《International Journal of Immunopathology and Pharmacology》：Ayanin attenuates thioacetamide-induced liver toxicity in vivo: Modulation of oxidative stress, inflammation, and apoptosis
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背景：Ayanin是一种从多种植物中分离得到的O-甲基化黄酮醇，以其体外抗氧化和抗炎特性而受到关注。然而，关于其毒性特征和保肝作用的研究较为缺乏。目的：因此，本研究在硫代乙酰胺（TAA）诱导的大鼠肝毒性模型中考察Ayanin的急性毒性和保肝作用，并探讨其与细胞
背景：Ayanin是一种从多种植物中分离得到的O-甲基化黄酮醇，以其体外抗氧化和抗炎特性而受到关注。然而，关于其毒性特征和保肝作用的研究较为缺乏。目的：因此，本研究在硫代乙酰胺（TAA）诱导的大鼠肝毒性模型中考察Ayanin的急性毒性和保肝作用，并探讨其与细胞过程调控的关联。设计：急性毒性评估包括对大鼠单次口服给予250和500 mg/kg Ayanin，并定期观察14天。在保肝实验中，大鼠每日口服（p.o.）给予50 mg/kg水飞蓟素、20 mg/kg Ayanin或40 mg/kg Ayanin，同时腹腔注射（i.p.）200 mg/kg TAA（每周2次），持续两个月。结果：结果表明，高达500 mg/kg的Ayanin无毒性效应，且Ayanin（20和40 mg/kg）具有明显的保肝作用，可维持体重/肝脏重量指数和肝脏组织架构（降低肝纤维化表型，包括出血、减轻脾脏充血/坏死和胶原生成）。这些效应与其抗氧化作用（上调超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化氢酶（CAT）并降低丙二醛（MDA）水平）和抗炎作用（降低肿瘤坏死因子-α（TNF-α）和白细胞介素-6（IL-6））相一致。Ayanin（20和40 mg/kg）的抗凋亡作用经证实可显著（p<0.001）降低Bax水平10.20%和34.04%；降低caspase-3水平26.02%和47.74%；同时分别使Bcl-2浓度升高107.51%和122.55%，最终改善肝功能。结论：结果表明，Ayanin表现出抗纤维化作用，归因于与氧化应激、炎症和凋亡相关的协同通路。
研究背景方面，慢性肝病是全球重大健康问题，影响5800万人，每年导致超过200万人死亡，占全球死亡人数的4%以上。肝纤维化是肝硬化发生前的常见肝脏炎症状态，通常由慢性酒精中毒、非酒精性脂肪性肝病（NAFLD）、乙型肝炎或丙型肝炎病毒感染引起。在肝纤维化过程中，肝星状细胞（HSC）活化后产生大量细胞外基质（ECM）并释放过量的I型和III型胶原，导致组织瘢痕形成、纤维生成/纤维溶解和间隔形成，是肝硬化或肝细胞癌的早期过程。促纤维化细胞因子如转化生长因子-β（TGF-β）由辅助性T细胞、B细胞和Kupffer细胞释放，增强胶原和ECM的产生，导致严重的肝组织损伤/纤维化。氧化应激（活性氧（ROS））可刺激多种炎症相关通路，包括丝裂原活化蛋白激酶（MAPK），促进炎症介质（活化的巨噬细胞、细胞因子和单核细胞）的产生/迁移，通过增加ECM和生长因子如TGF-β的释放导致器官实质损伤，从而维持纤维化反应。现代科学研究揭示肝纤维化涉及多种细胞/分子改变，如细胞凋亡、炎症和肠道屏障因子的变化。此外，凋亡的肝细胞分泌高迁移率族蛋白B1（HMGB-1），可与白细胞介素-1β（IL-1β）、脂多糖（LPS）等促炎化学物质复合而引发炎症。研究人员证实LPS与Toll样受体4（TLR4）结合可激活HSC，在肝组织中产生过量的ECM/胶原。肠道黏膜通透性可通过紧密连接蛋白损伤而改变，这些蛋白与肌动蛋白细胞骨架共同构成肠黏膜上皮屏障。