基于Flash10卡盒式POCT平台的PEDV与PDCoV联合引物探针RT-qPCR体系的初步分析性能评价

《Veterinary Sciences》：Preliminary Analytical Evaluation of PEDV- and PDCoV-Targeting Primer Probe Sets on a Cartridge-Based POCT RT qPCR Platform

猪流行性腹泻病毒（PEDV）与猪δ冠状病毒（PDCoV）可致仔猪严重腹泻，亟需快速的实验室鉴别诊断。在本技术简报中，研究人员在Coyote Flash10卡盒式POCT联合引物探针RT-qPCR平台上，评价了来自中国检疫行业标准的引物-探针组。研究采用经数字PCR（dPCR）定量的单靶标体外转录病毒RNA及RNA加标猪粪便基质对检测体系进行表征。在3.222 copies/μL（PEDV）与2.28 copies/μL（PDCoV）处观察到探索性低浓度扩增；然而相应Ct值落在不确定区间内，未建立经统计学验证的检测限（LOD）。PEDV标准曲线纳入了平均Ct值处于不确定及阴性范围的浓度点，故其表观扩增效率未被视为已验证的性能指标。PDCoV扩增效率欠佳（约77.7%）。加标基质试验中观察到较低的批内Ct变异（CV < 3%）。在所测条件下，针对四种选定猪病原体未检出交叉扩增。值得注意的是，未进行模拟共感染的混合比例共模板病毒RNA实验。专有内标（IC）仅作描述性记录，未用于评估提取效率或样本有效性。本研究证明了该引物-探针组合在Flash10平台上的初步分析可行性；完整的临床诊断性能仍待进一步研究验证。

猪流行性腹泻病毒（PEDV）与猪δ冠状病毒（PDCoV）均为冠状病毒科（Coronaviridae）有囊膜的单股正链RNA病毒，主要感染猪肠道上皮细胞，引起以呕吐、水样腹泻和脱水为特征的急性肠道疾病，对全球养猪业构成持续且严重的威胁。PEDV于20世纪70年代首次在欧洲发现，此后在亚洲和北美造成毁灭性暴发，其高毒力与快速传播可导致新生仔猪高死亡率，给集约化养殖造成灾难性经济损失。PDCoV是冠状病毒家族中较新的成员，2012年首次在中国香港的猪群中报道，随后在多个亚洲和北美国家被检出。PDCoV可单独感染，也可与PEDV混合感染；实验性PEDV/PDCoV混合感染已被证明较任一单病毒感染引起更严重的腹泻疾病和更长的腹泻持续时间。由于PEDV与PDCoV的肠道临床表现相互重叠，可靠的病原学鉴别需要病原体特异性的实验室检测，能够在同一分析流程中检测两种病毒的方法因此有助于实现快速鉴别。实时定量RT-qPCR（RT-qPCR）因具有分析灵敏度、特异性及实时荧光检测能力，被广泛用于动物RNA病毒的检测与鉴别。紧凑型核酸检测平台有望缩短仪器检测流程并减少对传统实验室仪器的依赖，但其实际效用取决于所需离机样本处理的程度。Coyote Flash10是一种支持快速热循环和多通道荧光检测的紧凑型核酸扩增与荧光检测平台；在本文评价的工作流程中，样本制备在仪器外手工完成，而RT-qPCR扩增、荧光采集和Ct值判定均在Flash10平台上完成。多重RT-qPCR技术允许在单反应管中同时扩增和检测多个靶标，从而减少鉴别检测所需的独立反应数。目前PEDV的RT-qPCR检测多基于核衣壳（N）基因或纤突（S）基因的保守序列设计，而PDCoV检测通常靶向膜（M）基因或ORF1ab基因。此前已有多个可检测PEDV和PDCoV的多重RT-qPCR方法报道，此外在Flash10平台上亦已实现针对猪呼吸道病原体的双重检测。因此，本研究的新颖性不在于双重RT-qPCR的一般概念，也不在于首次将Flash10用于多靶标病原检测；确切而言，本技术简报将已建立的靶向PEDV N基因和PDCoV M基因的引物-探针组适配为联合引物-探针RT-qPCR模式，并进行初步分析评价。