血脑屏障通过某些通路输送多种神经保护蛋白，而这些通路在阿尔茨海默病模型早期就已经受损

《Cell》：The blood-brain barrier imports diverse neuroprotective proteins through pathways impaired early in Alzheimer’s disease models

亮点
• 生物正交化学和蛋白质组学技术绘制了血脑屏障的转运组图谱
• 每种可穿透的蛋白质会定位于不同类型的脑细胞中，以支持细胞功能
• 在阿尔茨海默病模型中，血脑屏障的运输功能障碍很早就出现了
• 来自肝脏的APOA1与星形胶质细胞的ABCA1结合，可以恢复小鼠的阿尔茨海默病相关功能障碍

摘要
血脑屏障（BBB）主要通过它排斥什么来定义，但生理性的血液到大脑的蛋白质运输的规模和功能仍大部分未知。利用生物正交蛋白质组学技术，我们发现健康的血脑屏障允许191种血浆蛋白进入大脑实质，并仅有92种蛋白能够穿过屏障。这些蛋白质具有载体和代谢功能，它们会定位于不同的脑细胞类型，例如载脂蛋白A1（APOA1）会定位于星形胶质细胞，而α-1抗胰蛋白酶（SERPINA1）会定位于小胶质细胞。这种细胞类型的特异性依赖于血脑屏障与脑实质之间的受体传递：APOA1通过SR-B1跨过血脑屏障，并与星形胶质细胞的ATP结合盒转运蛋白A1（ABCA1）结合，后者是阿尔茨海默病的一个关键风险基因，能促进胆固醇的排出，从而维持突触的完整性。与LPS诱导的非特异性泄漏不同，在早期5xFAD小鼠模型中，血脑屏障的运输发生了选择性重塑，表现为APOA1的减少和SERPINA1的增加。肝脏源性APOA1的过表达可以恢复5xFAD小鼠的APOA1水平，进而改善星形胶质细胞、突触和行为缺陷。这些发现将血脑屏障重新定义为一种选择性的界面，能够招募具有神经保护作用的循环蛋白以维持大脑健康。

引言
血脑屏障（BBB）建立了大脑与身体之间的联系。传统上，血脑屏障被认为是一种严格且高度选择性的屏障，通过限制血液中的分子来维持中枢神经系统（CNS）的稳态。

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……

然而，新兴证据表明外围因素可以影响大脑的衰老和神经退行性变。此外，一些蛋白质如APOA1和SERPINA1的运输机制也在疾病早期就发生了改变。我们的研究发现，健康的血脑屏障允许191种血浆蛋白进入大脑，并且有92种蛋白能够穿过屏障。这些蛋白质具有特定的细胞靶向性，例如APOA1会定向到星形胶质细胞，而SERPINA1会定向到小胶质细胞。这种细胞靶向性依赖于血脑屏障与脑实质之间的受体传递。大脑组织被取出后，与Tz-PEG4-biotin在体外反应，利用链霉亲和素进行标记蛋白的pull-down实验，随后进行珠子上消化和LC-MS/MS分析。(B) 生物正交化学策略：血浆蛋白用NHS-PEG4-TCO标记，然后通过IEDDA反应与Tz-PEG4-biotin结合，利用链霉亲和素进行富集和检测。(C和D) 银染（C）和相对条带强度的定量（D），以评估四种条件下TCO-Tz点击反应的特异性（泳道1-4）（n = 6）。(E和F) 银染（E）和相对条带强度的定量（F），比较四种条件下TCO-Tz和生物素在血浆中的检测灵敏度（泳道1-4）（n = 6）。(G) 工作流程示意图，比较静脉注射PBS、生物素标记的血浆或TCO标记的血浆后，分离大脑血管中血浆信号的检测灵敏度。(H和I) 免疫组化（IHC）染色，检测血浆信号（链霉亲和素-647，白色）和血管结构标记物CD31（绿色）、AQP4（洋红色）和DAPI（蓝色）在注射PBS、生物素标记的血浆或TCO标记的血浆的WT小鼠中的表达（H；比例尺，20 μm），并量化分离血管中链霉亲和素-647的相对平均强度（I）（n = 4）。(J) 工作流程示意图，比较静脉注射PBS、生物素标记的血浆或TCO标记的血浆后，大脑切片中血浆信号的检测灵敏度。(K–N) IHC染色，检测血浆信号（链霉亲和素-647，白色）以及细胞类型标记物pan-neuron（神经元，红色）、GFAP（星形胶质细胞，红色）和Iba-1（小胶质细胞，红色）和DAPI（蓝色）在注射PBS、生物素标记的血浆或TCO标记的血浆的WT小鼠中的表达（K；比例尺，5 μm），并量化神经元（L）、星形胶质细胞（M）和小胶质细胞（N）中链霉亲和素-647的相对平均强度（n = 4）。统计分析：所有比较均采用单因素ANOVA和Bonferroni事后检验。条形图显示平均值±SEM。具体p值在相应位置标注。

我们将这种基于点击化学的策略与常用的NHS-PEG4-biotin标记方法进行了基准测试（图S3G）。与生物素标记方法相比，TCO在血浆和大脑血管中始终产生更强的 Signal（图1E–1I和S3H–S3O），并能够有效检测神经元、星形胶质细胞和小胶质细胞中的血浆蛋白，而在相同条件下生物素标记方法未能检测到任何实质组织信号（图1J–1N）。经过进一步的质谱工作流程优化后（图S4A），TCO的优越性体现在两个方面：首先，TCO具有更高的灵敏度，能够识别446种血浆蛋白，而生物素标记方法只能识别326种（图S4B–S4G）；其次，TCO具有更高的特异性，因为生物素是一些内源性转运蛋白的底物，例如钠依赖性多种维生素转运蛋白（SMVT）。

我们将这种基于点击化学的策略与常用的NHS-PEG4-biotin标记方法进行了基准测试（图S3G）。与生物素标记方法相比，TCO在血浆和大脑血管中始终产生更强的 Signal（图1E–1I和S3H–S3O），并能够有效检测神经元、星形胶质细胞和小胶质细胞中的血浆蛋白，而在相同条件下生物素标记方法未能检测到任何实质组织信号（图1J–1N）。经过进一步的质谱工作流程优化后（图S4A），TCO的优越性体现在两个方面：首先，TCO具有更高的灵敏度，能够识别446种血浆蛋白，而生物素标记方法只能识别326种（图S4B–S4G）；其次，TCO具有更高的特异性，因为生物素是一些内源性转运蛋白的底物，例如钠依赖性多种维生素转运蛋白（SMVT）。1991; 259:66-70 摘要 全文（PDF）PubMed Google Scholar, 3333。Jefferies, W.A. ? Brandon, M.R. ? Hunt, S.V. ...脑毛细血管内皮上的转铁蛋白受体 Nature. 1984; 312:162-163 Crossref Scopus (984) PubMed Google Scholar 与我们方法一起验证的候选因子还包括APOA1和α-1抗胰蛋白酶（SERPINA1）。92种可渗透蛋白主要来自肝脏、脂肪组织和肠道（图2E）。功能注释 Mi, H. ? Muruganujan, A. ? Huang, X. ...使用PANTHER分类系统（v.14.0）进行的大规模基因组和基因功能分析协议更新 Nat. Protoc. 2019; 14:703-721 Crossref Scopus (1197) PubMed Google Scholar, 6666。Thomas, P.D. ? Ebert, D. ? 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这些结果揭示了一个有序的系统，该系统将外周蛋白质引导至特定且功能相关的脑细胞群体。

接下来，我们研究了APOA1在星形胶质细胞中的信号传导功能（图4A）。无脂质的APOA1是主要能够穿透血脑屏障的物种，并能够被星形胶质细胞迅速内化（图S17A–S17L）。大规模RNA测序显示了广泛的转录重编程：APOA1上调了与胆固醇外排和HDL颗粒组装相关的通路，同时下调了从头脂质合成和储存的通路（图4B、4C、S17M–S17Q和S18A）。

研究表明，外周来源的APOA1具有神经保护功能。我们进一步探讨了APOA1在星形胶质细胞中的作用机制：APOA1增加了胆固醇的外排，从而减少了α-淀粉样蛋白的沉积（图4H–4K和S18B–S18E）。在体内实验中，APOA1敲除小鼠的星形胶质细胞表现出异常的脂质代谢和炎症反应（图S18I和S18J）。APOA1阻断剂ABCAs阻断了APOA1的内化和脂质减少作用，但不影响其他内吞过程（图S18U–S18Z），这证实了APOA1在星形胶质细胞中的主要作用机制是调节胆固醇代谢。

APOA1还通过影响星形胶质细胞的转录谱来调节神经元功能。研究发现，APOA1上调了与胆固醇外排相关的基因通路，并减少了细胞内的脂质水平（图4D–4G和S18B–S18E）。此外，APOA1还促进了神经元的胆固醇含量和PSD-95蛋白的表达（图4Q、4R和4S），以及突触结构的完整性（图4T–4W）。

