真姬菇（Hypsizygus marmoreus）菌丝体—原基—菇蕾—子实体发育阶段转录组与蛋白质组中MAPK信号通路及Hyd基因的时空表达特征

《Horticulturae》：MAPK Signaling Pathway and Hyd Genes’ Spatiotemporal Expression Profiles in the Hypsizygus marmoreus Mycelium–Primordium–Button–Fruiting Body Transcriptome and Proteome

真姬菇（Hypsizygus marmoreus (Peck) H.E. Bigelow）是一种兼具美味与营养的优质食用菌。本研究对真姬菇菌丝体、原基、菇蕾和子实体发育阶段进行了高通量转录组与LC-MS/MS蛋白质组分析。结果显示，丝裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）信号通路的基因表达在原基—菇蕾—子实体阶段的上调与下调最为显著。细胞壁胁迫亚通路基因表达相对活跃，共有3个通路节点基因呈现上调表达。在原基和子实体发育阶段，疏水蛋白-1（Hydrophobin-1）、疏水蛋白-3（Hydrophobin-3）、疏水蛋白-4（Hydrophobin-4）、疏水蛋白-5（Hydrophobin-5）和疏水蛋白-6（Hydrophobin-6）的表达水平最高，而疏水蛋白-2（Hydrophobin-2）在菌丝体发育阶段表达水平最高。真姬菇MAPK信号通路中通路节点基因的表达与原基—菇蕾—子实体发育阶段疏水蛋白基因家族成员表达峰值的时间高度同步。这些结果表明，疏水蛋白基因家族成员在原基—菇蕾—子实体发育阶段的表达最高。疏水蛋白基因家族成员的表达模式在原基—菇蕾—子实体发育阶段出现峰值，且其表达与MAPK信号通路中通路节点基因活跃表达时期密切相关。本研究结果将为阐明真姬菇MAPK通路基因表达机制提供坚实的理论基础。

研究背景：疏水蛋白（Hydrophobin，Hyd）基因是编码真菌特有双亲性表面活性蛋白的基因家族，在食用菌的孢子传播、气生菌丝形成、原基分化、宿主互作及环境适应中具有核心作用。疏水蛋白分子量较小（约7–15 kDa），含8个保守半胱氨酸残基形成4对二硫键，赋予其独特双亲性结构；依半胱氨酸间隔模式可分为I类和II类，I类可形成杆状纳米结构，II类可形成非纤维状薄膜。Hyd基因表达主要见于子囊菌门和担子菌门，且在不同营养方式真菌间差异显著，致病真菌所含Hyd基因多于腐生真菌；敲除或干扰Hyd基因会降低孢子传播并影响菌丝与子实体发育，导致气生菌丝稀疏、原基和子实体减少，故Hyd基因家族是食用菌分子育种的重要靶标。已有研究表明，调控Hyd基因表达的上游KEGG通路包括MAPK信号通路（ko04011）和cAMP/PKA信号通路（ko04024），但相关研究多偏系统性。食用菌MAPK通路通过三级级联磷酸化传递胞外与表面信号，依次作用于MAPKKK（Ste11）、MAPKK（Ste7）和MAPK（Pmk1/Fus3/Kss1）等通路节点，活化后转位至细胞核磷酸化Ste12-Tec1转录因子复合体，该复合体直接结合Hyd基因启动子顺式作用元件，调控Hyd基因转录，进而控制气生菌丝形成、分生孢子产生和子实体发育。真姬菇是优质食用菌，随着工厂化栽培技术成熟与产业链完善，已成为中国食用菌产业发展最快的品种之一，市场前景良好。然而，尽管推测Hyd基因表达可能对真姬菇生产中子实体产量具有决定性影响，但系统性研究极为有限。因此，解析真姬菇菌丝体—原基—菇蕾—子实体发育阶段MAPK信号通路基因表达机制及Hyd基因时空表达，可为高产真姬菇菌株选育提供理论依据。