研究中未进行混合模板共检测实验，也未声称已验证双重共检测。本研究通过将已建立的PEDV N和PDCoV M靶向引物/探针组适配为联合引物-探针RT-qPCR模式，并利用RNA参考物质和RNA加标猪粪便基质对该配置进行分析评价，从而将该平台拓展至猪肠道病毒应用。尽管紧凑型卡盒式配置可能具有用于分散化检测的潜力，但其现场可用性及任何潜在成本优势未在本研究中评价。据此，本研究旨在对联合PEDV/PDCoV靶向引物-探针组在Flash10联合引物-探针RT-qPCR平台上的性能进行分析表征：优化引物/探针浓度和热循环条件，并利用定量病毒RNA参考物质、有限的非靶标病原体panel及RNA加标猪粪便基质评价检测性能。专有内标（IC）被纳入独立的CY5荧光通道，其靶标与序列未披露；未添加外源性IC模板，IC未用作提取或样本有效性对照。因此，"联合引物-探针RT-qPCR"特指两个病毒诊断靶标PEDV和PDCoV，而非荧光通道数量。鉴于本研究的分析设计及缺乏独立真实临床样本，检测在此作为定性分析检测方法评价，其临床诊断性能和现场适用性尚需进一步验证。研究人员从NCBI GenBank数据库获取14株PEDV和31株PDCoV的全基因组序列，导入SnapGene软件（6.0.2版）进行多序列比对，以考察本研究所用引物和探针结合位点的序列保守性；序列未通过预定义的系统抽样策略选取，不旨在全面代表所有流行基因型或谱系。PEDV与PDCoV的引物和TaqMan探针分别采用中国出入境检验检疫行业标准SN/T 1699-2017和SN/T 5124-2019；IC为专有，其靶标和序列未披露，反应中未添加外源性IC模板；扩增子长度控制在150 bp以内；探针标记为：PEDV探针FAM/BHQ1，PDCoV探针ROX/BHQ2，IC探针CY5/BHQ2。所有引物和探针由生工生物工程（上海）股份有限公司合成并经PAGE纯化。PEDV和PDCoV核酸对照（已知拷贝数的体外转录RNA参考物质）及特异性试验用核酸对照（TGEV、猪轮状病毒[PoRV]、高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒[HP-PRRSV]和非洲猪瘟病毒[ASFV]）购自北京普道标准。PEDV和PDCoV RNA参考物质使用前经数字PCR独立定量；现有实验记录显示低浓度实验中PEDV为3.22 copies/μL、PDCoV为22.8 copies/μL。携带PEDV N和PDCoV M靶片段的重组质粒DNA构建体被合成用于检测体系开发和反应条件筛选；由于未能通过数字PCR实现质粒制备物的可靠拷贝数定量，质粒数据仅用于评估扩增性能和线性趋势，未用于检测限计算或正式定量评价。PEDV与PDCoV RNA参考物质分别单独检测，未混合制备等比例病毒RNA模板；因此"联合引物-探针RT-qPCR"描述的是PEDV/PDCoV联合引物-探针反应体系，而非两种病毒RNA模板的混合物。为建立稳健的联合引物-探针RT-qPCR体系，研究人员开展了一系列优化实验，使用重组质粒DNA模板和体外转录病毒RNA评估反应缓冲液、引物/探针条件和退火温度；先以单靶标反应评价PEDV和PDCoV各自检测组分，再将两组引物/探针组合并入联合反应体系；开发阶段的单靶标对照亦在选定模板浓度下与联合引物/探针体系平行评价，以考察并入联合模式后的兼容性，该比较并非为配对单重与联合稀释系列效率研究而设计；设置无模板对照（NTC）监测非特异性扩增；最终条件依据病毒靶标的Ct值和荧光信号及NTC无扩增选定。