《Current Research in Parasitology & Vector-Borne Diseases》：Development of a multiplex real-time PCR for the diagnosis of
Dirofilaria immitis,
Dirofilaria repens,
Ehrlichia canis and
Anaplasma spp. in dogs
编辑推荐：
犬媒介传播疾病（CVBDs）由多种经吸血节肢动物传播的感染性病原体引起，在全球范围内日益受到兽医医学和公共卫生的关注。近几十年来，欧洲CVBD病例不断增加，并扩散至既往非流行区。气候变化、城市化、森林砍伐、国际贸易与运输增长、犬只流动以及野生动物与家养动物间更
犬媒介传播疾病（CVBDs）由多种经吸血节肢动物传播的感染性病原体引起，在全球范围内日益受到兽医医学和公共卫生的关注。近几十年来，欧洲CVBD病例不断增加，并扩散至既往非流行区。气候变化、城市化、森林砍伐、国际贸易与运输增长、犬只流动以及野生动物与家养动物间更密切的接触等因素共同影响了媒介及其传播病原体的分布模式。在欧洲，最常见的CVBDs包括由Ehrlichia spp.、Anaplasma spp.和Dirofilaria spp.引起的疾病。Ehrlichia canis、Anaplasma phagocytophilum和Anaplasma platys是蜱传专性胞内革兰阴性菌（Anaplasmataceae科），主要由Rhipicephalus sanguineus群和Ixodes ricinus传播。E. canis引起犬单核细胞埃立克体病，慢性型严重，急性型常表现为非特异性症状，亦有报道人感染。A. phagocytophilum和A. platys分别引起粒细胞无形体病和犬感染性周期性血小板减少症，通常以非特异性全身症状和偶发出血表现为特征。A. phagocytophilum亦是公认的人兽共患病原体，引起人粒细胞无形体病，通常轻微或无症状。A. platys的人兽共患作用尚不确定，尽管已在人体中检测到其DNA。Dirofilaria immitis和Dirofilaria repens（Spirurida: Onchocercidae）由Culicidae科蚊传播，分别引起心肺恶丝虫病（HWD）和皮下恶丝虫病。HWD是一种慢性疾病，累及肺动脉和右心，可能导致肺损伤和右侧充血性心力衰竭。相比之下，D. repens感染通常无症状，但可能引起皮肤或眼部表现。近期数据表明，这两个物种在意大利的传播增加，与Aedes spp.蚊种群的扩张相关。这两个物种均可感染人，但人仅为偶然宿主。在欧洲，大多数人感染由D. repens引起，尽管也有少数涉及D. immitis的病例报道。与其他CVBDs一样，埃立克体病、无形体病和恶丝虫病由于临床症状谱广泛——从非特异性到严重或致死，尤其在合并感染的犬中——在诊断上具有挑战性。文献中报道的合并感染频率因研究人群、地理区域和所用诊断技术而异。在意大利南部，报道的感染率范围从猎犬中E. canis和Anaplasma spp.共存的2.2%，到犬舍犬中多种媒介传播病原体合并感染的20.7%。亚临床感染和缺乏特征性发现进一步阻碍了诊断。此外，亚临床感染或治疗不充分的犬可能成为人兽共患病原体的储存宿主。因此，使用特异性和敏感性方法进行准确及时的诊断对动物和人类健康至关重要。传统诊断技术包括血涂片检查、血清学（如酶联免疫吸附试验（ELISA）或间接荧光抗体试验（IFAT））和微丝蚴检测，但具有明显局限性，尤其在早期或亚临床感染中，可能导致假阴性或交叉反应。分子诊断工具，尤其是基于PCR的方法，已成为克服这些局限性的关键工具。这些技术提供了更高的敏感性和特异性，即使在低寄生虫血症水平或无症状病例中也能准确检测。然而，能够同时检测多种病原体的方法仍然有限。能够同时检测具有重叠临床表现的病原体的多重方法可提高诊断效率并支持及时的治疗决策。为填补这一空白，本研究旨在开发和初步验证一种多重实时PCR（qPCR）方法，用于同时检测具有媒介传播疾病临床怀疑的犬中的D. immitis、D. repens、E. canis、A. phagocytophilum和A. platys。