研究人员开展了什么研究及结论与意义：研究人员采用高通量转录组、LC-MS/MS蛋白质组和qRT-PCR技术，系统研究了真姬菇菌丝体—原基—菇蕾—子实体发育阶段的基因组与蛋白质组特征、MAPK信号通路基因表达机制以及Hyd基因时空表达谱。结果表明，Hyd基因在原基—菇蕾—子实体发育阶段显著上调表达；MAPK信号通路通路基因表达的上调与下调在原基—菇蕾—子实体阶段最为显著，细胞壁胁迫和高渗亚通路中上调基因最多，共3个通路节点基因上调。qRT-PCR时空表达结果显示，Hyd1、Hyd3、Hyd4、Hyd5和Hyd6在原基和子实体发育阶段表达最高，Hyd2在菌丝体发育阶段表达最高。真姬菇MAPK信号通路在原基—菇蕾—子实体发育阶段活跃表达的时间与Hyd基因在该阶段的表达峰值时间相似。研究结果将为阐明真姬菇MAPK通路基因表达机制及Hyd基因时空表达提供坚实理论基础，并为高产真姬菇菌株选育提供科学依据。

关键技术方法：研究以实验室保藏并经大规模栽培使用的真姬菇HX-1菌株为材料，菌袋经90 d恒温黑暗培养后，于菌丝体、原基、菇蕾和子实体阶段取样，每份约1.5 cm³、重复5次，?80 °C保存。采用TRIzol法提取总RNA，构建cDNA文库后于NovaSeq 6000平台进行高通量转录组测序，并以HISAT2、Stringtie v3.0.3、DESeq2、GSEA等软件进行比对与差异分析；采用iST样品制备试剂盒酶解、LC-MS/MS（Orbitrap Astral）进行DIA蛋白质组定量分析；并以PrimeScript RT试剂盒合成cDNA，针对Hyd1—Hyd6设计引物，进行PCR克隆与qRT-PCR（以Actin和18SrRNA为双内参、2^?ΔΔCT法）验证时空表达；同时利用Swiss-Model、PyMol和ESPript 3.2进行蛋白三维结构建模与多序列比对。转录组与蛋白质组原始数据分别存于NCBI SRA（BioProject PRJNA1496449）和ProteomeXchange（PXD081834）。

研究结果：

3.1 真姬菇菌丝体—原基—菇蕾—子实体发育阶段的转录组分析与鉴定：通过对4个发育阶段20个RNA-seq文库测序，共获得859,584,696条原始reads，过滤后得到855,026,058条高质量clean reads，比对参考基因组共获得17,375个转录本，含748个新基因。主成分分析（PCA）显示PC1（66.70%）与PC2（18.80%）合计解释85.50%的样本间基因表达差异，菌丝体位于PC1最左端、子实体位于最右端，表明随发育进程基因表达谱呈持续的阶段特异性变化。以log2FC > 1、FDR < 0.05为标准，6组比较共鉴定2981个差异表达基因（DEGs），其中上调1215个、下调1766个；原基与菇蕾比较差异基因最少（上调308个、下调250个）。转录本与蛋白丰度变化九象限分析显示，子实体vs菌丝体正相关性最强（0.3878，p ≈ 0），菇蕾vs子实体次之（0.3764，p ≈ 0），表明基因转录与蛋白丰度变化存在中等程度的一致性与协同性；GO富集分析表明Hyd基因分子功能主要富集于细胞壁与真菌型细胞壁的结构组分。

3.2 Hyd基因表达差异分析：基于细胞壁和真菌型细胞壁结构组分GOterms的基因表达聚类热图分析表明，菌丝体向菇蕾转变过程中多数相关基因上调表达，而成熟子实体阶段多数基因下调、仅少数上调；Hyd基因家族中Hyd3在菌丝体—原基—菇蕾阶段高表达，Hyd4在子实体阶段高表达。