这些发现表明，APOA1在阿尔茨海默病的发展中起着关键作用，通过调节星形胶质细胞的胆固醇代谢和炎症反应来影响神经元的功能和结构。

总之，APOA1在阿尔茨海默病的发生和发展过程中扮演着重要的角色，其作用机制涉及多个生物学过程，包括调节星形胶质细胞的脂质代谢和炎症反应，以及影响神经元的结构和功能。确切的p值在相应位置标注。另请参见表S6。我们通过注射荧光标记的APOA1和SERPINA1来验证这些发现（图5G和S21I）。与蛋白质组学数据一致，5xFAD脑实质中的APOA1摄取显著减少，尤其是在星形胶质细胞中（图5H–5K、S21G和S21H）。相反，5xFAD血管和实质微胶质细胞中的SERPINA1摄取增加（图S21J和S21K–S21O），这表明是转运增强而不是被动泄漏。我们将APOA1的损失归因于两步转运失败（图5L）。在4.5个月大的5xFAD小鼠中，介导BECs体外（图S13A–S13C）和体内穿过血脑屏障（图S13D–S13R）的APOA1摄取的SR-B1显著下调（图5M–5O）。与此同时，5xFAD星形胶质细胞中的ABCA1也减少（图5P和5Q）。这种内皮转运蛋白和实质受体的双重丢失与5xFAD星形胶质细胞中的脂质积累有关，这与星形胶质细胞应激和功能障碍有关。114114.Windham, I.A. ? Powers, A.E. ? Ragusa, J.V. ...APOE输送到星形胶质细胞的脂质滴中，并调节甘油三酯饱和度和滴的大小 J. Cell Biol. 2024; 223, e202305003CrossrefScopus (78)PubMedGoogle Scholar,115115.Zhang, X. ? Chen, C. ? Liu, Y. 在阿尔茨海默病星形胶质细胞中导航代谢迷宫：脂肪酸和胆固醇过程的异常 Alzheimers Res. Ther. 2024; 16, 63CrossrefScopus (35)Google Scholar,116116.Smoli?, T. ? Tav?ar, P. ? 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这些蛋白质可能通过多种屏障界面进入大脑，包括血脑屏障（BBB）、血液-脑脊液屏障等。我们通过移除围室器官、分离来自实质的血管，并确认实质性信号均匀分布在大脑深部区域（远离脉络丛和脑膜）来区分这些途径。

在血脑屏障处，血浆蛋白质有三种不同的命运：排除、保留和进入实质。最大的一类（包括补体和凝血因子）被完全排除，这与血脑屏障的保护作用一致；第二类99种蛋白质被内皮细胞内化但不会进入实质；即使这些蛋白质也可能具有功能性作用，因为来自肝脏的APOE可以在不进入实质的情况下调节脑血管功能。此外，第三类92种能够穿透血脑屏障的蛋白质富含具有受体结合α螺旋的载体蛋白，这表明它们是通过受体介导而非被动进入的。

这些蛋白质通过多种途径进入大脑：包括血脑屏障（BBB）、血液-脑脊液屏障以及脉络丛或脑膜途径。在早期阿尔茨海默病中， BBB介导的输送机制更为显著。生物学期刊 2013; 17:393-399
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这些蛋白质具有针对脑区或细胞类型的特性。例如，SERPINA1和APOA1途径可以分别靶向递送到小胶质细胞和星形胶质细胞。我们的研究揭示了一种血液到大脑的通信方式，其中循环血浆蛋白作为外周信使，而血脑屏障作为选择性接口，整合系统信号以维持大脑健康。这种系统的破坏会导致神经退行性疾病，而其恢复可能提供潜在的治疗策略。

**研究的局限性**
我们的生物正交质谱方法无法捕获所有能穿过血脑屏障的蛋白质，特别是那些含量低、半衰期短或分子量小的蛋白质，而且血浆浓度的广泛动态范围使得精确测定其通透性变得困难。随着标记化学和质谱技术的进步，这里确定的蛋白质目录将会得到修订和扩展。一些蛋白质可能通过脉络丛或其他途径进入大脑；分析这些途径需要特定隔室的干扰或对过境蛋白质进行标记。将这种方法推广到其他神经系统疾病和人类身上仍有待验证，此外，不同物种在血脑屏障受体表达、血浆组成和屏障特性上的差异也可能进一步限制其应用。APOA1在中枢神经系统中的效应可能取决于蛋白质本身或其携带的负载物，以及它是否能在疾病后期恢复神经元功能，这目前尚不清楚。要确认APOA1在体内通过星形胶质细胞的ABCA1发挥作用，需要对星形胶质细胞进行特异性删除实验。无脂质化的APOE可能具有强烈的脂质清除能力，在培养条件下可能具有细胞毒性，因此不能完全排除非特异性膜效应，未来使用脂质化APOE的研究将有助于解决这一问题。最后，选择性血脑屏障转运机制、细胞类型特异性靶向以及摄取后的亚细胞命运仍有待确定。

**资源可用性**
如需更多信息或资源，请联系主要联系人Andrew C. Yang（[e-mail]）。

**材料可用性**
本研究中生成的所有独特试剂均可根据请求向主要联系人获取。

**数据和代码可用性**
• 原始单细胞和批量测序数据可在NCBI基因表达组数据库（GEO）中公开获取，访问号为GEO: GSE301825、GSE301828、GSE301830和GSE301832。
• 原始和处理后的蛋白质组数据已存入MassIVE数据库，包含完整的元数据和搜索参数，访问号为MSV000101330、MSV000101332、MSV000101333、MSV000101338、MSV000101339、MSV000101340和MSV000101341。
• 本文未报告任何原始代码。

**致谢**
本研究得到了美国国立卫生研究院（DP5OD033381）、阿尔茨海默病协会（ADSF-24-1345199-C）、Burroughs Wellcome基金职业奖项、Ludwig家族基金会、Cure Alzheimer’s基金（包括Cardinal Family Scholars基金的支持）、Bakar Fellows计划以及Dolby家族的支持。质谱分析由UCSF的质谱资源部门提供（负责人A.L.B.），该部门得到了Miriam和Sheldon G. Adelson医学研究基金会以及NIH-NIGMS的资助。H.Z.得到了BrightFocus基金（编号A2026013F）的支持，L.Y.得到了Larry L. Hillblom基金会（编号2023-A-020-FEL）的支持，A.P.获得了NSF研究生研究奖学金和UCSF Discovery奖学金，X.W.获得了UCSF Discovery奖学金，M.J.Y.获得了NOMIS-Gladstone奖学金。我们感谢Jack Taunton教授提供Orbitrap Eclipse仪器的使用，感谢Gladstone基因组学核心组的Mylinh Bernardi、Felicia Miller和Horng-Ru Lin的帮助，以及James B. Pendleton慈善信托基金的支持。我们还要感谢Cold Spring Harbor Laboratory Brain Barriers 2025会议和Jackson Laboratory VCID研讨会的参与者，以及Yang实验室的成员Nalini Rao、William Xie和Runa Cheng提供的反馈和支持。图表使用BioRender.com制作，已获得许可。

**作者贡献**
A.C.Y.和H.Z.构思了这项研究。H.Z.、A.A.和A.C.Y.开发了生物正交质谱方法。H.Z.领导了实验，包括蛋白质标记、组织分离、免疫组化和成像、原代细胞培养以及AAV的生产，得到了A.A.、X.L.、L.Y.、Z.Z.、B.D.、M.N.、J.O.、F.H.、Y.C.、S.D.、X.W.、M.J.Y.、A.P.和S. Du的支持。J.C.M.、N.-S.T.、P.S.W.、D.D.、E.F.、T.E.T.、N.T.S.、T.H.C.和A.L.B.生成了质谱数据。H.Z.、J.C.M.和A.J.P.领导了蛋白质组数据的计算分析。H.Z.、M.B.、B.D.、J.O.和A.J.P.领导了批量和单细胞测序及转录组分析。L.D.、I.L.和J.S.领导了行为测定和分析工作。H.Z.和A.C.Y.撰写了论文，并总结了所有作者的贡献。T.E.T.、N.T.S.、T.H.C.、A.L.B.和A.C.Y.监督了整个研究。

