《Biology》：Isolation and Preliminary Marker-Based Characterization of Epithelial-Enriched Bovine Gastrointestinal Cell Cultures from Four Gastrointestinal Segments
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牛胃肠道（GI）上皮在营养吸收、屏障调控及宿主–微生物互作中发挥核心作用，然而针对牛胃肠道组织的原代细胞体外系统仍然有限。由于组织复杂性、微生物污染风险以及培养相关的表型改变，原代胃肠道上皮细胞的分离与维持具有挑战性。本研究旨在分离、培养并对来源于四个胃肠道段
牛胃肠道（GI）上皮在营养吸收、屏障调控及宿主–微生物互作中发挥核心作用，然而针对牛胃肠道组织的原代细胞体外系统仍然有限。由于组织复杂性、微生物污染风险以及培养相关的表型改变，原代胃肠道上皮细胞的分离与维持具有挑战性。本研究旨在分离、培养并对来源于四个胃肠道段（瘤胃、空肠、回肠和结肠）的上皮富集原代牛胃肠道细胞培养物进行基于标志物的初步表征。胃肠道组织采集自三头4月龄荷斯坦犊牛。腔面黏膜组织经机械分离、酶解解离并进行体外培养。记录了包括细胞分离后活力在内的初始培养性能结果。采用qPCR在三个阶段——全组织、细胞分离后和细胞培养后——评估上皮细胞相关基因CDH1、CLDN4、TJP1、KRT8和KRT18的表达。通过免疫荧光评估合并培养细胞中的角蛋白8（KRT8）染色，并对可用图像中KRT8阳性细胞进行描述性定量。考虑犊牛内重复测量的线性混合效应分析显示，经错误发现率校正后，五个转录本均存在实验阶段效应。仅TJP1保留了Segment总体效应及Segment × Stage交互效应，表明该标志物的阶段相关表达模式在各胃肠道区域间并不一致。KRT8免疫荧光显示四个胃肠道段来源的培养物中均存在KRT8阳性细胞。在八个定量视野中，325个DAPI界定细胞中有244个（75.1%）被归类为KRT8阳性。这些发现支持在所测试条件下分离和培养上皮富集的原代牛胃肠道培养物。尽管仍需额外的标准化培养性能评估、上皮与非上皮细胞群的扩展表征、传代稳定性分析以及功能性屏障检测，本工作为上皮富集原代牛胃肠道细胞培养提供了初步的方法学框架，并支持其未来应用于上皮生物学、宿主–微生物互作及牛胃肠道分子响应研究。
研究背景与问题：牛胃肠道（GI）在营养物质利用、黏膜防御和代谢稳态维持中具有重要作用，其上皮作为腔面环境与深层组织间的选择性界面，通过紧密连接相关蛋白、黏附分子和细胞骨架结构的协同互作维持屏障功能。体外细胞培养模型常用于研究肠道健康与疾病机制，但多数研究依赖永生化上皮细胞系，而永生化及长期培养可改变细胞表型、基因表达模式和生物学响应，限制其生理相关性。原代上皮细胞可能保留更多原始上皮的形态、分子和功能特征，但牛胃肠道多区段来源、并在同一实验框架内比较的原代上皮富集培养物仍缺乏系统报道。牛各胃肠道段在结构与功能上差异显著：瘤胃由复层鳞状角化上皮衬覆，参与短链脂肪酸吸收、转运、代谢及屏障保护；空肠、回肠和结肠则为单层上皮区室，参与营养吸收、分泌、免疫互作和屏障调控。因此，建立支持多区段原代上皮细胞分离培养的方法，有助于研究牛区域特异性上皮生物学。本研究目的即分离培养瘤胃、空肠、回肠和结肠来源的上皮富集原代牛胃肠道细胞群，并利用上皮细胞相关基因表达和角蛋白8免疫荧光进行初步标志物表征。
研究开展与结论：研究人员从三头非病原攻击的荷斯坦对照犊牛采集四个胃肠道段组织，经腔面黏膜层机械分离、胶原酶消化、过滤、洗涤后接种培养，并在全组织、细胞分离后和细胞培养后（第3代）三个阶段进行qPCR检测，同时对按区段合并的第3代细胞进行KRT8免疫荧光及描述性定量。结果显示，所有样本均回收获得活细胞，各区段细胞均可在48 h内贴壁、传代前达到约80%汇合并扩增至第3代，培养期间未见明显微生物污染；五个上皮相关转录本在各区段和阶段均可检出，实验阶段是五个转录本最一致的变异来源，仅TJP1保留区段效应及区段×阶段交互效应；KRT8免疫荧光在四个区段来源培养物中均呈阳性，八个视野中75.1%的DAPI界定细胞为KRT8阳性。研究结论认为，所选标志物在培养后仍可检出，支持培养物的上皮富集，但不等同于上皮纯度或功能性屏障活性的确认；该工作为生成多区段上皮富集原代牛胃肠道细胞培养物提供了初步方法学框架，并为其在上皮生物学、宿主–微生物互作及分子响应研究中的应用提供支持。