最终联合RT-qPCR反应体系（50 μL）含35 μL酶混合物、5 μL引物-探针混合物和10 μL模板；酶混合物由25.0 μL反应缓冲液、3.0 μL Lyo-Ready Taq DNA聚合酶、0.7 μL Lyo-Ready dNTP混合物、2.0 μL One-Step RT-qPCR Kit（Lyo-Ready）逆转录酶和4.3 μL无DNase/RNase ddH₂O组成；5 μL引物-探针混合物含IC-F、IC-R、IC-P-CY5（各100 μM）各0.1 μL，PEDV-F和PEDV-R（各100 μM）各0.5 μL，PEDV-P（100 μM）0.2 μL，PDCoV-F和PDCoV-R（各100 μM）各0.2 μL，PDCoV-P（100 μM）0.1 μL，以及3.0 μL无DNase/RNase ddH₂O； accordingly，50 μL反应终浓度为PEDV正反向引物各1.0 μM、PEDV探针0.4 μM、PDCoV正反向引物各0.4 μM、PDCoV探针0.2 μM、IC正反向引物和探针各0.2 μM。扩增在Coyote Flash10分析仪（北京卡尤迪生物科技有限公司）上进行，程序为：50 °C逆转录1 min（1循环），95 °C初始变性1 min（1循环），随后45个循环的95 °C 1 s、60 °C 5 s（采集荧光数据）、72 °C 1 s；荧光信号在FAM（PEDV）、ROX（PDCoV）和CY5（IC）通道采集；荧光基线和阈值判定及Ct判定由Flash10软件自动完成；仪器RT-qPCR扩增与荧光检测过程约需30 min，不含离机粪便基质制备或其他手工样本制备步骤；RT-qPCR反应在一次性卡盒内的液态腔室中进行，卡盒内预冻干试剂在加载液体反应混合物后复溶。本分析研究对病毒靶标判读标准为：Ct < 35且具特征性扩增曲线判为阳性，35 ≤ Ct < 40判为不确定并需重复检测，Ct ≥ 40或无Ct值判为阴性；因此在缺乏所需重复检测时，不确定区间内的Ct值不作为确证阳性结果。含猪粪便基质的反应中，CY5通道的专有IC信号被记录，但由于未添加外源性IC模板且IC靶标为专有，CY5信号未用于评估样本有效性、提取效率或RT效率，CY5结果仅作描述性报告。单重RT-qPCR检测作为参考方法用于比较，按中国出入境检验检疫行业标准（PEDV为SN/T 1699-2017，PDCoV为SN/T 5124-2019）所述标准方案在QuantStudio? 1 Plus实时PCR仪（Thermo Fisher Scientific）上进行。PEDV和PDCoV RNA参考物质分别在无RNase ddH₂O中制备系列稀释，两种病毒RNA制备物未混合；每个浓度水平用联合引物-探针反应体系做三个技术重复；各Ct值（包括不确定范围和未获得Ct的测定）列于补充表S1；探索性低浓度反应未进行确证性重复检测。PEDV纳入标准曲线回归的浓度水平为32.22、3.222和0.3222 copies/μL；PDCoV纳入回归的浓度水平为228、45.6、22.8和2.28 copies/μL；标准曲线由各浓度水平三个技术重复的平均Ct值对log₁₀转化RNA浓度进行线性回归生成，计算回归方程和决定系数（R²）；因每50 μL反应加入10 μL模板，每反应名义模板拷贝数按报告浓度（copies/μL）× 10 μL计算。低浓度实验为探索性，未设计用于建立经统计学验证的检测限；具体而言，PEDV在3.222 copies/μL时Ct值为37.66、36.95和37.98，PDCoV在2.28 copies/μL时Ct值为38.17、38.29和38.27，按预设判读标准均落在不确定区间（35 ≤ Ct < 40），且未进行确证性重复检测；因此这些浓度被视为探索性低浓度扩增观察而非正式LOD估计。