**利益声明**
A.C.Y.是Traverse Therapeutics的学术创始人。

**STAR★ 方法**
**关键资源表格**

**试剂或资源**
**来源标识符**
抗AQP4抗体：Proteintech Cat#16473-1-AP; RRID:AB_2827426
抗GFAP抗体：Proteintech Cat#23935-1-AP; RRID:AB_2879367
抗Iba-1抗体：Wako Cat#019-19741; RRID:AB_839504
抗MAP2抗体：Cell Signaling Technology Cat#4542S; RRID:AB_1069378
抗PSD95抗体：Cell Signaling Technology Cat#2507S; RRID:AB_561221
抗S100β抗体：Abcam Cat#ab52642; RRID:AB_882426
抗TREM2抗体：Cell Signaling Technology Cat#55739S; RRID:AB_3095850
抗白蛋白抗体：Cell Signaling Technology Cat#4929S; RRID:AB_222578
抗NeuN抗体：Cell Signaling Technology Cat#24307S; RRID:AB_2651140
抗Caveolin-1抗体：Cell Signaling Technology Cat#3267S; RRID:AB_2275453
抗MBP抗体：Cell Signaling Technology Cat#78896S; RRID:AB_2799920
抗Na, K-ATPase抗体：Cell Signaling Technology Cat#3010S; RRID:AB_206098
抗β-actin抗体：Cell Signaling Technology Cat#4967S; RRID:AB_330288
抗GAPDH抗体：Cell Signaling Technology Cat#2118S; RRID:AB_561053
抗SR-B1的Alexa Fluor 647抗体：Novus Biologicals Cat#NB400-104AF647; RRID:AB_3188128
抗SR-B1抗体：Invitrogen Cat#PA1-31393; RRID:AB_2182826
小鼠Milli-Mark Pan神经元标记物：Sigma-Aldrich Cat#MAB2300; RRID:AB_1587299
抗PSD95抗体：Cell Signaling Technology Cat#36233S; RRID:AB_2721262
抗CD31抗体：BD Biosciences Cat#550274; RRID:AB_393571
抗CD45的Rat PE/Cy7抗体：BioLegend Cat#103114; RRID:AB_312979
抗CD31的Rat PE CF594抗体：BD Biosciences Cat#563616; RRID:AB_2738320
抗ACSA-2抗体：Miltenyi Biotec Cat#130-123-284; RRID:AB_2811488
抗CD11b的Rat Brilliant Violet 711抗体：BioLegend Cat#101242; RRID:AB_2563310
抗CD11b的Rat Brilliant Violet 605抗体：BD Biosciences Cat#740356; RRID:AB_2740088
抗CD11b的Rat Alexa Fluor 700抗体：BioLegend Cat#101222; RRID:AB_493705
抗ABCA1的Rat Alexa Fluor 647抗体：Novus Biologicals Cat#NB400-165AF647; RRID:AB_3188621
抗CD31的Rat Alexa Fluor 488抗体：BioLegend Cat#102414; RRID:AB_493408
抗-rat IgG的Goat Alexa Fluor 488结合物：Abcam Cat#ab150149; RRID:AB_3718136
抗-rat IgG的Goat Alexa Fluor 594结合物：Cell Signaling Technology Cat#8889S; RRID:AB_2716249
抗-rat IgG的Goat Alexa Fluor 568结合物：Invitrogen Cat#A-11011; RRID:AB_143157
抗-mouse IgG的Goat HRP结合物：Jackson ImmunoResearch Cat#115-035-003; RRID:AB_10015289
抗-rabbit IgG的Donkey Alexa Fluor 555结合物：Thermo Scientific Cat#A-31572; RRID:AB_162543
抗-rabbit IgG的Donkey Alexa Fluor 555结合物：Thermo Scientific Cat#A-21422; RRID:AB_141822
抗-rabbit IgG的Donkey Alexa Fluor 488结合物：Invitrogen Cat#A-21202; RRID:AB_141607
抗-rabbit IgG的Donkey Alexa Fluor 488结合物：Invitrogen Cat#A-21206; RRID:AB_2535792
抗-rabbit IgG的Donkey HRP结合物：Jackson ImmunoResearch Cat#711-035-152; RRID:AB_10015282

**细菌和病毒株**
pAAV-2/8：Addgene Cat#112864; RRID>Addgene_112864
pUCmini-iCAP-PHP.V1：Addgene Cat#127847; RRID:Addgene_127847
pUCmini-iCAP-PHP.eB：Addgene Cat#103005; RRID:Addgene_103005
pAAV-helper：Agilent Cat#240071
pAAV-TBG-eGFP：Addgene Cat#105535; RRID:Addgene_105535
mApple-N1：Addgene Cat#54567; RRID:Addgene_54567
pAAV-TBG-APOA1：本文基于pAAV-TBG-eGFP自研

**实验模型**
**细胞系**
原代小鼠小胶质细胞：本文
原代小鼠星形胶质细胞：本文
原代小鼠神经元：本文
原代小鼠脑内皮细胞：本文
人胚胎肾293T细胞系（HEK293T）：ATCC Cat#CRL-3216; RRID:CVCL_0063

**生物化学试剂**
250 mM EDTA：Thermo Scientific Cat#155750
蛋白酶抑制剂：Thermo Scientific Cat#78439
NHS-PEG4-TCO：Vector Laboratories Cat#CCT-A137-100
NHS-PEG4-Biotin：Thermo Scientific Cat#21362
1 M Tris-HCl：Thermo Scientific Cat#15568
252,2,2-Tribromoethanol：Sigma-Aldrich Cat#T4840
GLipopolysaccharides：Sigma-Aldrich Cat#L6511-100
MGPBS：Thermo Scientific Cat#100100
RIPA裂解缓冲液：Thermo Scientific Cat#8990
Cleanascite：Fisher Scientific Cat#NC0542
Benzonase：Sigma-Aldrich Cat#E1014-25
KU18% dextran：Thermo Scientific Cat#D882
12% BSAM：Millipore Sigma Cat#126609-100
GMParaformaldehyde 16% 水溶液：Electron Microscopy Sciences Cat#15710
Normal Donkey Serum：Jackson ImmunoResearch Cat#017-000-121
Triton X-100：Sigma-Aldrich Cat#9036-19-5
Tween-20：Thermo Scientific Cat#J20605
APDAPI：Invitrogen Cat#D21490
20 μM Tetrazine-PEG4-Biotin：Thermo Scientific Cat#NC0740
381% SDS：Fisher Scientific Cat#15-553-02
1 M KCl：Thermo Scientific Cat#AM9640
G4 M urea：Sigma-Aldrich Cat#U5378
HEPESS：Sigma-Aldrich Cat#H3375-100
G0.1% RapiGest SF溶液：Waters Cat#1860
18615 mM DL-Dithiothreitol：Sigma-Aldrich Cat#D9779-25
MG14 mM iodoacetamide：Thermo Scientific Cat#A3927
Trypsin/Lys-C混合物：Thermo Scientific Cat#PRV507
31% formic acid：Thermo Scientific Cat#2890
LDS样品缓冲液：Invitrogen样本量并非通过统计方法预先确定，但与已发表研究中常用的样本量一致。除行为测试外，未进行任何盲法处理；在行为测试中，评分实验者对基因型和处理组的交互时间不知情。所有小鼠的数据均被收集并纳入分析，未排除任何异常值。

**培养细胞**
人胚胎肾293T（HEK293T）细胞系购自ATCC（编号CRL-3216），并在实验室自家维持。HEK293T细胞在含有10%胎牛血清（FBS；Thermo Fisher Scientific，编号35-011-CV）和1%青霉素-链霉素（Fisher Scientific，编号15-140-163）的高葡萄糖DMEM（Fisher Scientific，编号10-569-044）培养基中培养。通过预期的形态学和生长特性验证HEK293T细胞系的纯度，并使用MycoAlert Mycoplasma Detection Kit（Lonza，编号LT37-118）检测其无菌性。HEK293T细胞在从ATCC接收后的15代内使用。原代BECs、星形胶质细胞和小胶质细胞从野生型（WT）小鼠大脑中分离获得。原代BECs来自6-8周大的雄性WT小鼠，购自The Jackson Laboratory。原代星形胶质细胞和小胶质细胞来自出生后第9天（P9）的混合性别WT小鼠。原代神经元来自P0或P9的混合性别WT小鼠。原代BECs在含有EGM-2 SingleQuots（Lonza，编号CC-4176）的EBM-2基础培养基中培养。原代星形胶质细胞在含有10%胎牛血清（FBS；Thermo Fisher Scientific，编号35-011-CV）和1%青霉素-链霉素（Fisher Scientific，编号15-140-163）的高葡萄糖DMEM（Fisher Scientific，编号10-569-044）中培养。原代小胶质细胞在含有10% FBS（Thermo Fisher Scientific，编号35-011-CV）和1%青霉素-链霉素（Fisher Scientific，编号15-140-163）的DMEM/F12（Gibco，编号10565018）中培养。原代神经元在含有2% B27（Thermo Scientific，编号17504044）、0.5 mM L-谷氨酰胺（Thermo Fisher Scientific，编号25030081）和1%青霉素-链霉素（Fisher Scientific，编号15-140-163）的Neurobasal培养基中培养。所有细胞系的纯度通过预期的形态学、生长特性、流式细胞术和免疫细胞化学（ICC）进行验证。所有细胞均在37°C、5% CO2的培养箱中培养。所有细胞的数据均被收集并纳入分析，未排除任何异常值。

**方法细节**
**LPS注射**
LPS（Sigma-Aldrich，编号L6511-100MG）在无菌PBS中重新配制为10 mg/mL的储备浓度，并储存在-80°C。工作溶液按先前描述的方法用无菌PBS稀释至0.2 μg/μL。

**小鼠注射LPS以模拟肠道屏障破裂后微生物产物的进入**
J. Vis. Exp. 2018; 135, 576
Crossref
Scopus (50)
Google Scholar

给药前立即称取小鼠体重，使用装有30 G针头的0.5 mL注射器以3 mg/kg体重剂量通过腹腔注射（IP）给予LPS。对照组小鼠接受相同体积的PBS腹腔注射，注射后将其放入装有补水凝胶的饲养笼中。

