丝素蛋白-二氧化硅杂化薄层色谱固定相的染料保留行为：流动相依赖的选择性与无量纲传输重构

《Separations》：Dye Retention on a Hybrid Fibroin-Silica Thin-Layer Chromatographic Stationary Phase: Mobile-Phase Dependent Selectivity and Dimensionless Transport Reconstruction

制备了一种微球形杂化丝素蛋白-二氧化硅吸附剂（HFSA），并评价其作为多功能固定相用于结构多样染料的薄层色谱分析。该材料通过在正硅酸乙酯（TEOS）水解缩聚过程中加入丝素蛋白合成，并采用扫描电子显微镜-能量色散X射线光谱（SEM-EDS）、傅里叶变换红外光谱（FTIR）、X射线衍射（XRD）及氮气吸附-脱附分析进行表征。HFSA呈现以无定形为主、微球形且多孔的结构，比表面积为318 m²/g，总孔容为1.03 cm³/g。采用MPh1［正己烷:异丙醇（1:1，v/v）］和MPh2［正己烷:异丙醇:水:冰乙酸（1:1:0.5:0.1，v/v/v/v）］两种流动相，通过薄层色谱（TLC）考察甲基橙、苏丹I、苏丹IV和罗丹明6G的色谱行为。在MPh1条件下，四种染料在HFSA上的表观保留均大于微球形硅胶（MSS），其中苏丹IV的差异最大。引入水和乙酸后迁移顺序发生显著改变：苏丹IV和苏丹I变得高度可迁移，而甲基橙和罗丹明6G仍保持较强保留。无量纲保留-传输重构再现了实验谱带质心位置，并可视化了条件依赖性迁移，但未独立预测实验谱带展宽或分离度。氢键、疏水缔合、范德华力、π–π相互作用及可能的静电效应被提出作为保留的贡献因素；其各自作用未经实验区分。上述结果表明，HFSA提供了一种化学多样性固定相，在两种受试流动相条件下对四种所考察染料表现出不同的保留行为。

研究背景方面，天然与合成染料在纺织、食品、制药、化妆品等行业广泛使用，每年有超过100吨染料排入水体。合成染料因芳香结构复杂、化学稳定性高而难以降解，印染过程中未完全固着的染料大量进入废水，常规处理难以去除；染料在水环境中积累可抑制植物光合作用、危害水生生物，并损害人体肾脏、肝脏和脑功能，甚至引起中枢神经和生殖系统功能障碍。因此，痕量染料的可靠分析对环境监测、食品安全、药品质量评价和法医学调查均具有重要意义。现有分析手段包括毛细管电泳-质谱、液相色谱-质谱、液相萃取、固相萃取、薄层色谱（TLC）及高效薄层色谱（HPTLC）等，其中TLC因操作简便、成本低而广泛用于复杂混合物筛查。固定相是决定TLC中分析物保留、迁移和分离的关键因素，但传统硅胶、氧化铝固定相在分离极性相近或结构相似化合物时选择性不足，因此开发具有化学多样性作用位点的固定相十分必要。有机-无机杂化材料兼具无机组分的机械强度、热稳定性和孔隙性以及有机组分的附加功能与分析物作用位点，可形成能与非均一电荷、极性、疏水性、芳香性及氢键能力分析物相互作用的化学非均一固定相。丝素蛋白是来自家蚕茧的天然蛋白聚合物，含18种氨基酸，以甘氨酸、丙氨酸和丝氨酸为主形成结晶性β-折叠结构域，较少丰度残基引入羟基、羧基、氨基等功能基团，加之其亲水与疏水域，可提供多种潜在作用位点；二氧化硅则提供可形成氢键的硅醇基（≡Si-OH）。溶胶-凝胶法便于在二氧化硅相形成过程中引入丝素蛋白，从而获得兼具硅醇氢键位点、疏水性β-折叠富集域及极性可电离基团的多重互补作用位点。本研究目的在于制备并表征微球形杂化丝素蛋白-二氧化硅吸附剂作为分析型TLC候选固定相，在MPh1下与MSS比较保留行为，利用MPh2考察流动相依赖的选择性，并从可能的分析物-表面相互作用角度解释所观察到的趋势；选取甲基橙（阴离子染料）、苏丹I和苏丹IV（中性亲脂染料）及罗丹明6G（阳离子染料）为模型分析物，因其在分子电荷、极性、疏水性、芳香结构和氢键能力方面差异显著，可在受控条件下比较色谱行为，而非针对特定样品基质进行方法验证。

