《Non-Coding RNA》：MicroRNAs in Edible Plant-Derived Extracellular Vesicles: Stability, Oral Delivery, and Cross-Kingdom Biological Effects
编辑推荐：
摘要：可食用植物来源的细胞外囊泡（extracellular vesicles, EVs）及类EV纳米颗粒作为微小RNA（microRNAs, miRNAs）穿越胃肠道的潜在载体引起了广泛关注。本综述对其术语命名、分离与表征方法、RNA组成、胃肠道稳定性、细胞
摘要：可食用植物来源的细胞外囊泡（extracellular vesicles, EVs）及类EV纳米颗粒作为微小RNA（microRNAs, miRNAs）穿越胃肠道的潜在载体引起了广泛关注。本综述对其术语命名、分离与表征方法、RNA组成、胃肠道稳定性、细胞摄取、生物分布、生物学效应及潜在应用进行了批判性评述。现有研究表明，植物来源的颗粒制备物可与多种RNA结合，并在局部与肠上皮细胞、免疫细胞、干/祖细胞及肠道微生物发生相互作用。然而，从匀浆组织或果汁中回收的颗粒可能包含细胞内囊泡、膜碎片及非囊泡复合体；因此，在颗粒富集组分中检测到miRNA并不能证明其被囊泡包裹或实现了功能性递送。关于膳食跨界调控的证据仍存在争议。尽管植物细胞外小RNA能够调控真菌病原体，且生姜来源颗粒相关的小RNA已被报道与细菌及宿主反应有关，但在正常膳食摄入后，具有生理效应的植物miRNA能否实现可重复的系统性递送尚未得到证实。脂质、蛋白质、代谢物及其他RNA也可能对报告效应有所贡献。未来研究应区分天然分泌的EV、类EV纳米颗粒及工程化纳米载体，并结合严格的颗粒表征、RNA定位、绝对定量、生理相关剂量以及功能缺失与回补实验。这些标准对于界定生物学相关性及治疗潜力至关重要。
论文主体内容总结如下：
2. 可食用植物来源的EVs与类EV纳米颗粒
2.1 定义与命名法
EVs通常定义为由细胞自然释放、具有脂质双分子层且不能独立复制的颗粒。传统上，假定起源于多囊泡体的囊泡被称为“外泌体”（exosomes），而直接从质膜出芽的则称为“微囊泡”（microvesicles）。但由于难以通过尺寸、形态或常用分子标志确定其生物发生途径，国际细胞外囊泡学会（International Society for Extracellular Vesicles, ISEV）推荐在未实验证明特定生物发生机制时，统一使用“细胞外囊泡”（extracellular vesicle, EV）这一包容性术语。植物来源颗粒的命名更为混杂，包括植物细胞外囊泡、植物来源纳米囊泡、植物来源外泌体样纳米颗粒等。这些术语所指的颗粒在生物学起源、组成和制备方法上可能存在显著差异。本综述中，“植物EVs”指经实验证明由活植物细胞释放至胞外区室（如质外体）的膜结合颗粒；“类EV纳米颗粒”（EV-like nanoparticles）则用于指代从破碎组织或加工果汁中分离、缺乏细胞外释放直接证据的颗粒。
2.2 可食用植物来源EVs与类EV纳米颗粒的来源
EVs或类EV纳米颗粒已从多种可食用植物中分离，包括葡萄、西柚、柠檬、橙子、苹果、生姜、胡萝卜、西兰花、番茄及茶等。但颗粒产量、尺寸、组成和生物活性可能因植物物种、品种、组织、成熟度、栽培条件、储存方式及分离纯化程序而异。例如，从质外体液分离的囊泡与机械破碎根茎或果实获得的颗粒可能代表不同的群体；烹饪和模拟消化也会改变西兰花来源EV组分的丰度、理化性质和生物活性。