**血浆收集和标记**
使用250 mM EDTA（Thermo Scientific，编号15575020）作为抗凝剂，通过终末心穿刺从Alb-/-小鼠体内采集血液。血液立即倒入抗凝管（McKesson Corporation，编号1187640）中并轻轻倒置10次以防止凝结。血浆在4°C下以1,200 × g离心15分钟，离心完成后小心收集上清液并分装，用于立即使用或储存在-80°C。标记时，向小鼠血浆中加入蛋白酶抑制剂（Thermo Scientific，编号78439），使用BCA测定法（Thermo Scientific，编号23227）进行定量，然后加入12倍摩尔量的NHS-PEG4-TCO（Vector Laboratories，编号CCT-A137-100）或NHS-PEG4-生物素（Thermo Scientific，编号21362）进行标记，或加入等体积的DMSO作为未标记对照，在4°C下孵育16小时。反应后用1 M Tris-HCl（pH 8.0；Thermo Scientific，编号15568025）在室温下孵育10分钟以中和。为确保标记蛋白组的纯度，使用Zeba spin脱盐柱（Thermo Scientific，编号89894）和Amicon? Ultra-0.5离心过滤器单元（3 KDa MWCO；EMD Millipore，编号UFC503024）去除过量的标记试剂。

**血浆注射和大脑收集**
标记后的血浆通过静脉注射给予小鼠，每次注射200 μL，每次注射间隔2小时，从第一次注射到组织收集共6小时。这一最佳暴露时间窗口是通过时间进程实验确定的。小鼠用2.5%（v/v）Avertin（2,2,2-三溴乙醇，Sigma-Aldrich，编号T48402-500G）安乐死，并以10 mL/min的速度用冰冻PBS进行心脏灌注5分钟。根据实验目的收集大脑组织。对于检测血脑屏障（BBB）通透性蛋白，将大脑和脑小脑分离，小心解剖并移除具有天然屏障的区域，包括下丘脑和脉络丛。对于比较TCO和生物素标记方法，保留整个大脑。组织在干冰上快速冷冻并储存在-80°C。

**全脑裂解液制备**
从PBS注射、TCO-血浆注射和生物素-血浆注射的小鼠中提取全脑组织，加入2 mL RIPA缓冲液（Thermo Scientific，编号89901）和蛋白酶抑制剂（Thermo Scientific，编号78439）进行匀浆，然后使用3 mL注射器（Fisher Scientific，编号14-823-435）和21 G导管（Fisher Scientific，编号14-829-10D）进行超声处理（6次循环，每次3秒，振幅40%）。裂解液在4°C下以14,000 × g离心30分钟，收集上清液，并使用BCA测定法（Thermo Scientific，编号23227）标准化蛋白质浓度。一只小鼠的全脑裂解液构成一个重复实验。对于PBS和TCO-标记的血浆注射样本，裂解液在室温下与20 μM Tz-PEG4-生物素（Thermo Fisher Scientific，编号NC0740038）孵育1小时，然后用Zeba spin脱盐柱（Thermo Scientific，编号89894）去除过量试剂。生物素-血浆注射样本及其PBS注射对照组无需Tz-PEG4-生物素孵育。所有样本随后在室温下与磁 streptavidin 珠子（Thermo Scientific，编号88817）孵育1小时，然后按照以下方法洗涤和消化珠子。

**从同一大脑中分离血管和实质成分**
血管-实质分离协议改编自先前描述的方法5353.Matthes, F. ? Matuskova, H. ? Arkelius, K. ...（《一种改进的脑血管和实质物理分离方法，可用于检测血脑屏障功能障碍》，NeuroSci. 2021; 2:59-74），并进行了修改。用干净的锋利剪刀将每只小鼠的脑组织切碎，并在加入蛋白酶抑制剂（Thermo Scientific，编号78439）的1.5 mL PBS中匀浆。匀浆液在4°C下以3,000 × g离心10分钟。得到的1 mL上清液代表实质部分，加入0.3 mL含有蛋白酶抑制剂（Thermo Scientific，编号78439）的RIPA裂解液（Thermo Scientific，编号89901）并超声处理（6次循环，每次3秒，振幅40%）。裂解液用Cleanascite（Fisher Scientific，编号NC0542680；每40 μL裂解液加10 μL）处理，并在旋转器（Thermo Fisher Scientific，编号NC1856180）上以4°C孵育10分钟以去除脂质。裂解液在4°C下以15,060 × g离心10分钟以去除沉淀的脂质，得到的澄清上清液加入Benzonase（Sigma-Aldrich，编号E1014-25KU；每40 μL裂解液加7.5单位）并在旋转器上孵育30分钟以降解核酸。3,000 × g离心得到的沉淀物含有血管和髓鞘成分，将其重新悬浮在18% dextran（Thermo Scientific，编号D8821）中，并以4,347 × g离心15分钟（刹车设置为1）以去除髓鞘。含血管的沉淀物通过20 μm滤网（Millipore Sigma，编号126609-100GM）过滤，然后用3,000 × g离心10分钟以获得纯化的血管沉淀物。用于免疫荧光分析的血管在4% paraformaldehyde (PFA) 中固定。用于Western blotting和质谱（MS）的血管在含有蛋白酶抑制剂（Thermo Scientific，编号89901）的0.5 mL RIPA缓冲液中裂解，然后超声处理（5次循环，每次3秒，振幅80%）。每两只小鼠的实质或血管裂解液合并为一个重复实验（n = 6个独立池；每组共12只小鼠）。PBS注射的背景对照组、TCO标记的假阳性对照组和TCO标记的血浆注射样本的蛋白质浓度使用BCA测定法（Thermo Scientific，编号23227）进行定量，并标准化以确保每种样本类型内的蛋白质输入量一致。

**基于Tz的捕获和基于streptavidin的富集**
三种样本类型（包括血浆、血管裂解液和实质裂解液）与20 μM Tz-PEG4-生物素（Thermo Fisher Scientific，编号NC0740038）孵育。血浆样本在4°C下旋转15小时，而血管和实质裂解液在室温下孵育1小时。使用Zeba spin脱盐柱（Thermo Scientific，编号89894）去除多余的未反应Tz-PEG4-生物素。对于富集，血浆和血管样本直接在室温下与磁 streptavidin 珠子（Thermo Scientific，编号88817）孵育1小时。实质裂解液首先用甲基-Tz珠子（Thermo Fisher Scientific，编号50-238-7198）在4°C下预清洁30分钟以降低背景，然后在室温下与磁 streptavidin 珠子孵育1小时。所有样本类型先依次用含有蛋白酶抑制剂（Sigma-Aldrich，编号11836153001）和1% SDS（Fisher Scientific，编号15-553-027）的RIPA缓冲液洗涤6次，再用1 M KCl（Thermo Fisher Scientific，编号AM9640G）洗涤3次，然后用4 M尿素（Sigma-Aldrich，编号U5378）洗涤3次，每次洗涤持续10分钟。珠子重新悬浮在200 μl 0.1% RapiGest SF溶液（Waters，编号186001861）中并短暂涡旋。珠子结合的蛋白质在56°C下用5 mM DL-dithiothreitol（Sigma-Aldrich，编号D9779-250MG）还原30分钟，在室温下用14 mM iodoacetamide（Thermo Fisher Scientific，编号A39271）烷基化30分钟，然后在37°C下用0.5 μg Trypsin/Lys-C Mix（Thermo Fisher Scientific，编号PRV5073）消化过夜。含有肽的上清液用1% formic acid（Thermo Fisher Scientific，编号28905）酸化，然后储存在-80°C备用后续的质谱处理。

**血浆的高pH反相分离**
血浆样本在1.0 × 100 mm Gemini 3μ C18柱（Phenomenex，Torrance, CA）上分离。肽在缓冲液A（20 mM NH4OCH3，pH 10）中加载到柱子上，并在1.2 mL中从1%梯度递增至10.5%缓冲液B（20mM NH4OCH3，pH10 in 90% acetonitrile），然后在7.6 mL中达到35%缓冲液B，最后用1 mL 70%缓冲液B洗脱，最后平衡至1%缓冲液B。流速为80 μL/min，每份样本的体积为270 μL。

**质谱处理**
肽使用C18反相PhyTip柱（BioTage）和OT-2自动进样机器人（Opentrons）进行脱盐。脱盐后的肽在Orbitrap Exploris 480或Orbitrap Eclipse（Thermo Scientific）上进行分析，该仪器配备了UltiMate 3000 HPLC（Thermo）。肽在50-cm × 75-μm ID 2-μm C18 EASY-Spray柱上使用线性梯度从2%分离至35%溶剂B，分离时间为177分钟。在前体离子测量方面，Orbitrap分析仪（分辨率：120,000；自动增益控制目标（AGC）：Standard）的范围内，从375 m/z分离到1400 m/z（Eclipse）。每个前体离子（电荷范围2+至7+）在四极杆中进行分离（选择窗口：1.6 m/z；动态排除窗口：30 s；MIPS肽过滤器启用），并进行HCD MS2片段化（碰撞能量：30%，最大注射时间：100 ms）。扫描周期为3秒。