研究人员开展了如下工作并得出结论：成功制备了微球形杂化丝素蛋白-二氧化硅吸附剂并评价其作为TLC固定相用于含甲基橙、苏丹I、苏丹IV和罗丹明6G的标准混合物分析。材料呈以无定形为主的多孔结构，FTIR显示二氧化硅相关和酰胺相关吸收带，结合EDS氮元素检出及合成过程，支持二氧化硅基产物中存在丝素蛋白衍生材料。HFSA报告了高于MSS的比表面积和总孔容，并具有提示附加潜在分析物作用位点的化学特征。丝素蛋白分子完整性的保持及沉积涂层稳定性仍未验证，需通过加工前后对比表征及涂层均匀性、黏附性和流动相暴露期间材料释放的进一步评估加以确立。所报告观察结果表明染料保留和迁移在固定相与流动相条件间存在差异：MPh1条件下四种染料在HFSA上的表观保留均大于MSS，苏丹IV效应最显著，苏丹I/苏丹IV表观选择性由1.33增至2.48，而其他相邻对选择性下降，提示配对特异性选择性的改变，但因缺乏独立重复测量和变异性估计仍属初步；在同一HFSA配方上以含水和酸的MPh2替换MPh1后迁移顺序改变，中性苏丹染料高度可迁移，甲基橙呈中等保留，罗丹明6G保持强保留，表明流动相依赖的选择性但未确立色谱模式间的转变。所观察色谱行为可能反映分析物结构差异、流动相依赖溶剂化及可能的分析物-表面相互作用，但这些解释仍属假说，未证明主导机制，区分各贡献需针对性测量表面电荷和分析物形态并受控改变溶剂组成、酸度和离子强度。无量纲重构提供了所测迁移行为的比较性可视化，但未独立预测实验谱带展宽或分离度。HFSA被提出作为分析型TLC的候选固定相，苏丹I/苏丹IV被确定为待进一步研究的目标配对；其潜在优势在于相对MSS的替代选择性，但改进的分离度和更广泛适用性仍待验证，验证应量化独立合成批次、独立制备板及不同日期间Rf、选择性和实验分离度的变异性，并评估受控温度和相对湿度下的稳健性，其应用于废水、食品或药物基质需用代表性样品、基质空白和加标回收实验评估，并酌情与既定分析方法比较；确立固定相可调性还需系统改变HFSA组成或表面性质并覆盖更广分析物和流动相条件。其重要意义在于展示了该丝素蛋白-二氧化硅配方相对MSS的保留行为，为结构不同染料提供替代选择性，但尚未确立优于既往报道的硅胶-有机杂化或其他改性TLC吸附剂。

关键技术方法方面，研究人员采用一步合成法，在正硅酸乙酯水解缩聚过程中加入丝素蛋白制备HFSA（丝素蛋白/TEOS质量比0.03:1，H₂O/TEOS和NH₃/TEOS摩尔比分别为12.95和0.61）；以SEM-EDS、FTIR、XRD和77 K氮气吸附-脱附进行理化表征；采用无黏合剂涂布法制备HFSA与MSS薄层板（标称吸附剂载量5.0 mg cm^-2，干层厚度100 μm）；以MPh1和MPh2为流动相开展TLC并用Rf值评价保留；建立无量纲保留-传输重构，以实验Rf直接赋值归一化谱带速度，用对流-扩散方程重建高斯浓度分布，并计算表观保留参数k′=(1?Rf)/Rf及表观保留自由能描述符ΔGapp=?RT ln(k′)。研究所用丝素蛋白由蚕茧脱胶、溴化锂溶解、透析和冻干制备，染料标准品购自NPP KHIMTEK，MSS按文献制备；实验仅限HFSA与MSS比较，未评估商品TLC板、纯丝素层及丝素与二氧化硅物理混合物，亦未分析废水、食品或药物样品。