3.3 MAPK信号通路基因表达分析：转录组KEGG通路分析显示，菌丝体—原基阶段，信息素亚通路（节点Gpa1、Ste3）和饥饿亚通路（节点Sho1、Kss1）共有6个基因呈不同程度上下调，其中核心MAPK激酶Kss1 RDB29560.1（Hypma_015393，2.4）上调，表明其增强丝状生长相关基因表达。原基—菇蕾阶段，细胞壁胁迫分支亚通路（Bck1）、高渗亚通路（Ctt1、Tup1）和饥饿亚通路（Sho1、Ste11）共5个基因上下调，其中核心MAPK激酶Bck1 RDB28565.1（Hypma_015613，1.7）上调、转录因子Tup1 RDB30643.1（Hypma_005760，?2.7）下调、核心MAPK激酶Ste11 RDB21078.1（Hypma_011637，2.1）上调，表明细胞壁胁迫、高渗和饥饿亚通路发生节点基因差异表达。菇蕾—子实体阶段，信息素亚通路（Ste3、Gpa1、Cla4、Cdc28）、细胞壁胁迫亚通路（Rom1,2、Bem2、Pkh1,2,3、Bck1、Cdc28）、高渗亚通路（Cla4、Hsl1、Cdc28）和饥饿亚通路（Sho1、Bmh1,2、Kss1）共17个基因上下调，其中转录因子Cdc28 RDB21937.1（Hypma_011086，1.1）上调、核心MAPK激酶Bck1 RDB16458.1（Hypma_002812，?1.3）和Kss1 RDB29560.1（Hypma_015393，?1.9）下调；细胞壁胁迫和高渗亚通路表达相对活跃，包括Cdc28上调。

3.4 蛋白质组学分析与鉴定：LC-MS/MS定量共鉴定5912个蛋白，PCA显示PC1（60.80%）与PC2（15.60%）合计解释76.40%的样本变异，4个阶段样本各自聚类、组间分离明显，与转录组PCA趋势一致。差异蛋白分析显示原基与子实体阶段差异最大，上调2089个、下调1571个，表明原基向子实体转变过程中蛋白丰度发生显著变化。

3.5 Hyd蛋白结构特征分析：多序列比对表明，Hyd1—Hyd6均含8个保守半胱氨酸（Cys）残基，均属I类疏水蛋白，N端均预测有信号肽；Hyd1含2个α螺旋、以β折叠为主，β11（100–120 aa）最保守，其保守氨基酸区域明显多于其他成员；Hyd2含1个α螺旋、10个β折叠，β9（90–100 aa）最保守；Hyd3含2个α螺旋，β4（70–110 aa）最保守；Hyd4、Hyd5、Hyd6各含1个α螺旋，最保守区域分别为β8（80–100 aa）、β7（90–100 aa）、β7（80–100 aa）。各蛋白疏水核心由Cys残基构成、高度保守，中央环区亲水且高度可变；三维结构GMQE值分别为0.73、0.75、0.68、0.69、0.71、0.68。

3.6 Hyd基因时空表达：PCR扩增获得Hyd1—Hyd6清晰条带；qRT-PCR显示，Hyd1在原基期显著上调、菇蕾期显著下调、子实体期再次显著上调（原基vs菌丝体t = 20.72，p < 0.0001；原基vs菇蕾t = 16.13，p < 0.0001）；Hyd2在菌丝体期最高、原基—菇蕾期显著下调、子实体期上调（原基vs菌丝体t = 18.24，p < 0.0001；菌丝体vs菇蕾t = 26.64，p < 0.0001）；Hyd3在原基期显著上调、菇蕾期下调、子实体期达峰值（原基vs菌丝体t = 32.48，p < 0.0001；原基vs菇蕾t = 18.90，p < 0.0001）；Hyd4在菌丝体—原基期上调并在原基—菇蕾—子实体期保持高表达；Hyd5在原基期上调、菇蕾期下调、子实体期再次上调，模式与Hyd1相似（原基vs菌丝体t = 62.83，p < 0.0001）；Hyd6在菌丝体期低表达、原基期显著上调、子实体期再次升高，总体表达水平高于其他Hyd基因（原基vs菌丝体t = 14.75，p < 0.0001）。综上，Hyd1、Hyd3、Hyd4、Hyd5和Hyd6在菌丝体—原基阶段显著上调，Hyd2在菌丝体阶段表达最高。