**MS数据分析使用MaxQuant和Perseus**
原始质谱数据使用MaxQuant（v1.5.5.1）进行分析。肽谱匹配和蛋白质组鉴定的假发现率均设定为1%，通过靶向诱饵方法确定。蛋白质强度使用MaxLFQ算法计算，该方法对所有样本进行延迟归一化和最大肽比提取。用于量化的肽包括独特肽和剃刀肽。在需要时，还计算了iBAQ值以进行绝对定量。只有至少在两个生物重复实验中鉴定的蛋白质才被保留下来进行下游分析。输出文件proteinGroups.txt、peptides.txt和evidence.txt用于量化和数据质量评估。从MaxQuant生成的proteinGroups.txt文件通过“Generic Matrix Upload”功能导入到Perseus（v2.1.5）中。所有LFQ强度列都被选为主要列。通过使用“Filter rows based on categorical column”过滤掉标记为“仅通过位点鉴定”、“反向”或“污染物”的蛋白质，从而移除了低置信度的鉴定结果。为了稳定方差和标准化数据分布，使用“Basic”菜单下的“Transform”函数对LFQ强度进行了log2转换。为了鉴定可以穿透血脑屏障（BBB）的血浆蛋白质，我们分析了六组样本：TCO标记的血浆、PBS注射的脑血管和脑实质、TCO标记的TF注射的脑实质以及TCO标记的血浆注射的脑血管和脑实质。在TCO标记的血浆组或PBS注射组中，如果超过50%的LFQ强度值缺失，则排除这些蛋白质。对于脑实质样本，使用TCO标记的TF注射的小鼠的样本作为额外的对照，以排除与脑组织非特异性结合的蛋白质。在TCO血浆注射的脑实质中富集的蛋白质进一步过滤，只保留那些平均LFQ强度显著高于TCO-TF注射组的蛋白质，从而排除非特异性的背景干扰。在Perseus中，使用其默认方法插补缺失的LFQ值，该方法从标准差向下偏移1.8的标准差的正态分布中抽样，并且宽度相对于样本分布为0.3。然后，将TCO血浆注射的血管中显著富集的蛋白质与TCO标记的血浆参考蛋白质组进行交集，以鉴定可以穿透BBB的血浆蛋白质。这个列表进一步与TCO血浆注射的脑实质中过滤后的蛋白质集进行交集，以定义可以穿透BBB的血浆蛋白质。相反，那些在TCO血浆蛋白质组和TCO血浆注射的血管组分中都显著富集但存在于脑实质中的蛋白质被归类为保留在BBB内的血浆蛋白质。使用双尾Welch’s t检验评估整个蛋白质组数据的统计显著性，并随后应用Benjamini-Hochberg假发现率（FDR）校正，以考虑多重假设检验的影响。对于在预定义的生物学优先子集（例如，可以穿透BBB的血浆蛋白质）内的下游比较，使用名义p值来评估实验条件下的动态变化（例如，WT与LPS、WT与AD）。为了评估重复性，在使用LFQ-Analyst排除缺失值超过50%的蛋白质后，计算了每个条件的生物重复实验之间的变异系数（CVs）和成对Pearson相关性。

肽谱匹配和蛋白质组鉴定的假发现率均设定为1%，这是通过目标-诱饵方法确定的。蛋白质强度使用MaxLFQ算法计算，该算法对所有样本进行延迟归一化和最大肽比提取。用于量化的肽包括独特肽和剃刀肽。在需要时，还计算了iBAQ值以进行绝对定量。只有至少在两个生物重复实验中鉴定的蛋白质才被保留下来进行下游分析。输出文件proteinGroups.txt、peptides.txt和evidence.txt用于量化和数据质量评估。从MaxQuant生成的proteinGroups.txt文件通过“Generic Matrix Upload”功能导入到Perseus（v2.1.5）中。所有LFQ强度列都被选为主要列。通过使用“Filter rows based on categorical column”过滤掉标记为“仅通过位点鉴定”、“反向”或“污染物”的蛋白质，从而移除了低置信度的鉴定结果。为了稳定方差和标准化数据分布，使用“Basic”菜单下的“Transform”函数对LFQ强度进行了log2转换。

为了鉴定可以穿透血脑屏障（BBB）的血浆蛋白质，我们分析了六组样本：TCO标记的血浆、PBS注射的脑血管和脑实质、TCO标记的TF注射的脑实质以及TCO标记的血浆注射的脑血管和脑实质。在TCO标记的血浆组或PBS注射组中，如果超过50%的LFQ强度值缺失，则排除这些蛋白质。对于脑实质样本，使用TCO标记的TF注射的小鼠的样本作为额外的对照，以排除与脑组织非特异性结合的蛋白质。在TCO血浆注射的脑实质中富集的蛋白质进一步过滤，只保留那些平均LFQ强度显著高于TCO-TF注射组的蛋白质，从而排除非特异性的背景干扰。在Perseus中，使用其默认方法插补缺失的LFQ值，该方法从标准差向下偏移1.8的标准差的正态分布中抽样，并且宽度相对于样本分布为0.3。然后，将TCO血浆注射的血管中显著富集的蛋白质与TCO标记的血浆参考蛋白质组进行交集，以鉴定可以穿透BBB的血浆蛋白质。这个列表进一步与TCO血浆注射的脑实质中过滤后的蛋白质集进行交集，以定义可以穿透BBB的血浆蛋白质。相反，那些在TCO血浆蛋白质组和TCO血浆注射的血管组分中都显著富集但存在于脑实质中的蛋白质被归类为保留在BBB内的血浆蛋白质。使用双尾Welch’s t检验评估整个蛋白质组数据的统计显著性，并随后应用Benjamini-Hochberg假发现率（FDR）校正，以考虑多重假设检验的影响。对于在预定义的生物学优先子集（例如，可以穿透BBB的血浆蛋白质）内的下游比较，使用名义p值来评估实验条件下的动态变化（例如，WT与LPS、WT与AD）。为了评估重复性，在使用LFQ-Analyst排除缺失值超过50%的蛋白质后，计算了每个条件的生物重复实验之间的变异系数（CVs）和成对Pearson相关性。

对log2转换后的LFQ强度进行了主成分分析（PCA），在过滤掉所有条件下缺失值超过50%的蛋白质并使用Perseus风格的向下偏移正态分布（向下偏移=1.8，宽度=0.3）后进行插补。详见表S8。

使用内部软件（PAVA）从血浆样本生成峰列表，并使用Protein Prospector（v6.8.1）针对SwissProt Mus musculus数据库（下载于2024.01.24）进行搜索（并为每个条目连接一个随机序列）。切割特异性设置为胰蛋白酶切割，允许两次切割遗漏。Cys的 carbamidomethylation被设置为恒定修饰。前体离子所需的质谱精度为8 ppm，片段离子为30 ppm。可变修饰包括：Acetyl（蛋白质N端）、Acetyl+Oxidation（蛋白质N端M）、Gln->pyro-Glu（N端Q）、Met-loss（蛋白质N端M）、Met-loss+Acetyl（蛋白质N端M）、Oxidation（M）、TCO?（未切割的K和蛋白质N端）（质量399.2252）和TCOBiotin（未切割的K和蛋白质N端）（质量1045.5400）。TCO?允许片段保留由TCO修饰的不稳定碎片化引起的247.1414 Da修饰。每个肽允许多达三种修饰。肽的鉴定假发现率为1%。可以使用搜索键gdb4szk42k在msviewer.ucsf.edu上查看经过 curate的TCO-和TCOBiotin-肽注释的谱图。

数据集可以通过以下URL访问：https://msviewer.ucsf.edu/cgi-bin/mssearch.cgi?report_title=MS-Viewer&search_key=gdb4szk42k&search_name=msviewer.Tz- 和基于streptavidin的血浆蛋白质富集用于银染分析。未标记的血浆对照或TCO标记的血浆样本与20 μM Tz-PEG4-biotin（Thermo Fisher Scientific，#NC0740038）一起孵育，或不愿意孵育，并在4°C下旋转12小时。使用Zeba spin desalting columns（Thermo Scientific，#89894）去除过量的未反应Tz-PEG4-biotin。对于基于Tz的富集，未标记或TCO标记的血浆（不含Tz-PEG4-biotin）与磁性甲基-Tz珠（Thermo Fisher Scientific，#50-238-7198）在室温下孵育1小时。对于基于streptavidin的富集，未标记的血浆、生物素标记的血浆（不含Tz-PEG4-biotin）和TCO标记的血浆（含Tz-PEG4-biotin）与磁性streptavidin珠（Thermo Scientific，#88817）在室温下孵育1小时。珠子依次用RIPA缓冲液（Thermo Scientific，#89901）加1% SDS（Fisher Scientific，#15-553-027）清洗六次，用1 M KCl（Thermo Fisher Scientific，#15568025）清洗三次，用4 M尿素（Sigma-Aldrich，#U5378）清洗一次，用50 mM HEPES清洗三次，每次清洗持续10分钟。然后将珠子重新悬浮在RIPA缓冲液（Thermo Scientific，#89901）和LDS样品缓冲液（Thermo Fisher Scientific，#NP0008）的混合物中，在95°C下煮沸15分钟，收集上清液用于银染并通过SDS-PAGE分离。根据制造商的说明，使用Pierce? Silver Stain for Mass Spectrometry kit（Thermo Fisher Scientific，#24600）处理凝胶。简要来说，凝胶在超纯水中清洗，用30%乙醇/10%醋酸固定，然后用Silver Stain Working Solution染色并添加增强剂。显影后，用5%醋酸停止染色，最后用清水清洗并可视化。