研究背景方面，犬媒介传播疾病（CVBDs）由蜱、蚊、蚤、虱和白蛉等吸血节肢动物传播的多种病原体引起，近几十年来在欧洲的传播范围不断扩大，气候变化、城市化、国际贸易与犬只流动等因素共同驱动了媒介和病原体分布模式的变化。在欧洲最常见的CVBDs包括Ehrlichia spp.、Anaplasma spp.和Dirofilaria spp.引起的疾病，其中Ehrlichia canis引起犬单核细胞埃立克体病，Anaplasma phagocytophilum和Anaplasma platys分别引起粒细胞无形体病和犬感染性周期性血小板减少症，Dirofilaria immitis和Dirofilaria repens分别引起心肺恶丝虫病和皮下恶丝虫病，且这些病原体均有人兽共患潜力。目前诊断面临的主要问题在于：这些疾病临床表现谱广泛，从非特异性到严重或致死，合并感染时尤为复杂；亚临床感染和缺乏特征性发现进一步增加诊断难度；传统诊断技术如血涂片、血清学和微丝蚴检测在早期或亚临床感染中存在明显局限，可能导致假阴性或交叉反应；分子诊断方法虽提高了敏感性和特异性，但能同时检测多种病原体的方法仍然有限。因此，研究人员旨在开发和初步验证一种多重实时PCR（qPCR）方法，用于同时检测犬中的D. immitis、D. repens、E. canis、A. phagocytophilum和A. platys。
在技术方法方面，研究人员首先评估了不同引物和杂交探针组合，靶向cox1、ITS1、ITS2、16S rRNA基因和groEL基因，使用Primer3软件设计新引物和探针，以实验感染和自然感染犬的DNA样本及参考菌株作为阳性对照，在CFX96梯度qPCR仪上优化引物浓度（0.10–50 mM）、探针浓度（0.05–0.50 mM）和退火温度（55.0–62 °C），为每个靶标分配不同荧光检测通道（Cy5、Cy5.5、FAM、HEX、ROX），并评估检测限、分析特异性、重复性和再现性。临床应用中，2024至2025年间从意大利坎帕尼亚地区招募108只具有媒介传播疾病临床怀疑的症状性犬（32只犬舍犬和76只家养犬），纳入标准为存在与媒介传播疾病相容的一般临床症状和/或皮肤病变，年龄≥1岁且前六个月内未接受抗寄生虫、抗微生物或抗炎治疗。所有样本进行改良Knott试验检测微丝蚴，血清用三种商业ELISA检测E. canis抗体、A. phagocytophilum抗体和D. immitis抗原，DNA提取后进行终点PCR和测序作为分子参考标准，并采用STARD清单报告结果，使用Cohen's κ统计量评估技术间一致性。
研究结果方面，在多重qPCR方案开发中，研究人员通过优化引物和探针浓度及退火温度，确定最佳扩增条件为95 °C 10 min预变性，35个循环的95 °C 30 s和55.6 °C 30 s退火，D. immitis采用ITS1位点、D. repens采用ITS2位点、E. canis和Anaplasma spp.采用16S rDNA，所有五种病原体的结果可在约70分钟内获得，而终点PCR每个病原体约需90分钟且还需额外测序时间。该多重qPCR表现出高重复性和再现性（同一运行内CV=3%，两次运行间CV=4%），分析特异性为100%（五种靶标间无交叉扩增），检测限分别为D. immitis和D. repens 1微丝蚴/μl、Ehrlichia spp. 3.6 pg/μl、Anaplasma spp. 0.5 ng/μl。在首次临床应用部分，研究人员对108只犬的样本采集分析显示，入组犬年龄2至16岁（平均5.6岁），41只雌性、67只雄性，69.4%生活在那不勒斯，最常见的临床改变为淋巴结肿大和皮肤病变（各占43.1%），其次为体重减轻（29.2%）、眼部病变（15.3%）、关节炎（9.7%）和脾肿大（1.4%）；血液学和血清生化改变在阳性和阴性犬中均有观察，血小板减少在至少一种病原体阳性的7只犬和所有检测阴性的7只犬中发现，ALT升高在13只阳性犬和6只阴性犬中观察到，约半数ALP升高、高胆红素血症或尿素升高的犬对所有检测均为阴性。在实验室分析中，71/108只犬（65.7%，95% CI: 55.9–74.4%）至少对一种病原体呈阳性；Dirofilaria spp.