰显现；HPLC定量与qNMR值合理吻合：dcSTX工作液qNMR计算浓度为5.63 μM，HPLC分析指示6.60 μM，为qNMR值的117%；STX的HPLC定量浓度为3.50 μM，较qNMR值（3.60 μM）低约3%；dcSTX约17%的差异可能源于两种分析方法的差异及简单Sep-Pak C18过滤未去除的残留杂质，现有数据无法确定差异的确切原因；尽管适用于所有STX类似物的完全汇聚式合成方法尚待开发，且合成毒素用作定量参考标准前需进一步纯化与纯度评估，上述结果提示化学合成可作为从甲藻中分离制备PST参考物质的补充方法。在HILIC–MS/MS条件下，尽管AOAC 2021 HILIC–MS/MS方法已日益被用于PST分析，但因缺乏真实参考物质，LWTX4的色谱与质谱特征尚未得到充分研究；本研究制备的合成LWTX4首次实现了其在近期报道的HILIC–MS/MS条件下可检测性、保留行为及HRMS/MS碎裂模式的 analytical characterization；LWTX4于7.29 min洗脱，在选取的最优碰撞能量25 V下产生主要产物离子m/z 205.1204、182.0926、164.0822和110.0720；虽12-epi-LWTX4非天然存在PST，亦对合成12-epi-LWTX4进行分析以评估基于保留时间与15–30 V碰撞能量范围内MS/MS碎裂的差向异构体区分；然而LWTX4与12-epi-LWTX4在HILIC色谱图与MS/MS谱中表现出完全相同的分析特征，未见有意义的诊断特征可供区分。为评估LWTX4相对其他PSTs的色谱行为，制备含STX、dcSTX、NEO与LWTX4的混合标准溶液；在给定条件下STX、NEO、LWTX4与dcSTX的保留时间分别为7.23、7.27、7.29与7.33 min，与已报道PSTs保留时间一致，所有化合物均在约7.2–7.3 min的狭窄保留时间范围内洗脱；尽管LWTX4洗脱于与常规PSTs相似的保留时间区域，但可在提取离子色谱图中不受其他毒素干扰地轻易鉴定；这些结果将已报道HILIC–MS/MS方法的适用范围扩展至LWTX4，支持在不修改色谱条件的情况下将其作为附加分析物纳入常规PST分析。在方法学方面，本研究主要采用以下关键技术方法：以Looper的STX全合成路线为基础，经银(I)/碘介导环化、分子内SN2反应、NaBH4立体选择性还原及TfOH/TFA酸性脱保护等步骤化学合成LWTX4、dcSTX、STX与12-epi-LWTX4；采用AOAC OMA 2011.02 HPLC–PCOX–FLD方法（Agilent 1260 Infinity HPLC系统耦联Pinnacle PCX柱后衍生系统与荧光检测器）进行色谱分析；采用基于既往报道方法的AOAC 2021 HILIC–MS/MS分析（ExionLC系统与HILIC-Z色谱柱，150 mm × 2.1 mm, 2.7 μm）；采用以DMF为内标的定量1H NMR（Bruker 600 MHz谱仪）测定合成dcSTX与STX的量；高分辨质谱采用配备ESI源的Sciex X500R Q-TOF质谱仪。研究所用PST标准品为有证参考物质（CRMs，购自加拿大国家研究委员会NRCC），本研究报告的LWTX4等化合物均为化学合成样品，未涉及生物样本队列。研究结果方面：在LWTX4、dcSTX与STX的合成中，研究人员通过遵循Looper的STX全合成路线制备关键三环中间体2，经条件优化（CF3CO2Ag/DMF替代AgOAc使环状氨基甲酸酯12产率由30%提高至66%；确立TfOH与TFA单瓶联用为PMB与Boc基同时脱除的最优条件）成功以90%产率获得LWTX4，并以77%与54%产率分别获得dcSTX与STX，表明该合成路线可有效获取稀有PST衍生物。在AOAC OMA 2011.02（HPLC–PCOX-FLD）条件下对LWTX4的分析表征及对合成dcSTX与STX作为参考物质的评估中，研究人员通过HPLC–PCOX–FLD分析发现LWTX4于19.8 min洗脱且与STX（19.7 min）保留时间重叠、其FLD响应为STX的十四分之一，12-epi-LWTX4于21.5 min分开洗脱，表明OMA 2011.02方法单独无法区分LWTX4与STX；通过将合成STX与dcSTX经qNMR定量后与CRMs进行HPLC比较，发现其保留时间与相应CRMs良好吻合、HPLC定量与qNMR值合理吻合（dcSTX为qNMR值的117%，STX低约3%），表明化学合成有望成为制备PST参考物质的补充途径。在AOAC 2021 HILIC–MS/MS条件下对LWTX4的分析表征中，研究人员通过HILIC–MS/MS分析发现LWTX4于7.29 min洗脱，在25 V碰撞能量下产生m/z 205.1204、182.0926、164.0822和110.0720的主要产物离子，LWTX4与12-epi-LWTX4在该条件下色谱与MS/MS特征完全相同而无法区分，而在含STX、dcSTX、NEO与LWTX4的混合标准溶液中LWTX4可在提取离子色谱图中不受干扰地鉴定，表明HILIC–MS/MS可将LWTX4纳入常规PST分析而无需修改色谱条件。结论部分指出：本研究合成并分析了STX、dcSTX、LWTX4与12-epi-LWTX4的分析特征，在AOAC OMA 2011.02 HPLC–PCOX–FLD与AOAC 2021 HILIC–MS/MS条件下考察了LWTX4的色谱行为与HRMS/MS碎裂模式，提供了因缺乏真实或认证参考物质而此前无法获得的基础分析信息；HILIC–MS/MS能够在常规PSTs混合物中鉴定LWTX4，而HPLC–PCOX–FLD在所考察条件下无法将LWTX4与STX区分；反之，HPLC–PCOX–FLD可将LWTX4与12-epi-LWTX4区分，而二者在HILIC–MS/MS条件下表现出相似的保留行为与MS/MS碎裂模式；这些结果提示两种方法可为鉴定LWTX4提供互补信息；合成STX与dcSTX的HPLC保留时间与相应CRMs一致，提示全合成可作为从含毒素生物中直接分离制备PST参考物质的补充途径；本文报道的LWTX4分析特征可作为在无有证参考物质时调查其在含毒素生物中可能存在的参考数据；上述发现系在AOAC条件下获得，未来用于生物样品定量应用尚需进一步方法验证，包括评估潜在基质干扰与提取回收率以及测定LOD与LOQ。讨论部分进一步指出，LWTX4与12-epi-LWTX4较带C-12偕二醇的常规PSTs检测效率更低，其荧光响应降低的原因虽未阐明，研究人员推测可能源于PCOX体系氧化效率差异，亦不能排除衍生化效率与荧光量子产率差异；合成dcSTX约17%的定量差异可能源于两种分析方法的差异及残留杂质，确切原因尚无法确定；适用于所有STX类似物的完全汇聚式合成方法仍待开发，合成毒素用作定量参考标准前需进一步纯化与纯度评估。