分离的脑血管通过4% PFA在PBS中固定（Electron Microscopy Sciences，#15710）30分钟，在室温下轻轻旋转。固定后，样品用冷PBS清洗三次，每次清洗后分别在4°C下以2,000 × g离心5分钟，并在室温下中等速度旋转5分钟。为了通透化和封闭，脑血管颗粒在含有10%正常驴血清（Jackson ImmunoResearch，#017-000-121）、2% BSA（Sigma-Aldrich，#A1470-100G）和0.5% Triton X-100（Sigma-Aldrich，#93443-500ML）的封闭缓冲液中孵育1小时。然后样品用1% BSA在PBS中清洗三次（每次3分钟），每次清洗后如上所述进行离心。一抗包括anti-CD31（BD Biosciences，#550274，1:200）和anti-AQP4（Proteintech，#16473-1-AP，1:200），在抗体缓冲液（10%驴血清、2% BSA、0.3% Triton X-100和0.1% Tween-20在PBS中）中稀释至每管0.5 mL，与脑血管颗粒在4°C下孵育48小时并持续旋转。一抗孵育后，用冷1% BSA在PBST中清洗三次，然后离心。二抗包括Alexa Fluor 488结合的抗-rat IgG（Abcam，#ab150149，1:500）、Alexa Fluor 594结合的抗-rabbit IgG（CST，#8889，1:500）、Alexa Fluor 647结合的Streptavidin（Invitrogen，#S32357，1:500）和DAPI（Invitrogen，#D1306，1:1000），在抗体缓冲液中配制并在室温下与脑血管颗粒孵育2小时。然后用冷1% BSA在PBS中清洗血管三次，每次清洗后如上所述进行离心。最后，将染色后的血管在约30–50 μL PBS中轻轻涡旋重新悬浮，转移到玻璃载玻片上。使用ZEISS LSM 900 Confocal Laser Scanning Microscope（1024 × 1024像素）的40×油镜进行成像。

从脑组织中分离出血管颗粒，使用Mem-PER? Plus Membrane Protein Extraction Kit（Thermo Scientific，#89842）按照制造商的说明进行膜蛋白提取，并稍作修改。简要来说，新鲜解剖的脑组织在提供的消化缓冲液中均质化，并在300 × g下离心5分钟。所得颗粒用洗涤溶液清洗几次，每次清洗后以300 × g离心5分钟。然后将组织颗粒重新悬浮在通透化缓冲液中，轻轻涡旋并在冰上孵育10分钟。随后在4°C下以16,000 × g离心15分钟，所得上清液代表细胞质组分，小心转移到新的试管中。剩余的颗粒在溶解缓冲液中在4°C下孵育1小时并轻轻涡旋。最后以16,000 × g离心15分钟，得到含有溶解的膜和膜相关蛋白的上清液，收集并用于后续的Western blot分析。

血浆蛋白质组用NHS-ATTO-647N标记。血浆蛋白质组在4°C下用1摩尔过量的NHS-ATTO-647N（Sigma-Aldrich，#18373-5MG-F）标记12小时。反应在室温下用1 M Tris-HCl（pH 8.0；Thermo Scientific，#15568025）淬灭10分钟。使用Zeba spin desalting columns（Thermo Scientific，#89894）进行三轮缓冲液交换去除过量的未反应Atto染料，然后将血浆重新浓缩至原始体积，并使用Amicon? Ultra-0.5离心过滤单元（EMD Millipore，#UFC503024）进一步去除残留的自由染料。

纯化的血浆蛋白质，包括IgG2a（BioLegend，#400501）、TF（Sigma-Aldrich，#T4132-100MG）、APOA1（Sigma-Aldrich，#178452-500UG）、HPX（Sigma-Aldrich，#H9291-500UG）、SERPINA1（Sigma-Aldrich，#A6150-25MG）、AHSG（Sigma-Aldrich，#G0516-1MG）和APOE4（Sigma-Aldrich，#A3234-100UG），在PBS中重新配制至至少2 mg/mL的浓度。蛋白质用5摩尔过量的NHS-ATTO-647N（Sigma-Aldrich，#18373-5MG-F）或NHS-ATTO-488（Sigma-Aldrich，#41698-5MG-F）在4°C下标记12小时。反应在室温下用1 M Tris-HCl（pH 8.0；Thermo Scientific，#15568025）淬灭10分钟。使用Zeba spin desalting columns（Thermo Scientific，#89894）进行三轮缓冲液交换去除过量的未反应染料，然后将最终蛋白质浓度调整至2 mg/mL以便注射。

通过荧光成像检测生物素或TCO标记的血浆。小鼠通过三次静脉注射给予生物素或TCO标记的血浆（每次200 μL），间隔2小时；对照组动物接受等量的PBS。用冷PBS灌注后，脑组织在4°C下固定在4% PFA（Electron Microscopy Sciences，#15710）中24小时，然后在30%蔗糖（Sigma-Aldrich，#S0389-1KG）中冷冻保护直至完全沉降，然后切割成40 μm厚度。对于用TCO标记的血浆和相应的PBS对照处理的脑组织切片，将切片在1% Triton X-100中与20 μM Tz-PEG4-biotin（Thermo Fisher Scientific，#NC0740038）孵育30分钟，然后在4°C下用PBST（0.02% Tween-20）中清洗48小时。切片在含有10%驴血清、2% BSA、0.3% Triton X-100和0.1% Tween-20的PBS中在室温下封闭1小时，然后与一抗（包括Milli-Mark? Pan Neuronal Marker（Sigma-Aldrich，#MAB2300，1:200）、anti-GFAP（Proteintech，#23935-1-AP，1:500）和anti-Iba-1（Wako，#019-19741，1:300）在抗体缓冲液（10%驴血清、2% BSA、0.3% Triton X-100和0.2% Tween-20在PBS中）中孵育48小时。用PBST清洗三次后，切片在室温下与streptavidin-Alexa Fluor 647（1:500）和/或二抗（包括Alexa Fluor 555结合的抗-rabbit IgG（Abcam，#ab150149，1:500）、Alexa Fluor 555结合的抗-rabbit IgG（CST，#8889，1:500）和DAPI（Invitrogen，#D1306，1:1000）孵育2小时。最后用RapiClear mounting medium（Fisher Scientific，#NC1633209）安装切片。脑切片使用ZEISS LSM 900共聚焦激光扫描显微镜的40倍油浸物镜成像（1024 × 1024像素）。

**小鼠脑血管内注射血浆**
小鼠使用3.0%–3.5%异氟醚麻醉，并在手术前皮下注射丁丙诺啡和布比卡因。剃光头皮并消毒后，将小鼠放置于立体定位框架中以稳定头部。在头皮中央做一个切口以暴露颅骨，并以Bregma作为参考点。根据立体定位坐标（相对于Bregma：前后-0.5毫米，内外侧±1.0毫米）在侧脑室上钻一个小孔。使用装有33G针头的Hamilton注射器以1 μL/分钟的速率注入3 μL血浆。注射后针头再留在原位5分钟以防止回流，然后缓慢拔出。用手术夹子关闭头皮切口，将小鼠置于加热垫上直至完全从麻醉中恢复。手术后立即皮下注射美洛昔康。

**小鼠脑脊液中注射血浆**
小鼠被麻醉、剃光后，置于立体定位框架中。沿后颈部做一条中央切口，小心切开并牵开肌肉层以暴露位于大脑窦上的寰枕膜。使用33号NanoFil针头（World Precision Instruments）在大脑窦中注入3 μL血浆，注射速率为0.5 μL/分钟，持续6分钟。

**用于检测血脑屏障完整性的示踪剂尸体素-555**
示踪剂检测遵循先前建立的方法。

**其他研究**
- **前列腺素预防溶血磷脂酰胆碱引起的中枢神经系统周细胞丧失和脱髓鞘**：J. Biol. Chem. 2015; 290:11515-11525
- **社会压力诱导的神经血管病变与抑郁**：Nat. Neurosci. 2017; 20:1752-1760
- **内皮BACE1通过紧密连接损伤脑血管**：Circ. Res. 2022; 130:1321-1341

**实验流程**
三次PBS或血浆注射后2小时，使用胰岛素注射器（VWR, #76582-606）将尸体素-Alexa Fluor 555（Thermo Fisher Scientific, #A30677；在储备缓冲液中的浓度为0.5 mg/mL；每20克体重100 μL）静脉注射小鼠体内。再过2小时后，用冷PBS灌注小鼠，并采集其大脑进行分析。一个脑半球在1% Triton X-100的PBS中匀浆，4°C下18,000 × g离心30分钟。使用微孔板读取器测量上清液中的荧光强度（激发波长：542 nm；发射波长：572 nm）。对侧脑半球固定、切片至40 μm厚度，使用ZEISS LSM 900共聚焦激光扫描显微镜（1024 × 1024像素）成像。

**脑组织分离和流式细胞术染色**
脑组织使用Neural Dissociation Kit（Miltenyi Biotec, #130-092-628）按照改良方案进行分离。灌注后，将无自然通透屏障的区域（如下丘脑和脉络丛）的脑组织切成小块，放入冷PBS中，并用Enzyme P/Buffer X混合物在37°C下消化。切片后用Enzyme A处理，通过70 μm滤网过滤。细胞洗涤后用20%-percoll去除髓鞘，再用冷PBS洗涤并重新悬浮。