阳性15只（13.9%），其中D. immitis 9.3%、D. repens 4.6%，均经Knott试验、终点PCR和多重qPCR确认；E. canis 36只（33.3%）至少一种技术阳性，ELISA阳性28.7%，多重qPCR阳性14.8%并经终点PCR和测序确认，5份qPCR和终点PCR阳性样本ELISA阴性，3份ELISA和qPCR阳性样本（平均Ct=25）终点PCR阴性；Anaplasma spp. 43只（39.8%）至少一种技术阳性，ELISA阳性38.0%，多重qPCR阳性18.5%并经终点PCR确认，其中A. phagocytophilum 14.8%、A. platys 3.7%，2份qPCR和终点PCR阳性样本ELISA阴性，5份ELISA和qPCR阳性样本（平均Ct=28）终点PCR阴性；71只阳性犬中23只（32.4%）检测到合并感染，其中E. canis + A. phagocytophilum 19只（26.8%）、E. canis + A. platys 1只（1.4%）、D. immitis + A. phagocytophilum 2只（2.8%）、D. repens + E. canis + A. phagocytophilum 1只（1.4%）；实时PCR与终点PCR在所有研究病原体中显示几乎完美的一致性（κ=0.85，95% CI: 0.76–0.95）。
讨论部分，研究人员指出该多重qPCR是快速同时诊断犬恶丝虫病、埃立克体病和无形体病的有前景工具，减少了周转时间和每样本成本，与终点PCR和测序相比检测到更多阳性样本，同时保持高分析特异性、重复性和再现性。Dirofilaria spp.感染率为13.9%，与Napoli et al.（2023）报道的全国数据（17.0%）一致，但低于高度流行区Castel Volturno先前报道的75%，本研究大多数犬生活在低流行区那不勒斯省（69.4%）。分子检测Dirofilaria spp.固有地局限于循环微丝蚴感染，隐蔽感染和感染前期的感染可能不被PCR检测到，因此分子工具是犬恶丝虫病诊断的有用补充检测。对于E. canis和Anaplasma spp.，ELISA阳性率高于分子技术，与其他作者的结果相似，归因于治疗后或自然临床恢复后抗体长期持续存在。本研究中多重qPCR的总体分子流行率为E. canis 17.6%、A. phagocytophilum 19.4%、A. platys 3.7%，高于意大利先前分子调查报道的值（E. canis 2.9%–9.7%、A. phagocytophilum 0%–5.1%、A. platys 0.8%），但与Trotta et al.（2009）在意大利南部报道的E. canis 13.0%和A. platys 4.3%相当，证实这两种病原体在南部比北部更流行。然而，本研究并非主要旨在估计这些病原体的流行率，结果应谨慎解释，因为研究人群完全由具有CVBDs怀疑的症状性犬组成。尽管多重qPCR和终点PCR加测序在所有病原体中显示几乎完美的一致性，仍观察到一些不一致结果：3份E. canis样本和5份A. phagocytophilum样本qPCR阳性但终点PCR阴性，阳性样本Ct值一般为12–22，而不一致样本Ct值较高，提示靶DNA量较低可能导致扩增差异，但这一解释应谨慎考虑，因为两种方法均未被视作确定性金标准；需要更大样本量和不同流行病学环境的更多样化犬群进一步评估该多重qPCR的诊断性能。入组犬的临床和临床病理改变大多轻微且非特异性，血小板减少（20.3%）是埃立克体病和无形体病最常见的实验室发现，肝酶轻度升高、轻度高胆红素血症、低白蛋白血症和非再生性贫血也有报道，但在本研究中这些改变在感染和未感染犬中均有观察，相当比例的受影响犬（大多数改变的三分之一至一半）对所有研究的病原体检测阴性，因此不能归因于所检测的病原体，也可能源于其他状况；同样，血清尿素孤立性升高而肌酐在所有犬中均在参考范围内，不提示肾功能障碍，可能反映肾外原因；总体而言，缺乏特异性临床和临床病理发现以及不同媒介传播病原体引起的实验室异常重叠，凸显了病因学诊断的必要性，并支持在具有CVBDs临床怀疑的犬中使用多重分子方法。近期已开发多种多重分子检测用于犬媒介传播病原体诊断，尤其用于同时检测Ehrlichia spp.、Anaplasma spp.、Babesia spp.和Hepatozoon canis，这些研究证明多重方法以高分析敏感性和特异性提高诊断效率，然而上述研究仅关注蜱传病原体检测，而本研究描述的多重qPCR允许对可能使临床表现复杂化的蜱传和蚊传感染进行整合诊断。结论部分翻译如下：总之，本研究描述的多重qPCR是快速、灵敏且同时检测犬中主要重要媒介传播病原体的有价值诊断工具。其在常规诊断中的应用可能对改善疑似CVBD病例的诊断非常有用，尤其在流行区，也可更好地控制合并感染。需要包括更大样本量和不同流行病学环境的进一步研究来确认这些初步发现并评估该检测在大规模现场应用中的性能。