2.3 植物体内的生物发生与生物学作用
植物释放膜结合囊泡的证据主要来自模式植物及植物-病原互作研究。拟南芥（Arabidopsis thaliana）叶片的质外体液中分离的EV富含与生物和非生物胁迫响应相关的蛋白。可能的生物发生途径之一涉及多囊泡体与质膜融合，释放腔内小泡至质外体。四跨膜蛋白8（TETRASPANIN8, TET8）阳性囊泡被认为与此途径相关，并参与植物小RNA向真菌病原体的转运。此外，植物EV还含有防御相关蛋白、脂质和代谢物。然而，目前大部分知识源于模式植物，尚不明确相同的生物发生途径和分子标志是否保守存在于可食用水果、根茎及其他食物植物中。
2.4 区分分泌型EVs与植物组织来源纳米颗粒
从破碎组织或果汁中分离的颗粒可能包含因组织匀浆而释放的质膜、内体、液泡、内质网、高尔基体、叶绿体和线粒体膜片段，以及脂滴、脂蛋白样复合体等细胞内成分。这些物质可能在离心、过滤或沉淀过程中与真正的EV共分离，形成异质性混合物。因此，准确描述样品来源、处理历史及分离纯化程序，对于评估研究结果的可重复性和转化潜力至关重要。
3. 可食用植物来源EVs的分离与表征
3.1 植物材料的准备
起始材料的选择和准备影响回收颗粒的产量、理化性质和分子组成。完整叶片可通过真空渗入法收集质外体洗涤液，最大限度地减少组织损伤。而可食用植物的研究常使用破碎的水果、根茎、蔬菜、鲜榨果汁或商业果汁作为起始材料，这可能导致细胞内组分污染。此外，植物成熟度、烹饪和模拟消化均会影响颗粒特性。
3.2 分离与纯化方法
差速离心是最常用的初始分离方法。聚合物基沉淀试剂虽简便，但可能共沉淀可溶性蛋白、多糖、脂蛋白复合体和RNA-蛋白复合体，不应视为明确的EV纯化程序。若使用沉淀法，建议辅以尺寸排阻色谱或密度梯度离心等补充纯化步骤。
3.3 物理化学与形态学表征
纳米颗粒追踪分析（nanoparticle tracking analysis, NTA）广泛用于估算颗粒浓度和水动力学粒径分布，但其光学检测灵敏度取决于颗粒尺寸和折射率对比度。动态光散射（dynamic light scattering, DLS）可用于评估整体分散性和胶体稳定性，但对大颗粒敏感。透射电子显微镜（transmission electron microscopy, TEM）常用于观察形态，但杯状或碟形形态可能为脱水伪象。冷冻电镜（cryo-electron microscopy）和原子力显微镜（atomic force microscopy, AFM）可提供更接近天然状态的结构信息。已报道的可食用植物来源EV和类EV纳米颗粒的直径通常在50-500 nm范围内。
3.4 纯度与非囊泡污染物的评估
目前尚无适用于所有植物物种和组织的通用阳性与阴性标志物组合。拟南芥中验证的标志物不能直接应用于果实、根茎或加工食品来源的颗粒。MISEV2023指出，不应将制备物的分子组成或生物活性归因于EV而不充分考虑非囊泡胞外颗粒和可溶性因子的贡献。
3.5 验证EV相关及腔内RNA
在EV富集组分中检测到RNA并不证明RNA位于囊泡腔内。RNA可能附着于外膜表面、与RNA结合蛋白或脂质结合，或存在于共分离的非囊泡核糖核蛋白复合体中。建立候选miRNA的囊泡内定位需要比较单独RNase处理与去垢剂破坏膜后的RNase处理结果。
4. 可食用植物来源EVs中的微小RNAs
4.1 与可食用植物来源EVs相关的RNA种类