PEDV和PDCoV的扩增效率（E）由核酸对照系列梯度稀释（含10倍和5倍稀释步骤）所得标准曲线斜率计算，斜率（k）由回归线方程获得，扩增效率按MIQE推荐公式计算；由于PEDV回归纳入的平均Ct值处于不确定和阴性范围的浓度点，其效率估计未作为已验证性能指标呈现；效率估计描述联合反应条件下各自标准曲线的扩增行为，未用于声称两个病毒靶标间的定量等效性；特别地，未进行PDCoV扩增效率在单重与联合模式间的配对稀释系列比较；所有计算使用Microsoft Excel 2021完成。采用一头临床健康猪的单个粪便拭子标本制备猪粪便背景基质；制备工作基质前，该标本经相应参考RT-qPCR检测确认PEDV和PDCoV阴性；因此本研究评价了一个独立阴性粪便基质，该标本仅用于制备粪便背景基质，未作为独立临床特异性队列的一部分评价。PEDV/PDCoV阴性粪便拭子材料与粪便处理缓冲液按1:1（v/v）混合制备工作基质；预先制备并定量的PEDV或PDCoV RNA参考物质直接加标至所得粪便工作基质中；加标病毒RNA后未进行核酸提取；因此这些实验评价了RNA加标粪便背景中的RT-qPCR检测，但未评价病毒裂解、RNA提取或回收，或提取相关变异。PEDV和PDCoV RNA分别加标并检测，而非混合病毒模板制备物；PEDV加标基质以原液和10倍稀释评价，PDCoV加标基质以原液、10倍和100倍稀释评价；这些样本在Flash10平台联合引物-探针RT-qPCR检测与QuantStudio? 1 Plus仪器相应参考RT-qPCR检测间平行测试；每种制备物做三个技术重复，计算平均Ct、标准差（SD）和基于Ct的变异系数（CV）以描述技术重复间的批内变异；三个重复测量为来自同一制备样本的技术重复，未作为独立生物学标本处理；因此这些实验用于Ct值和批内Ct变异的描述性比较，未用于建立两平台间的临床诊断一致性或等效性。PEDV 10倍稀释RNA加标基质的三个Flash10 Ct值为37.16、36.92和36.39，落在预设不确定区间（35 ≤ Ct < 40）内；因未进行重复检测，该条件记录为初始不确定结果而非确证阳性结果。为评估交叉反应性，使用联合引物-探针RT-qPCR检测评价四种常见猪病原体（TGEV、PoRV、HP-PRRSV和ASFV）的核酸对照；每种非靶标病原体在单反应中评价；四种非靶标病原体对照的确切输入浓度未保留在现有实验记录中，故未回顾性重建或推断；受试材料与阴性猪粪便背景基质混合，以便同时评估专有IC扩增。FAM和ROX通道无扩增判为所测条件下相应PEDV和PDCoV靶标无可检测交叉扩增；CY5通道专有IC信号（Ct < 35）作描述性记录；因未添加外源性IC模板且靶标为专有，其未用作反应有效性指标、提取对照或样本有效性对照；因仅评价四种非靶标病原体且各检测一次，分析特异性结论仅限于该受试panel，不外推至其他猪肠道或呼吸道病原体。所有统计计算包括均值、标准差（SD）、变异系数（CV）和标准曲线拟合线性回归均在Microsoft Excel 365中完成；给定浓度或RNA加标基质制备物内的三次重复测量作为技术重复而非独立生物学标本处理，均值、SD和CV因此仅用于描述批内Ct变异；基于Ct的CV值未解释为病毒拷贝数CV或批间、日间重现性证据；未进行独立批间或日间重现性实验。标准曲线分析中，线性回归使用各浓度水平平均Ct值进行；回归方程、R²值和由回归斜率推导的扩增效率作描述性报告。因比较基于有限数量的RNA加标制备物和技术重复而非足量独立临床标本，未在Flash10与参考RT-qPCR平台间进行正式等效性检验、Bland-Altman一致性界限分析或阳性/阴性符合率分析；同样，因本研究未建立经统计学验证的检测限，未使用二项置信区间定义LOD。