肠道微生物群紊乱促进LPS和细菌DNA经门静脉进入肝脏，通过TLR4激活大量Kupffer细胞/HSC，此外由于脾/肝轴紊乱，炎症细胞从渗漏的肠道和脾脏到达肝脏，共同形成恶性炎症循环。硫代乙酰胺（TAA）是一种有机硫化合物，可有效诱导肝毒性和肝纤维化/肝硬化。TAA经肝脏代谢（CYP450 2E1酶或含黄素单加氧酶途径）后生成硫代乙酰胺-S-氧化物和硫代乙酰胺-S,S-二氧化物，削弱肝脏防御机制和肾脏排泄功能，在解毒/清除这些毒性物质过程中增强ROS的产生。持续的ROS产生导致氧化应激和核因子-κB（NF-κB）的激活，与DNA片段结合并调控众多生长因子、细胞因子/趋化因子和凋亡蛋白的表达。TAA介导的动物肝毒性与人肝毒性病理变化高度相似且不可逆，已被用作评估潜在抗纤维化疗法的可靠模型。另一方面，水飞蓟素是一种来自水飞蓟的天然抗氧化剂，作为保肝/化学保护剂有着悠久的历史。尽管药物创新不断，当前应用的药物resmetirom未能带来令人满意的医疗效果，且伴随多种副作用（腹泻、恶心和呕吐）。因此，寻找能够抑制氧化应激、炎症和凋亡通路的新活性成分已成为为肝病提供更好/更安全治疗手段的持续使命。近年来，来源于方剂或复合物的天然产物作为肝病治疗创新的来源引起了广泛关注。作为天然多酚化合物，黄酮类化合物表现出显著的生物活性谱，因其抗氧化和抗炎作用而备受关注。Ayanin（槲皮素-3,7,4′-O-三甲醚）是从多种植物中分离的主要生物黄酮类化合物，包括Croton schiedeanus Schlecht、Callicarpa nudiflora和Clerodendrum infortunatum，这些植物在传统医学中有多种药用用途，用于对抗炎症、感染和肝脏疾病等人类健康缺陷。近期研究揭示了其多种生物学潜力，包括抗哮喘、抗菌、抗炎和抗免疫球蛋白、抗氧化、血管舒张、抗癌和抗肾上腺素能作用，这归因于其对多种细胞过程（P53/Bax/caspase-3）、NF-κB相关通路和NO/环磷酸鸟苷机制的调节作用。这些机制改变提示Ayanin可能具有抗纤维化作用；因此，为提供保肝作用的科学数据和检验其致死剂量（LD50）范围，本研究旨在探索Ayanin在TAA诱导的大鼠肝毒性中的急性毒性和保肝作用，通过组织病理学、免疫含量和生化评估描绘机制事件。
研究人员开展了以下研究：急性毒性实验按照OECD指南，将36只健康雌雄大鼠随机分为3组，分别单次口服给予生理盐水、250 mg/kg Ayanin或500 mg/kg Ayanin，观察14天。保肝实验将30只雄性大鼠随机分为5组（n=6）：对照组、TAA阳性组、水飞蓟素组（50 mg/kg/天，p.o.）、低剂量Ayanin组（20 mg/kg/天，p.o.）和高剂量Ayanin组（40 mg/kg/天，p.o.），除对照组外各组同时接受TAA（200 mg/kg，i.p.，每周2次）注射60天以诱导肝纤维化。研究得出以下结论：Ayanin在高达500 mg/kg剂量下无毒性效应，可被视为未观察到不良效应水平（NOAEL）；Ayanin（20和40 mg/kg）通过抗氧化（上调SOD和CAT、降低MDA）、抗炎（降低TNF-α和IL-6、升高IL-10）和抗凋亡（降低Bax和caspase-3、升高Bcl-2）机制发挥保肝作用，改善肝功能指标，减轻肝纤维化和组织损伤。重要意义在于：Ayanin具有作为抗纤维化进展和肝组织损伤治疗药物的潜力，为肝病尤其是早期肝纤维化患者提供了基于抗氧化治疗的转化基础。
研究人员为开展研究用到以下主要关键技术方法：急性毒性评估按照OECD指南进行单次口服给药并观察14天（检测运动、流涎、震颤、竖毛、社交互动减少和刺激反应等毒性表现及死亡率），记录体重和食物摄入，第14天处死后对肝脏和肾脏进行显微镜检查。保肝实验采用TAA诱导肝毒性模型，通过计算机生成的随机数字序列分组，每日口服给药并每周两次腹腔注射TAA持续60天。主要技术方法包括：苏木精-伊红（H&E）染色和Masson三色染色进行肝脏和脾脏组织病理学检查，使用ImageJ软件定量纤维化面积百分比；商业ELISA试剂盒检测肝组织匀浆中SOD、MDA、CAT含量以及TNF-α、IL-6、IL-10和Bax、caspase-3、Bcl-2含量；全自动生化分析仪检测血清肝酶（AST、ALT、ALP）、总蛋白、白蛋白和胆红素。动物来源于Hawler医学大学研究单位，为8-10周龄Sprague-Dawley大鼠。研究经Erbil Polytechnic University伦理委员会批准（编号92，2026年1月12日）。