与颗粒组分相关的RNA包括总RNA、小RNA及多种miRNA，其组成因植物种类、组织来源和分离分析方法而异。除常规20-24核苷酸小RNA外，某些植物EV中还富集了10-17核苷酸的“极短RNA”。必须区分“EV富集组分中检测到的RNA”与“EV包裹的RNA”。
4.2 微小RNA谱分析与定量方法
小RNA测序是主要研究方法，但存在RNA提取、接头连接效率及扩增偏差等问题。植物miRNA的鉴定依赖于参考基因组和数据库的完整性及注释标准。低丰度外来RNA样信号需排除试剂污染、测序批次效应和序列错误分类。逆转录定量聚合酶链式反应（RT-qPCR）和数字PCR（digital PCR）可用于验证和定量，但各自存在局限性。
4.3 不同可食用植物中鉴定的微小RNAs
水果和果汁来源颗粒中检测到了已知植物miRNA序列，但生物学效应常主要由脂质介导而非miRNA。生姜来源纳米颗粒中发现了约125种miRNA，其抗炎和肠道效应可能源于多种组分。有研究提出生姜颗粒相关mdo-miR7267-3p可被特定肠道细菌摄取，影响色氨酸代谢并激活宿主芳烃受体-白细胞介素-22通路，减轻小鼠结肠炎。西兰花、胡萝卜等蔬菜来源颗粒也显示出生物活性，但RNA货物表征相对较少。水稻来源miR168a曾报道可调节小鼠低密度脂蛋白受体适配蛋白1（LDLRAP1），但后续独立研究未能重现。
4.4 微小RNA选择性装载进入植物来源EVs
在拟南芥中，RNA结合蛋白如ARGONAUTE1（AGO1）、RNA解旋酶RH11和RH37及膜联蛋白与EV相关小RNA的选择性装载和稳定有关。然而，直接证明可食用植物EV中选择性装载的证据仍然有限。
4.5 植物来源EV微小RNA谱的可靠性与可重复性
在EV组分中检测或相对富集某种植物miRNA应被视为开发机制假说的起点，而非跨界效应的证据。
5. 口服摄入后的稳定性与胃肠道命运
5.1 食品加工与储存的影响
榨汁、匀浆、巴氏杀菌、冷冻等加工过程可能改变颗粒浓度、尺寸分布、膜完整性及RNA含量。从新鲜完整组织或质外体液分离的EV与从破碎组织或加工食品回收的类EV纳米颗粒不可等同。
5.2 胃肠道条件下的稳定性
口服摄入的颗粒依次暴露于口腔、胃和小肠环境。柑橘来源EV组分在体外模拟消化后仍保留一定理化特性并能被Caco-2细胞摄取，但这不证明消化前后为同一颗粒群体且内源性miRNA得以保留。“胃肠道稳定性”一词应仅限于直接测量膜完整性、颗粒回收率和货物保留的研究。
5.3 囊泡膜对miRNAs的保护
现有证据支持某些植物颗粒相关RNA在消化条件下可能受到相对保护，但不能确立天然完整囊泡在整个消化过程中保留功能性miRNA的一般原则。
5.4 消化过程中的EV破裂、货物释放与重组
pH值、消化酶和胆汁组分可能影响颗粒聚集、表面电荷、膜完整性和货物保留。餐后功能分析应尽可能比较完整颗粒、膜破坏颗粒、RNA耗竭颗粒及非囊泡组分。
5.5 胃肠道消化的实验模型
静态体外消化模型（如INFOGEST 2.0）便于控制条件，但不能完全再现胃排空、蠕动、黏液更新和肠道菌群活性。当前研究支持至少部分植物衍生颗粒或其组分能够持续存在并与胃肠道环境相互作用，但关于天然完整EV通过整个消化道并递送功能性miRNA的直接证据仍然有限。
6. 肠道摄取与生物分布
6.1 与肠道黏液和上皮屏障的相互作用
颗粒需穿过黏弹性黏液层，其运动受尺寸、表面电荷、疏水性和聚集状态影响。肠道上皮包括吸收细胞、杯状细胞、M细胞等多种细胞类型，颗粒可能通过不同途径进入固有层。
6.2 肠上皮细胞的摄取
体外研究表明肠上皮细胞能与可食用植物来源类EV纳米颗粒相互作用并内吞颗粒相关物质。多种内吞机制可能参与，包括网格蛋白依赖性内吞、小窝蛋白/脂筏相关摄取、巨胞饮和吞噬。然而，细胞内荧光的检测不意味着完整颗粒被内化或miRNA被递送至细胞质。