对14株PEDV和31株PDCoV全基因组序列的多序列比对显示，在本研究所分析的各序列集内，所考察的引物和探针结合区域保守；部分序列（如MZ802777.1）的PDCoV-F结合区域观察到少量核苷酸错配，而PEDV区域在分析数据集内保守；这些发现证明所考察结合区域在分析序列数据集内的保守性，但未确立对所有流行PEDV或PDCoV谱系的覆盖。退火温度优化显示，在所评价条件中60 °C对PEDV和PDCoV均提供最早Ct值和最高荧光信号增量（ΔRn）；所选条件下相应NTC反应无扩增。随后在选定反应条件下优化引物/探针用量，选定终浓度为PEDV正反向引物各1.0 μM、PEDV探针0.4 μM、PDCoV正反向引物各0.4 μM、PDCoV探针0.2 μM、专有IC正反向引物和探针各0.2 μM，这些条件用于后续分析实验；后续RNA标准曲线实验报告的扩增效率未在检测开发优化中用作接受标准。检测开发期间，单靶标对照亦在选定模板浓度下与含联合PEDV/PDCoV特异性引物/探针组的反应平行评价；将两组引物/探针并入联合引物-探针反应在所测条件下未使观察到的靶标Ct值或荧光信号明显恶化；该开发阶段比较在选定模板浓度而非配对稀释系列下进行，故未用于比较单重与联合引物-探针扩增效率。重组质粒DNA模板亦用于该优化阶段；质粒构建体系列稀释对PEDV和PDCoV靶标均产生可测扩增信号并显示稀释依赖性扩增反应；然而因数字PCR未能为质粒储备液提供可靠绝对拷贝数值，质粒来源扩增结果仅作为靶序列可扩增性的定性支持证据；本文报告的所有正式灵敏度和标准曲线表征完全依赖定量的体外转录病毒RNA参考物质。PEDV和PDCoV RNA参考物质使用联合引物-探针反应体系分别评价，两种病毒RNA制备物未混合；每个浓度水平做三个技术重复，所有个体Ct值见补充表S1。PEDV纳入标准曲线回归的三个浓度水平为32.22、3.222和0.3222 copies/μL，相应平均Ct值分别为33.73、37.53和40.15；因3.222和0.3222 copies/μL处平均Ct值分别落在不确定和阴性范围，拟合回归仅作探索性趋势观察报告，不代表已验证扩增效率。PDCoV纳入回归的四个浓度水平为228、45.6、22.8和2.28 copies/μL，相应平均Ct值分别为30.24、33.01、34.19和38.24；线性回归得方程约为y = ?4.00x + 39.66（R² > 0.999），对应扩增效率约77.7%；尽管PDCoV Ct值在所测浓度水平内与log₁₀ RNA浓度呈线性关系，但扩增效率欠佳；因此高R²反映所测数据集内拟合回归的线性，但未确立定量准确性。在所考察的较低浓度下，PEDV在3.222 copies/μL时Ct值为37.66、36.95和37.98，PDCoV在2.28 copies/μL时Ct值为38.17、38.29和38.27，均落在预设不确定区间（35 ≤ Ct < 40）内；因未进行确证性重复检测，这些浓度代表探索性低浓度扩增观察而非正式建立的检测限；以每反应10 μL模板计，3.222 copies/μL PEDV和2.28 copies/μL PDCoV名义上分别对应每反应32.22和22.8拷贝。除基于RNA的标准曲线表征外，含PEDV N和PDCoV M插入片段的重组质粒系列稀释物在联合引物-探针混合物中测试；两靶标均观察到扩增，并获得Ct值与质粒稀释倍数间的线性关系；然而由于起始质粒材料数字PCR定量未成功，各稀释度绝对拷贝数值仍未知；因此这些基于质粒的结果作为靶序列可扩增性的补充证据呈现，未用于LOD计算或定量性能评估。检测进一步使用PEDV或PDCoV RNA加标猪粪便基质评价；实验使用来自一头猪的单个阴性粪便基质，病毒RNA参考物质直接加标至预先制备的粪便工作基质中，随后未进行RNA提取；PEDV和PDCoV RNA分别评价；所得Ct值与相应参考RT-qPCR检测所得Ct值进行描述性比较；单个阴性粪便基质仅作为RNA加标实验的背景基质，不构成独立临床特异性队列。