研究结果方面，3.1杂化吸附剂的表征：通过SEM-EDS、FTIR、XRD和氮气吸附-脱附表征，得出HFSA为以无定形为主、微球形（平均粒径7.57 μm）、多孔的二氧化硅基产物，比表面积318 m²/g、总孔容1.03 cm³/g，高于MSS的287 m²/g和0.24 cm³/g，并具有可检出的丝素蛋白衍生化学和结构特征，但未确立原始丝素蛋白分子量或二级结构的保持，不能排除部分降解或加工诱导重排。3.2色谱保留与迁移行为：通过MPh1下MSS与HFSA比较及同一HFSA配方的MPh1与MPh2比较，得出MPh1下两种固定相上Rf顺序均为甲基橙>苏丹I>苏丹IV>罗丹明6G，四种染料在HFSA上Rf均降低（苏丹IV由0.54降至0.33，变化最大）；MPh2-HFSA下顺序变为苏丹IV>苏丹I>甲基橙>罗丹明6G（Rf分别为0.86、0.77、0.49、0.20）；k′与ΔGapp提供了比较性描述，无量纲重构再现了实验谱带质心位置；敏感性分析显示重构最小相邻对分离度随假定无量纲扩散系数增大而降低，MPh2-HFSA最高、MPh1-HFSA最低，但均未达参考分离度1.5，且因未测实验斑点宽度和扩散系数，该分析仅量化重构对假定展宽的敏感性而非预测实验分离度。3.3染料保留的机制解释：基于化学官能团提出氢键、疏水缔合、范德华力、π–π相互作用及可能的静电效应等假说，结合文献logP/XlogP3描述符及流动相中溶剂竞争讨论各染料可能的保留贡献，得出染料结构和流动相组成可为观察趋势提供可能解释，但各相互作用贡献未被分离或定量，MPh1与MPh2间迁移顺序反转反映表观保留和选择性的改变，其分子基础仍属提出性解释。3.4迁移图谱与色谱选择性：通过无量纲时空迁移图及基于Rf的选择性因子比较，得出MPh1下甲基橙/苏丹I选择性由2.56降至2.21、苏丹I/苏丹IV由1.33升至2.48、苏丹IV/罗丹明6G由1.84降至1.10，即丝素蛋白引入未均匀改善每一相邻对的选择性而是以染料依赖方式重新分配相对保留；MPh2-HFSA下苏丹IV/苏丹I、苏丹I/甲基橙、甲基橙/罗丹明6G选择性因子分别为1.83、3.48、3.84，最高选择性见于甲基橙与罗丹明6G之间；这些比较确立条件依赖性保留和选择性而非固定相可调性，且所报告分离度因缺少斑点宽度测量和计算记录仅作为初步描述符。

讨论与结论部分总结如下：HFSA的保留行为可能反映分析物结构差异、流动相依赖溶剂化及可能的分析物-表面相互作用，但这些均为假说，未证明主导机制；丝素蛋白分子完整性保持和沉积涂层稳定性仍未验证，需加工前后对比表征及涂层均匀性、黏附性和材料释放评估；因缺乏独立重复测量，Rf、选择性和分离度的比较均为初步。结论译文如下：成功制备了微球形杂化丝素蛋白-二氧化硅吸附剂，并评价其作为薄层色谱固定相用于含甲基橙、苏丹I、苏丹IV和罗丹明6G的标准混合物分析。该材料呈现以无定形为主的多孔结构，显示二氧化硅相关和酰胺相关的FTIR吸收带，结合EDS氮元素检出和合成过程，支持二氧化硅基产物中存在丝素蛋白衍生材料。HFSA报告了高于MSS的比表面积和总孔容，并具有提示附加潜在分析物作用位点的化学特征。丝素蛋白分子完整性的保持及沉积涂层的稳定性仍未验证，需通过加工前后对比表征以及涂层均匀性、黏附性和流动相暴露期间材料释放的进一步评估来确立这些性质并评估其对色谱性能的影响。所报告观察结果表明染料保留和迁移在固定相与流动相条件之间存在差异。MPh1条件下，四种染料在HFSA上的表观保留均大于MSS，苏丹IV效应最明显。苏丹I/苏丹IV表观选择性由1.33增至2.48，而其他相邻对选择性下降。这些比较提示配对特异性选择性改变，但因缺乏独立重复测量和变异性估计仍属初步。在同一HFSA配方上以含水和酸的MPh2替换MPh1改变了迁移顺序：中性苏丹染料高度可迁移，甲基橙呈中等保留，罗丹明6G保持强保留。该发现表明流动相依赖的选择性，但未确立色谱模式间的转变。所观察色谱行为可能反映分析物结构差异、流动相依赖溶剂化及可能的分析物-表面相互作用；这些解释仍属假说，未证明主导机制，区分各贡献需针对性测量表面电荷和分析物形态，并受控改变溶剂组成、酸度和离子强度。无量纲重构提供了所测迁移行为的比较性可视化，但未独立预测实验谱带展宽或分离度。HFSA被提出作为分析型TLC的候选固定相，苏丹I/苏丹IV被确定为待进一步研究的目标配对。其潜在优势在于相对MSS的替代选择性，但其改进的分离度和更广泛适用性仍待验证。验证应量化独立合成批次、独立制备板及不同日期间Rf、选择性和实验分离度的变异性，并评估受控温度和相对湿度下的稳健性。其应用于废水、食品或药物基质需用代表性样品、基质空白和加标回收实验评估，并评估选择性和精密度，酌情与既定分析方法比较。确立固定相可调性还需系统改变HFSA组成或表面性质并覆盖更广分析物和流动相条件。