6.3 肠道免疫细胞与肠道微生物群的摄取
姜来源纳米颗粒在小鼠结肠炎模型中优先分布于肠上皮细胞和巨噬细胞。肠道菌群中，姜来源颗粒优先与乳酸杆菌科（Lactobacillaceae）关联，颗粒相关mdo-miR7267-3p被提出可调控细菌基因ycnE。
6.4 跨上皮转运与系统性分布
大多数体内研究更支持颗粒在肠道内的局部持久存在及其与肠道细胞的相互作用，而非广泛的系统性分布。口服后观察到远隔器官的生理效应不一定意味着完整颗粒穿过肠上皮并保持原结构到达靶组织。
6.5 摄取与生物分布的证据等级
当前研究应被视为主要支持胃肠道内的局部颗粒-细胞或颗粒-微生物相互作用。
7. 可食用植物来源EVs及其miRNA货物的生物学效应
7.1 肠道稳态与上皮屏障功能的维持
葡萄和姜来源纳米颗粒可促进肠道干细胞增殖和组织修复，但效应不能单独归因于RNA货物。柑橘来源EV组分可改变炎症、氧化应激和紧密连接相关基因的表达。
7.2 抗炎与免疫调节效应
口服姜来源纳米颗粒可减轻小鼠结肠炎和结肠炎相关肿瘤形成，降低促炎细胞因子并增加抗炎细胞因子。但单个miRNA对于完整颗粒组分抗炎活性的必要性和充分性尚未确立。
7.3 肠道微生物群的调节
姜来源颗粒相关mdo-miR7267-3p与细菌ycnE的相互作用提供了候选小RNA-微生物-宿主机制，但尚不清楚该机制能否推广至其他植物小RNA和细菌物种，或在正常膳食摄入水平下发生。
7.4 对癌症相关过程的影响
姜来源纳米颗粒口服给药减少了结肠炎相关癌变模型中的肿瘤数量和负担，但效应可能源于炎症控制和屏障功能改善，而非对转化细胞的直接毒性。
7.5 区分天然货物与工程化递送
人工装载候选miRNA的合成脂质仿生纳米颗粒的效应不能直接外推至正常膳食暴露下的天然货物。目前最强有力的证据支持可食用植物来源颗粒制剂作为多组分系统具有生物活性，而特定miRNA在天然颗粒中既必要又充分的证据仍然有限。
8. 植物miRNAs的跨界基因调控
8.1 概念与跨界基因调控的要求
跨界RNA调控是指来自一种生物的RNA转移到属于不同生物界的受体生物，并改变其基因表达或生理功能。植物-真菌病原体互作证明了植物EV介导跨界小RNA运输的生物学可行性，但这些发现不能直接外推至膳食暴露。
8.2 植物-病原互作中EV介导的跨界RNA转移
拟南芥EV组分中富集的小RNA可转移至灰葡萄孢菌（Botrytis cinerea）并抑制其致病基因。然而，一项近期研究发现胞外RNA不与TET8阳性EV共分馏，而是与致密AGO组分共分馏，提示EV可能并非跨界RNA干扰的主要载体。
8.3 支持膳食植物miRNA摄取与功能的证据
水稻miR168a的早期发现引发了广泛关注，但后续独立研究未能重现可比的口服生物利用度。osa-miR164d与TAB1相互作用的证据来自工程化递送系统。总体而言，很少有研究能在口服生理相关量天然可食用植物EV后，完整证明从囊泡内miRNA保护到靶基因序列特异性调控及表型产生的全过程。
8.4 质疑口服生物利用度的证据
多项独立研究未能证实膳食植物miRNA的大量口服摄取。Snow等人发现膳食miRNA在人类、小鼠和蜜蜂中几乎检测不到，或浓度不足以产生生物学效应。Dickinson等人同样未能确认水稻miR168a的可重复口服生物利用度及其对LDLRAP1表达的影响。研究间的差异可能反映植物物种、食物基质、miRNA浓度、加工方法和分析平台的不同。