对于PEDV，Flash10联合RT-qPCR检测对原液RNA加标基质所得Ct值为33.28、33.53和34.92，平均Ct为33.910（SD = 0.884；CV = 2.61%），三次测量均低于Ct < 35阳性阈值；10倍稀释制备物Ct值为37.16、36.92和36.39，平均Ct为36.823（SD = 0.394；CV = 1.07%），三值均在预设不确定区间（35 ≤ Ct < 40）内；因未进行所需重复检测，PEDV 10倍稀释条件被归类为初始不确定结果而非确证阳性结果；参考RT-qPCR检测相应原液和10倍稀释制备物平均Ct值分别为30.924（CV = 2.36%）和34.356（CV = 0.90%）。对于PDCoV，Flash10联合RT-qPCR检测在原液、10倍和100倍稀释制备物的三个技术重复中Ct值均低于35，平均Ct值分别为27.683（CV = 0.37%）、30.663（CV = 0.23%）和34.017（CV = 1.00%）；参考RT-qPCR检测平均Ct值分别为24.604（CV = 0.06%）、27.743（CV = 0.38%）和31.078（CV = 0.04%）。在这些受试制备物中，Flash10平均Ct值较相应参考RT-qPCR平均Ct值高约2.47–3.08个循环；具体而言，平均Ct差异（Flash10减参考RT-qPCR）对PEDV原液和10倍制备物分别为2.986和2.467个循环，对PDCoV原液、10倍和100倍制备物分别为3.079、2.920和2.939个循环；这些差异作描述性报告，未进行正式等效性检验，因测量基于有限数量RNA加标制备物的技术重复而非独立临床标本；因此观察到的Ct差异不应解释为证明Flash10与参考RT-qPCR平台间的等效性或可互换性。Flash10测量的批内Ct CV在受试制备物中为0.23%–2.61%，显示这些实验条件下技术重复间批内Ct变异较低；这些CV仅描述技术批内变异，未确立批间重现性或与参考RT-qPCR方法等效。未评价真实PEDV阳性、PDCoV阳性或自然PEDV/PDCoV混合感染临床标本；因此不能从这些RNA加标粪便基质实验推断临床诊断性能。联合引物-探针RT-qPCR检测的分析特异性针对测试panel中可用的四种非靶标猪病原体TGEV、PoRV、HP-PRRSV和ASFV评价，每种非靶标病原体在单反应中评价；四种非靶标病原体对照的确切输入浓度未保留在现有实验记录中，故无法报告。四种非靶标病原体在FAM（PEDV）或ROX（PDCoV）通道均未观察到扩增；专有IC在CY5通道检出，TGEV、PoRV、HP-PRRSV和ASFV的Ct值分别为23.90、25.89、25.81和25.71，范围为23.90–25.89；因此在本研究评价的有限非靶标病原体panel内未观察到交叉扩增；因仅评价四种非靶标病原体且各检测一次，这些结果不构成广泛或重复的分析特异性验证。本技术简报报告了联合PEDV/PDCoV靶向引物-探针组在Coyote Flash10 POCT平台上联合引物-探针RT-qPCR反应中的分析性能；引物-探针组采用靶向PEDV N基因和PDCoV M基因保守区域的中国行业标准；本工作的具体贡献是这些引物-探针组在Flash10平台上针对猪肠道病毒应用的适配和初步分析评价，而非在该平台上引入双重检测；该检测应视为定性病毒靶标检测方法，而非经验证的定量病毒载量检测。