讨论部分总结：本研究通过高通量转录组与LC-MS/MS蛋白质组分析，揭示了真姬菇Hyd基因在菌丝体—原基—菇蕾—子实体发育阶段的分子生物学特征与时空表达机制，发现Hyd基因在原基—菇蕾—子实体阶段显著上调，MAPK通路基因上下调在该阶段最明显，细胞壁胁迫和高渗通路上调基因最多（共3个节点基因上调），qRT-PCR证实Hyd1、Hyd3、Hyd4、Hyd5和Hyd6在原基和子实体期表达最高、Hyd2在菌丝体期最高，MAPK通路活跃表达期与Hyd基因表达峰值期相似。已有研究表明Hyd基因可能是参与气生菌丝、原基和子实体形成的关键基因：如金针菇（Flammulina filiformis）基因组含19个Hyd家族成员，多在原基和子实体阶段上调，RNAi干扰Hyd9抑制原基形成，过表达则促进气生菌丝扭曲并加速原基形成；灵芝（Ganoderma lucidum）干扰Hyd1后不形成原基，提示Hyd基因表达水平可能对食用菌原基形成具有决定性影响。本研究中真姬菇原基期Hyd基因表达模式与金针菇相似，且与平菇（Pleurotus ostreatus）、香菇（Lentinula edodes）、灰树花（Grifola frondosa）原基期Hyd基因显著上调的规律一致，提示可能为普遍规律，但不同食用菌的表达谱仍需进一步研究。值得注意的是，蛋白质组数据未检测到Hyd蛋白丰度，可能因疏水蛋白分子小、富含半胱氨酸、常被分泌且难以用标准蛋白质组方法提取检测，今后需解决其提取问题。MAPK通路关键基因在原基—菇蕾—子实体阶段的表达波动表明该通路并非持续调控Hyd基因表达；MAPK通路是真菌保守信号通路，参与形态发生、胁迫感知和出菇启动，传递光、温度、营养等内源发育或环境信号以调控Hyd基因转录，这解释了Hyd基因在原基和子实体阶段特异性上调的原因；通路激活后下游转录因子调控Hyd基因时序表达，确保疏水蛋白及时积累以支持气生菌丝形成、菌丝扭结和原基分化；结合灰盖鬼伞（Coprinopsis cinerea）和刺芹侧耳（Pleurotus eryngii）等研究，提示MAPK通路调控疏水蛋白表达可能是食用菌子实体发育中保守的调控模块，但具体由哪个通路组分（如Mkh1、Mkk2）及中间转录因子直接介导Hyd基因调控仍不清楚，需进一步遗传学验证。近期研究表明Hyd基因表达可能受MAPK（ko04011）、cAMP-PKA（ko04024）和细胞周期（ko04111）等多个上游KEGG通路网络调控，其中MAPK通路是核心，含信息素、细胞壁胁迫、高渗和饥饿4个亚通路，核心节点包括Ste12、Tec1、Rlm1、Swi4/Swi6、Hot1和Smp1；金针菇研究显示Tec1和Ste12 putative结合位点位于10个疏水蛋白基因内，说明通路核心节点基因表达对调控Hyd基因至关重要。值得注意的是，不同真菌MAPK通路核心节点数目可能不同，KEGG通路图标注6个核心节点，而丝状真菌研究鉴定出更多MAPK响应核心节点且多未纳入图中，提示当前通路核心节点注释存在缺口，有待完善。

研究结论部分翻译：真姬菇Hyd基因在原基—菇蕾—子实体发育阶段显著上调表达。在原基—菇蕾发育阶段，MAPK信号通路细胞壁胁迫亚通路中3个通路核心节点基因表达上调。Hyd1、Hyd3、Hyd4、Hyd5和Hyd6在原基和子实体发育阶段表达上调最为显著，Hyd2在菌丝体发育阶段表达上调最为显著。真姬菇MAPK信号通路在原基—菇蕾发育阶段活跃表达的时间与Hyd基因在原基—菇蕾—子实体发育阶段的表达峰值模式相似。未来研究将聚焦三个方面：第一，深入研究真姬菇Hyd基因表达机制，重点探讨其与MAPK信号通路的互作；第二，利用Hyd基因促进原基形成的分子特性，构建真姬菇Hyd基因RNA干扰菌株和过表达Hyd基因的转基因菌株；第三，将Hyd基因作为MAPK信号通路关键下游基因节点，研究该通路核心节点的表达机制，完善和补充该通路中目前尚未注释的核心节点。