**原代小胶质细胞、星形胶质细胞和神经元的分离与培养**
从出生后第9天（P9）的小鼠大脑中分离原代小胶质细胞、星形胶质细胞和神经元。

**培养前准备**
培养前，将培养板或盖玻片在0.1 M硼酸盐缓冲液（pH 8.5）中浸泡过夜，浓度为0.01 mg/mL的聚D-赖氨酸（Sigma-Aldrich, #P7280-5X5MG），洗净后用新鲜培养基平衡。通过斩首处死小鼠，迅速取出大脑并置于含有钙、镁、葡萄糖和丙酮酸的冰镇PBS中（Thermo Fisher Scientific, #14287080）。用锋利的刀片机械切割大脑，然后在37°C下用Adult Brain Dissociation Kit（Miltenyi Biotec, #130-107-677）中的Enzymes A和P进行酶解。将得到的匀浆通过70 μm细胞滤网过滤，使用配套试剂去除碎屑和红细胞。获得单细胞悬液后，用CD11b标记的磁珠（Miltenyi Biotec, #130-93-634）和LS柱（Miltenyi Biotec, #130-42-401）在QuadroMACS分离器（Miltenyi Biotec, #130-090-976）中分离小胶质细胞。收集CD11b阳性的部分作为小胶质细胞进行培养；流过的部分（CD11b阴性细胞）用抗ACSA-2磁珠（Miltenyi Biotec, #130-97-678）分离星形胶质细胞。保留星形胶质细胞进行培养，而双阴性部分（不含小胶质细胞和星形胶质细胞）用于神经元分离。神经元用针对非神经细胞的生物素标记抗体混合物进行负选择（Miltenyi Biotec, #130-115-389），然后用BODIPY（Thermo Fisher Scientific, #D3922，2 μM）在含有Fc阻断剂的FACS缓冲液（PBS中添加1% BSA和1 mM EDTA）中孵育30分钟。若当天进行流式细胞术，则将样品重新悬浮在FACS缓冲液中；若计划第二天进行分析，则将样品置于固定缓冲液（Thermo Fisher Scientific, #88-8824-00）中并冷藏。

**其他实验步骤**
- **BBB完整性检测**：注射PBS或血浆三圈后，用胰岛素注射器将尸体素-Alexa Fluor 555（Thermo Fisher Scientific, #A30677）静脉注射小鼠体内。
- **流式细胞术**：样品洗涤后重新悬浮在FACS缓冲液中或固定缓冲液中，根据需要储存。
- **其他分析**：包括脑组织分离、流式细胞术染色、培养原代小胶质细胞和星形胶质细胞及神经元等。在处理之前，立即吸取培养基，并用PBS轻轻冲洗细胞两次以去除残留的碎片。然后将含有ATTO-647N标记的SERPINA1的培养基加入处理孔中，而对照孔则加入等体积的PBS。在37°C下孵育2小时后，向指定孔中加入Phrodo? Red Zymosan Bioparticles（Thermo Fisher Scientific，#P35364，50 μg/mL）或HiLexa? Fluor 488标记的Aβ42（Anaspec，#AS-65627，0.5 μM），继续孵育1小时。每组条件有两个孔不加入吞噬荷载物作为FMO对照。孵育完成后，移除培养基，并用PBS轻轻洗涤细胞。

接着按照FACS染色和获取培养细胞部分的描述对样本进行处理（CD45/CD11b面板）。使用Quantikine? Mouse TNF-α ELISA Kit（R&D Systems，#MTA00B-1）和Mouse IL-1β/IL-1F2 ELISA Kit（R&D Systems，#MLB00C）按照制造商的指示测量星形胶质细胞培养上清液或脑实质裂解物中的小鼠肿瘤坏死因子α（TNF-α）和白细胞介素-1β（IL-1β）水平。简要来说，将样本和标准品加入预先涂有针对TNF-α或IL-1β的单克隆抗体的96孔板中。孵育和洗涤后，加入HRP结合的多克隆检测抗体。使用稳定的显色底物进行显色反应，并用稀释的酸终止反应。在450 nm处读取吸光度，并在540或570 nm处进行波长校正。根据重组小鼠TNF-α或IL-1β的标准曲线计算细胞因子浓度。所有样本均重复进行两次实验，并适当地取平均值和标准化。

**FACS染色和获取培养细胞**
使用胰蛋白酶收集细胞，以300 × g离心5分钟沉淀，然后重新悬浮在3 mL PBS中。将悬浮液通过装有细胞滤网的流式细胞术管以获得单细胞悬浮液。将细胞与100 μL Ghost Dye（Cell Signaling Technology，#49826S，在PBS中稀释1:1000）在冰上孵育15分钟以评估活力，随后用PBS洗涤。

**APOA1/APOE4摄取和ABCA1/SR-B1阻断实验**
用PE anti-ACSA-2（Miltenyi Biotec，#130-123-284，1:200）、BV605 anti-CD31（BD，#740356，1:100）和BV711 anti-CD11b（BioLegend，#101242，1:200）在含有Fc阻断剂的FACS缓冲液（BD Biosciences，#553142，1:100）中在冰上孵育30分钟进行染色。

**SERPINA1摄取实验**
用PE/Cy7 anti-CD45（BioLegend，#103114，1:200）和BV711 anti-CD11b（BioLegend，#101242，1:200）在含有Fc阻断剂的FACS缓冲液（BD Biosciences，#553142，1:100）中在冰上孵育30分钟进行表面染色。再用FACS缓冲液清洗两次后，将样本重新悬浮在FACS缓冲液中用于当天分析，或用固定液（Thermo Fisher Scientific，#88-8824-00）保存在4°C以待第二天分析。

**免疫细胞化学**
该协议适用于上述所有ICC样本；不同实验的主要抗体组合有所不同，会在适用时注明。对于APOA1/APOE4摄取实验和ACM处理的神经元实验，所有步骤都用锡纸覆盖板子以防止光照。细胞在室温下用4% PFA固定15分钟，用PBS洗涤三次，然后用0.25% Triton X-100在PBS中渗透30分钟。阻断处理是用含有0.1% Tween-20的3%山羊血清和1% BSA在PBS中进行的，时间为30分钟。

**ACM处理的神经元（PSD-95/MAP2面板）**：细胞在4°C下与抗PSD-95（Cell Signaling Technology，#36233S，1:100）和抗MAP2（Cell Signaling Technology，#4542S）在阻断缓冲液中孵育过夜。第二天，细胞用PBS洗涤三次，然后在阻断缓冲液中与Alexa Fluor 488结合的抗兔IgG（Thermo Scientific，#A-21206，1:500）、Alexa Fluor 647结合的抗鼠IgG（Thermo Scientific，#A-21235，1:500）和DAPI（Invitrogen，#D1306，1:100）孵育2小时。

**星形胶质细胞（GFAP面板）**：细胞在4°C下与抗GFAP一级抗体（ProteinTech，#23935-1-AP，1:400）在阻断缓冲液中孵育过夜。第二天，细胞用PBS洗涤三次，然后在阻断缓冲液中与Alexa Fluor 568结合的抗兔IgG（Invitrogen，#A-11011，1:500）和DAPI（Invitrogen，#D1306，1:100）孵育1.5小时。

成像使用ZEISS LSM 900共聚焦激光扫描显微镜（1024 × 1024像素）的63倍油浸物镜进行。

**Western blotting**
使用BCA测定法（Thermo Scientific，#23227）对来自同一大脑的脑实质和血管部分进行定量，并在样本之间标准化蛋白质浓度。血浆样本在RIPA裂解缓冲液（Thermo Scientific，#89901）中稀释1:100，并加入蛋白酶抑制剂（Thermo Scientific，#78439）。对于细胞样本，处理后移除培养基，并用冷PBS轻轻洗涤细胞，然后加入200 μL含有蛋白酶抑制剂的RIPA裂解缓冲液进行裂解。裂解物进行超声处理（6个循环，每次3秒，振幅40%），然后在4°C下以16,000 × g离心15分钟；收集上清液并用BCA进行定量以确保蛋白质装载量均匀。所有样本与LDS样品缓冲液（Thermo Fisher Scientific，#NP0008）混合，并在95°C下煮沸15分钟，再进行SDS-PAGE。或者与天然样品缓冲液（Invitrogen，#BN2003）混合并在37°C下孵育15分钟，随后在4%–20%的天然聚丙烯酰胺凝胶（Bio-Rad，#4561096）上分离。蛋白质转移到硝酸纤维素膜（Bio-Rad，#1620117）上，用5%脱脂牛奶（Fisher Scientific，#NC9730946）或商用阻断缓冲液（Fisher Scientific，#EN37539）在室温下阻断1小时，并在4°C下与一级抗体孵育过夜。使用以下一级抗体：抗GFAP（ProteinTech，#23935-1-AP；1:1000）、抗S100β（Abcam，#ab52642；1:400）、抗TREM2（Cell Signaling Technology，#55739S，1:500）、抗白蛋白（Cell Signaling Technology，#4929S，1:1000）、抗PSD-95（Cell Signaling Technology，#2507S，1:500）、抗MAP2（Cell Signaling Technology，#4542S，1:500）、抗NeuN（Cell Signaling Technology，#24307S，1:1000）、抗Caveolin-1（Cell Signaling Technology，#3267S，1:400）、抗MBP（Cell Signaling Technology，#78896S，1:500）、抗Na，K-ATPase（Cell Signaling Technology，#3010S，1:700）、抗β-actin（Cell Signaling Technology，#4967S）和抗GAPDH（Cell Signaling Technology，#2118S，1:400）。二级抗体的孵育使用以下HRP结合抗体之一：根据一级抗体的物种来源，使用抗兔IgG（Jackson ImmunoResearch，#711-035-152；1:25,000）或抗鼠IgG（Jackson ImmunoResearch，#115-035-003；1:25,000）。对于化学发光信号检测，根据制造商的指示使用ECL底物（Thermo Scientific，#34580或#34096）。使用ImageJ量化条带强度，并将目标蛋白质水平标准化到相应的装载对照。