关键技术方法：研究以三头4月龄荷斯坦对照犊牛（来源于美国农业部农业研究局家畜问题研究单位的父项目终末研究，n = 3，犊牛为生物学重复）为样本来源，采集瘤胃背囊、空肠近中段、回肠（回盲 junction 近端约20 cm）和螺旋结肠各5 cm组织。关键技术包括：腔面黏膜层的肉眼识别与机械分离以富集上皮；I型胶原酶消化（空肠、回肠、结肠1 h，瘤胃90 min）结合400 μm与100 μm分级过滤；台盼蓝染色血细胞计数评估细胞产量与分离后活力；原代细胞体外培养并连续传代至第3代；三个阶段样本的总RNA提取与TaqMan法qPCR检测五个上皮相关基因，以B2M、GAPDH、RPS9为内参基因；第3代细胞KRT8免疫荧光（联合鬼笔环肽与DAPI染色）及基于Gen5与ImageJ Cell Counter的描述性定量；统计分析采用线性混合效应模型（ΔCq ~ Segment × Stage + (1|Calf)），并进行Benjamini–Hochberg错误发现率校正与Tukey多重比较。
研究结果：
3.1 E-Cadherin：CDH1在各区段和阶段均可检出；混合效应分析显示阶段总体效应显著（FDR校正p = 1.12 × 10?5），区段效应及交互效应不显著。全组织表达高于细胞分离后（Tukey校正p = 0.0011）和培养后（p < 0.0001），分离后与培养后差异不显著。研究人员认为，分离与培养过程中天然组织结构及细胞–细胞互作的破坏，以及细胞对体外条件的适应，可能解释CDH1的下降；但转录本水平结果不能作为黏附连接形成或功能改变的直接证据。
3.2 Claudin 4：CLDN4在各区段和阶段均可检出，部分培养后样本存在靶标特异性未检出；阶段效应显著（FDR校正p = 2.64 × 10?4），区段效应及交互效应不显著。全组织表达高于分离后（p = 0.0388）和培养后（p = 0.0002），分离后亦高于培养后（p = 0.0182）。描述性上全组织瘤胃表达最高，但区段效应经校正后不显著，故不应解读为确定性区域差异。研究人员指出，该结果仅支持紧密连接相关基因表达的保留与调制，不能确认功能性上皮屏障完整性。
3.3 Keratin 18：KRT18在各区段和阶段均可检出；阶段效应显著（FDR校正p = 6.00 × 10?5），区段效应及交互效应不显著。培养后表达低于全组织（p < 0.0001）和分离后（p = 0.0033），全组织与分离后差异不显著。描述性上全组织肠段表达倾向高于瘤胃，但区段效应不显著。研究人员认为培养后下降可能与天然组织构型丧失、特定细胞亚群选择或扩增、转录适应有关，结果仅提示上皮相关细胞骨架基因表达的持续存在。
3.4 Keratin 8：KRT8在各区段和阶段均可检出；阶段效应显著（FDR校正p = 4.92 × 10?6），区段效应及交互效应不显著。培养后表达低于全组织（p < 0.0001）和分离后（p = 0.0004），全组织与分离后差异不显著。描述性上全组织瘤胃表达最低、肠段较高，但区段效应不显著。研究人员指出，培养后KRT8仍可检出，支持上皮相关细胞骨架基因表达的保留，但未确立原始组织表型的维持。