研究结果方面，3.1急性毒性：按照OECD标准423进行Ayanin 250和500 mg/kg限量试验，14天内未观察到治疗相关毒性体征或症状，无死亡率，食物摄入、饮水量和体重与正常对照大鼠相当，一般行为包括社交互动正常，肝脏和肾脏组织学检查未见组织异常、炎症或细胞死亡，因此250和500 mg/kg可被视为NOAEL，并以此为基础计算保肝实验的每日剂量（250的10%或在其附近），即20和40 mg/kg。3.2保肝作用：3.2.1体重和肝脏重量：TAA接种两个月使阳性对照组体重较初始下降18.64%，水飞蓟素或Ayanin（20和40 mg/kg）使体重分别增加12.15%、5.57%和13.39%；TAA阳性组肝脏和脾脏分别比正常对照增大152.72%和123.8%，水飞蓟素或Ayanin（20和40 mg/kg）使肝脏指数分别降低49.50%、35.39%和43.02%，脾脏指数分别降低46.80%、31.90%和38.29%。3.2.2肝组织结构：H&E和Masson三色染色显示正常对照大鼠肝组织排列规则，阳性对照组出现严重组织损伤，中央静脉周围形成大纤维间隔（瘢痕组织），单核炎症细胞/白细胞浸润增加，空泡化增加，内皮穿透过度，核模糊，窦状隙毛细血管化；水飞蓟素或Ayanin（20和40 mg/kg）以剂量相关方式减轻TAA诱导的肝组织损伤。脾脏组织方面，阳性对照组白髓增生、血管空泡化、红髓巨核细胞增生、充血/坏死和淋巴样元素增加，Ayanin（20和40 mg/kg）逆转了TAA诱导的脾毒性。3.2.3细胞外基质蛋白：Masson三色染色显示阳性对照组肝组织纤维增生增加，中央小叶区蓝色区域增多，细胞外间隙胶原沉积增加形成纤维间隔和再生结节；计算机估算显示阳性对照组组织纤维化百分比增加至69%，而水飞蓟素或Ayanin（20和40 mg/kg）组分别显著降低至32%、55%和37%。3.2.4肝脏抗氧化剂和氧化应激：TAA接种两个月导致肝组织显著氧化应激，阳性对照组SOD降低58.83%、CAT降低79.53%、MDA升高128.58%；水飞蓟素或Ayanin（20和40 mg/kg）使SOD分别升高102.43%、49.57%和77.64%，CAT分别升高315%、167.4%和221%，MDA分别降低43.12%、20.99%和31.28%。3.2.5炎症细胞因子：阳性对照组TNF-α升高86.69%、IL-6升高255.84%、IL-10降低255.84%；水飞蓟素或Ayanin（20和40 mg/kg）使TNF-α分别降低30.88%、12.50%和19.58%，IL-6分别降低63.97%、40.39%和50.52%，IL-10分别升高82.61%、27.96%和43.35%。3.2.6凋亡蛋白：阳性对照组Bax升高124.6%、caspase-3升高152.84%、Bcl-2降低68.92%；水飞蓟素或Ayanin（20和40 mg/kg）使Bax分别降低41.55%、10.20%和34.04%，caspase-3分别降低53.48%、26.02%和47.74%，Bcl-2分别升高215%、107.51%和122.55%。3.2.7肝脏生化指标：阳性对照组ALP、ALT和AST分别比正常对照升高253.16%、258%和264.7%，血清胆红素升高1400%，总蛋白降低50.14%，白蛋白降低62.23%；Ayanin（20和40 mg/kg）以剂量依赖方式恢复肝功能参数，40 mg/kg Ayanin组与水飞蓟素组无显著差异。