RNA稀释系列实验显示两靶标均呈浓度依赖性扩增；对于PEDV，回归纳入的平均Ct值处于不确定和阴性范围的浓度点，因此表观效率仅作探索性趋势观察报告，不作为已验证性能指标呈现；对于PDCoV，标准曲线显示强线性（R² > 0.999）但效率欠佳（约77.7%），表明该检测仅应解释为定性；与MIQE原则一致，扩增效率、线性和低浓度检测是不同的分析特性；因标准曲线在无RNase水中生成，粪便基质抑制不能解释PDCoV效率降低；尚需进一步优化和配对单重与联合稀释系列比较。低浓度结果亦需谨慎解释；PEDV在3.222 copies/μL和PDCoV在2.28 copies/μL时在全部三个初始技术重复中产生扩增，但相应Ct值落在预设不确定区间（35 ≤ Ct < 40）内；因未进行确证性重复检测，这些浓度不能视为确证阳性检测限，仅报告为探索性低浓度扩增观察而非正式建立的LOD；本研究未建立经统计学验证的LOD，未来LOD确定将需要在候选边界附近增加重复数和预定义检测概率标准。在RNA加标粪便基质实验中，两靶标在技术重复间显示低批内Ct变异（CV < 3%）；然而这些重复源自同一制备样本而非独立生物学标本，因此观察到的CV仅描述批内变异；Flash10 Ct值较参考RT-qPCR检测高约2.47–3.08个循环，这些差异仅作描述性报告，不应解释为证明平台间等效；粪便基质实验使用来自一头猪的单个阴性基质，病毒RNA直接加标至预处理基质而未进行核酸提取；因此这些实验评价了粪便背景中的扩增，但未评估病毒裂解、RNA回收、提取变异或动物间基质变异；专有IC信号作描述性记录，因未添加外源性IC模板且IC靶标为专有，IC结果未用于评估提取效率、RT效率、PCR抑制或样本有效性；此外未进行混合比例共模板实验，因此PEDV/PDCoV不均衡混合感染下的性能仍未知。特异性测试显示四种受试非靶标病原体（TGEV、PoRV、HP-PRRSV和ASFV）在PEDV或PDCoV通道无扩增，而专有IC通道保持可检出；每种非靶标病原体在单反应中测试，确切输入浓度未保留；因panel限于四种病原体，这些结果不构成广泛或重复的分析特异性验证。已有多个靶向PEDV和PDCoV的多重核酸检测方法以及针对PEDV的快速POCT或抗原传感平台报道；由于这些研究在靶基因、参考物质、浓度赋值、模板输入、标本基质和LOD标准方面不同，直接数值比较分析灵敏度并不合适；因本研究未建立经统计学验证的LOD，未声称分析灵敏度优于或相当于其他方法；Flash10仪器约30 min完成扩增和荧光检测，该时长不含离机样本制备；本研究未评价完整样本到结果工作流程、总手工操作时间、操作稳健性、通量、污染控制或现场可用性。本工作存在若干重要局限：未实现质粒储备液的可靠数字PCR定量，质粒数据因此仅作为靶标可扩增性的定性证据；未进行定量PEDV和PDCoV RNA的混合比例共模板测试；所有主要验证使用RNA加标粪便基质而非真实临床标本，且加标后未进行核酸提取；粪便背景源自单一动物，未评估动物间基质变异；特异性panel限于四种病原体，各检测一次；未评价真实PEDV阳性、PDCoV阳性或自然混合感染临床标本，因此不能确立诊断灵敏度、诊断特异性及与参考方法的临床一致性。未来工作应包括对临床标本panel与已建立参考方法进行盲法测试；在不同PEDV:PDCoV比例下进行混合比例共模板实验；配对单重与联合稀释系列比较；独立粪便基质和批间重现性测试；扩展特异性panel；增加重复数用于统计学支持的LOD确定；以及评价遗传多样性当代田间分离株。总之，本研究支持联合PEDV/PDCoV引物-探针RT-qPCR在Flash10平台上的初步分析可行性；该检测显示两靶标浓度依赖性扩增、低批内Ct变异，且在有限四病原体panel内未观察到交叉扩增；然而PDCoV效率欠佳、缺乏经统计学验证的LOD、单一阴性粪便基质未经提取、重现性和特异性测试有限、缺乏混合模板实验及缺乏真实临床标本界定了当前证据范围；临床诊断性能和现场效用仍待确立。