3.5 Tight Junction Protein 1：TJP1在各区段和阶段均可检出；阶段效应（FDR校正p = 1.47 × 10?7）、区段效应（p = 1.60 × 10?4）及区段×阶段交互效应（p = 0.00125）均显著，故进一步在各区段内检验阶段效应、在各阶段内检验区段效应。瘤胃各阶段间无差异；空肠培养后高于全组织（p = 0.0015）和分离后（p < 0.0001）；回肠分离后低于全组织（p < 0.0001）、培养后高于分离后（p < 0.0001）；结肠分离后低于全组织（p = 0.0117）和培养后（p = 0.0080）；回肠和结肠全组织与培养后差异不显著。区段差异在分离后阶段最明显：瘤胃高于空肠（p = 0.0121）、回肠（p < 0.0001）和结肠（p = 0.0036），空肠和结肠亦高于回肠（分别为p = 0.0010和p = 0.0033）；全组织阶段仅瘤胃–空肠比较显著（p = 0.0171），培养后阶段仅空肠–结肠比较显著（p = 0.0444）。研究人员认为，显著交互效应表明分离与培养过程中TJP1表达变化在胃肠道区域间并不一致，但因仅评估转录本丰度，不应解读为功能性紧密连接的恢复或稳定。
3.6 免疫荧光评估与KRT8染色描述性定量：KRT8阳性染色见于牛瘤胃上皮细胞（BREC1）对照及四个区段合并的第3代上皮富集原代培养物，无一级抗体对照背景信号极低；鬼笔环肽显示肌动蛋白细胞骨架组织，DAPI确认细胞核完整。八个可用视野（每区段两个）中，325个DAPI界定细胞中244个为KRT8阳性（75.1%），四个区段均存在KRT8阳性细胞。染色呈异质性，部分细胞强度不一，并可见伸长或纺锤样细胞形态。研究人员指出，qPCR显示培养后KRT8转录本降低而免疫荧光仍可检出KRT8蛋白，二者提供互补而非直接可比的生物学信息，可能受转录后调控、翻译和蛋白周转影响；合并结果支持培养细胞群的上皮富集，但未确立完全上皮纯度、特化上皮分化或功能性屏障活性。
3.7 局限性：研究仅使用三头荷斯坦犊牛组织，供体数量有限，限制推断精度、统计效能及跨牛群的推广；组织来自父项目终末终点，供体虽未接受病原攻击，但曾经历瘤胃酸中毒模型的日粮方案，且采集至处理的确切时间未记录；分离依赖肉眼识别腔面黏膜层与机械分离，未采用互补上皮与非上皮谱系标志物、流式细胞术、阴性标志物分析或组织学评估确定细胞组成，KRT8阴性细胞无法归属特定非上皮谱系；培养性能参数如标准化达80%汇合时间、生长速率、倍增时间、传代后活力及传代稳定性未系统评估，也未正式比较不同消化条件；分子表征基于选定转录本和KRT8免疫荧光（含对存档图像的回顾性描述性定量），抗体未进行独立验证；原代qPCR样本未常规设置技术重复，未用标准曲线独立确定扩增效率，统计结果应视为探索性；未开展跨上皮电阻、通透性调控、紧密连接蛋白定位、微生物响应、炎症信号及特化吸收分泌功能等功能性检测。
讨论与结论：讨论部分围绕形态学、上皮相关基因表达和KRT8免疫荧光三方面证据，指出综合结果支持培养物的上皮富集，但细胞纯度与上皮屏障功能仍需阴性标志物和功能性检测加以评估；对照细胞群仅作描述性参照，不能作为上皮特异性或培养纯度的确定性证据。研究结论译为：本研究描述了来源于瘤胃、空肠、回肠和结肠的上皮富集原代牛胃肠道培养物的分离、培养及基于标志物的初步表征。五个上皮相关标志物（CDH1、CLDN4、TJP1、KRT8和KRT18）在全组织、细胞分离后和细胞培养后三个阶段的检出，结合KRT8免疫荧光及培养细胞中KRT8阳性细胞的描述性定量，提供了支持所测试条件下上皮相关标志物表达的互补证据。实验阶段与全部五个评估转录本的表达相关，而区段总体效应及区段×阶段交互效应仅见于TJP1。这些发现表明，上皮相关转录谱可在细胞分离及后续体外培养过程中发生变化，其变化幅度与模式可因标志物而异，对TJP1而言亦因胃肠道区域而异。尽管所选标志物在培养后仍可检出，这些发现应解读为上皮富集的证据，而非完全上皮纯度或功能性上皮屏障活性的确认。后续需纳入更多动物、包括达汇合时间、传代后活力和传代稳定性指标在内的培养性能评估、扩展的蛋白水平表征、潜在非上皮细胞群评估以及功能性检测，以进一步评估和验证该系统用于牛胃肠道上皮生物学、营养、宿主–微生物互作及疾病相关响应研究。尽管如此，该方案为从多个胃肠道段生成富集牛胃肠道上皮细胞的原代培养物提供了初步方法学框架。