讨论部分总结：研究人员预期Ayanin具有无毒效应，如同其他众多已研究的酚类化合物，归因于其天然来源和与无害糖苷酚类化合物的结构相似性。本研究确定Ayanin的NOAEL为500 mg/kg，归类为第四类无毒化合物。14天定期观察结果与组织学分析一致。既往初步急性毒性结果显示单次腹腔注射Ayanin（50-500 mg/kg）未导致小鼠毒性或死亡率。Lee等表明口服Ayanin（30-100 μmol/kg）在卵白蛋白诱导的气道高反应性大鼠模型中几乎没有或没有副作用。这些发现与先前关于O-甲基化黄烷醇（异鼠李素、ombuin、鼠李素和山柰素）的毒性结果一致， highlighting其安全边际增加和NOAEL剂量（500 mg/kg）。保肝实验确定了Ayanin在TAA诱导的肝毒性大鼠中通过调节氧化应激、炎症和凋亡等相互关联机制发挥明显的抗纤维化潜力。TAA腹腔注射两个月引发了与人肝毒性相似的多细胞改变和组织损伤。本研究中TAA接种导致肝组织结构、体重、肝脏指数和脾脏指数显著变化。Ayanin治疗组体重、肝脏表面光滑度和肝/脾指数显著恢复，且显著优于阳性对照组。TAA接种引起明显组织学改变、变性、炎症细胞浸润、细胞内空泡化、坏死和ECM/胶原沉积增加，Ayanin组显著减轻。氧化应激是重要的HSC激活因素，由直接ROS分子或高反应性醛（脂质过氧化）产物MDA诱导。ROS可通过介导免疫和炎症细胞释放促炎细胞因子增强肝细胞死亡，直接刺激HSC增殖和ECM/胶原沉积。本研究中TAA接种导致肝组织显著氧化应激，而Ayanin治疗通过上调SOD和CAT及降低脂质过氧化副产物减轻了这些氧化还原状态改变。慢性肝脏疾病与炎症相关。TNF-α和IL-6是促炎细胞因子，通过促进ECM/胶原形成加剧肝纤维化。本研究中TAA接种引起显著炎症，表现为IL-6和TNF-α产生增加和IL-10水平抑制，表明脾/肝轴改变。Ayanin治疗以剂量依赖方式改善TAA介导的肝脏炎症。肝纤维化是与肝细胞死亡（坏死/凋亡）上调相关的同步细胞/组织损伤。TAA接种通过上调Bax、caspase-3和抑制Bcl-2引发HSC活化和聚集。Ayanin（20和40 mg/kg）每日给药抑制了TAA肝毒性大鼠的凋亡率。肝纤维化被认为是导致酶泄漏和合成/解毒功能紊乱的严重组织扭曲。本实验中阳性对照组出现严重肝功能障碍和酶泄漏，AST、ALP、ALT和胆红素升高，总蛋白/白蛋白降低。Ayanin每日给药抵抗了TAA介导的肝功能障碍，表现为酶异常降低和合成/解毒功能恢复。研究结论翻译：研究结果为Ayanin治疗有效减轻TAA诱导的大鼠肝毒性提供了有力证据。研究人员描绘了Ayanin发挥作用的主要潜在机制，主要是通过减少氧化应激、炎症和凋亡。数据揭示了Ayanin减轻TAA介导的肝组织损伤的能力（保留上皮/内皮层、改善脾/肝轴、减少组织坏死和降低ECM/胶原生成）。此外，Ayanin治疗降低了TAA介导的肝脏氧化应激，上调SOD和CAT水平，并较阳性对照显著降低MDA含量。这伴随着TAA诱导的肝脏中毒中炎症细胞因子（TNF-α和IL-6）降低和凋亡介质减少（增强Bcl-2表达并降低Bax/caspase-3蛋白）。总之，研究结果表明Ayanin作为对抗纤维化进展和肝组织损伤的治疗药物具有良好潜力。研究局限性包括动物实验时间短、测量总caspase-3以及未进行机制通路分析；因此，建议未来研究探索亚急性毒性试验（使用高达500 mg/kg）并探索机制通路包括NF-κB、Nrf2/Keap1、β-catenin、高级氧化蛋白产物，以及筛选HSC活化的分子标志物如α-平滑肌肌动蛋白（α-SMA）、I/III型胶原和/或转化生长因子-β1（TGF-β1）表达以揭示其预防作用的主要通路。临床意义：研究的临床相关性在于其对肝病患者尤其是早期阶段患者的治疗潜力。数据分析表明化学诱导的肝纤维化可能由氧化应激、炎症和凋亡引发，共同破坏脾/肝轴。在需要详细临床试验的前提下，研究结果为在肝病患者和早期肝纤维化患者中使用基于抗氧化治疗提供了转化基础。