**胆固醇定量**
使用Amplex Red Cholesterol Assay Kit（Invitrogen，A12216）根据制造商的指示测量胆固醇水平。简要来说，将样本在1×反应缓冲液（0.1 M磷酸钾，pH 7.4）中制备，并以50 μL的体积加载到黑色96孔板的每个孔中。在1×反应缓冲液中新鲜制备含有100 μM Amplex Red试剂、1 U/mL辣根过氧化物酶（HRP）、1 U/mL胆固醇氧化酶和0.1 U/mL胆固醇酯酶的工作溶液，并加入每个孔50 μL。将板子在37°C下孵育30分钟，防止光照。使用Synergy H1微孔读数器（BioTek）在560 nm激发和590 nm发射处测量荧光。使用无胆固醇对照孔减去背景荧光，并通过与胆固醇标准曲线（0–20 μM）比较来确定胆固醇浓度。

**免疫染色定量**
使用ImageJ分析用脑细胞标志物（GFAP、Iba1或泛神经元标志物）和ATTO-647N标记的血浆蛋白染色的小鼠脑切片，根据先前描述的方法量化标记阳性区域内的647信号的面积和平均荧光强度。

**单通道图像处理**
首先将单通道图像转换为8位（Image > Type > 8-bit），调整阈值（Ctrl + Shift + T > Threshold，选择“Dark background”），然后设置测量参数包括“Area”、“Mean gray value”和“Limit to threshold”。使用Analyze > Measure获取GFAP阳性、Iba1阳性或泛神经元阳性区域的总阳性面积和平均强度，使用Analyze > Analyze Particles识别颗粒。然后类似地处理相应的血浆蛋白通道，并将预先定义的脑细胞区域叠加（Ctrl + Shift + A选择所有颗粒 > More > OR [Combine]）以提取脑细胞群体内的血浆蛋白阳性面积和强度值。百分比面积计算为（血浆蛋白+面积 / 总标记+面积 × 100），强度报告为标记阳性区域内的平均灰度值。使用ImageJ插件JACoP（Just Another Colocalization Plugin）从CA1放射层和皮层的Synaptophysin 1和PSD-95染色图像中量化突触密度。

**全脑成像分析**
从所有样本在相同成像设置下获得的脑切片中量化ATTO-647N强度。根据Allen小鼠脑图谱的解剖学定义分配脑区域，然后在ImageJ中手动勾画皮质、海马体、纹状体和丘脑的轮廓。使用PBS注射的脑切片测量每个脑区域的平均荧光强度并进行背景校正。从四个重复样本中平均测量值以获得每只小鼠每个脑区域的单一值。对于距离-强度分析，在ImageJ中使用刻度栏设置图像比例。根据校准的图像比例从脑室到每个目标区域画一条400 μm的线，并使用Analyze > Plot Profile提取线上的荧光强度。从每个小鼠的四个匹配切片中导出剖面数据并平均，得到每只小鼠的单一值，然后使用PBS注射的脑切片进行背景校正。在Prism中进行斜率分析。

**原代小鼠BECs的分离和培养**
如先前所述，从6–8周大的WT小鼠中分离原代BECs。解剖大脑，去除脑膜、嗅球和小脑。组织在MEM-HEPES中彻底切碎并在37°C下用添加了DNase I的蛋白酶溶液（Worthington Biochemical）消化70分钟。样品依次通过18G和21G针头匀浆，然后以16,000 × g离心15分钟以分离微血管，并在22% BSA中离心（1,360 × g，10分钟）以分离髓鞘。富含血管的沉淀物洗涤后，重新悬浮在内皮细胞生长培养基（ECGM）中，并在37°C下铺板在预涂有一型胶原蛋白的6孔板上2小时。第二天，轻轻洗涤孔以去除碎片和非贴壁细胞，然后用含有4 μg/mL嘌呤霉素的ECGM替换培养基以消除非内皮细胞。24小时后，将含有嘌呤霉素的培养基替换为新鲜的EBM-2 Endothelial Cell Growth Basal Medium-2（Lonza，#CC-3156）并添加EGM-2 SingleQuots补充包（Lonza，#CC-4176）。BECs形成特征性的漩涡单层并在1–2天内达到汇合。所有培养基成分分装并在-20°C下保存直至使用。

**批量RNA测序样本制备和分析**
为了测试正常条件下的APOA1功能，原代小鼠星形胶质细胞用10 μg/mL ATTO-647N标记的APOA1或等体积的PBS处理24小时。为了测试APOA1在应激条件下的保护或逆转作用，首先用2 μM人寡聚Aβ42处理原代小鼠星形胶质细胞15小时，然后用10 μg/mL ATTO-647N标记的APOA1或PBS处理6小时。使用胰蛋白酶收集细胞，并将同一条件下的两个孔的细胞悬浮液合并到一个2 mL的DNA低结合Eppendorf管（Eppendorf，#022431048）中。样品在4°C下以300 × g离心5分钟，小心移除上清液，剩余的细胞沉淀物在干冰上快速冷冻30分钟。沉淀物随后在-80°C下保存直至转移到Gladstone基因组学核心进行后续处理。

**RNA提取**
为了测试APOA1的功能，在正常条件下，原代小鼠星形胶质细胞用10 μg/mL ATTO-647N标记的APOA1或等体积的PBS处理24小时。为了测试APOA1在应激条件下的保护或逆转作用，首先用2 μM人寡聚Aβ42处理原代小鼠星形胶质细胞15小时，然后用10 μg/mL ATTO-647N标记的APOA1或PBS处理6小时。使用胰蛋白酶收集细胞，将两个孔中的细胞悬浮液合并到一个2 mL的DNA低结合Eppendorf管（Eppendorf，#02243104）中。样品在4°C下以300 × g离心5分钟，小心移除上清液，剩余的细胞沉淀物在干冰上快速冷冻30分钟。沉淀物随后在-80°C下保存直至转移到Gladstone基因组学核心进行后续处理。

**RNA提取**
对于RNA提取，使用Qiagen RNeasy Mini Kit和柱上DN酶消化根据制造商的协议处理冷冻的细胞沉淀物，以确保去除基因组DNA污染。提取的RNA进行定量和质量检查，并使用NEBNext Ultra II Directional RNA Library Prep Kit（New England Biolabs）根据制造商的说明制备mRNA文库。准备好的文库被提交给UCSF先进技术中心（CAT）的核心部门进行测序。对于后续分析，首先使用FastQC（v0.12.1）进行初步质量控制，并使用MultiQC（v1.27）进行总结。所有样本都被认为是高质量的，表现出碱基Phred得分>35、正常的GC含量分布以及最少的接头污染（<1.5%的接头污染）。通过STAR对齐工具（v2.7.11b）和genomeGenerate从Mus musculus参考基因组（GRCm39）及相应的Ensembl基因注释（版本110）生成基因组索引，其中设置了sjdbOverhang 49以反映50 bp的读取长度。索引完成后，原始的配对末端FASTQ文件使用STAR与小鼠参考基因组对齐。所有样本的独特映射读取对齐率都高于90%，表明适合进行后续的定量分析。特征量化使用featureCounts（v2.0.8）进行，并采用与配对末端、反向链读取一致的参数。得到的原始特征计数矩阵使用DESeq2（v1.44.0）进行处理。我们使用了一种设计公式来区分八个对照组样本和八个实验组样本。在标准化和分散性估计之前，过滤掉表达水平较低的基因（在8个以上样本中计数<10个）。提取差异表达测试的结果，并检查统计摘要以确定差异表达基因的数量和方向性。

**GEM-X Flex单细胞RNA测序的细胞固定和分选**

24只12周大的野生型（WT）小鼠被注射了标记有ATTO-647N的APOA1或SERPINA1（每组24只），每次注射剂量为2 mg/mL，间隔2小时。最后一次注射后的第二天早上，对小鼠进行灌注并收集其大脑。根据“脑组织分离和FACS染色”中的描述，从分离出的组织中生成单细胞悬浮液，用相同的荧光标记表面抗体进行染色，并通过离心（300 × g，5分钟，4°C）用FACS缓冲液洗涤。每8只小鼠的细胞沉淀物合并成一个重复样本，并在固定前保持在冰上。使用血细胞计数器或自动计数器确保每个样本中有≥25,000个细胞。细胞离心（300 × g，5分钟，4°C），然后小心地去除上清液，保留≤30 μL。样本在室温下的Fixation Buffer B（10x Genomics）中重新悬浮并轻轻混匀。在室温下固定1小时或在4°C下固定过夜（16–24小时）。固定后，加入0.5 mL的室温Additive C并混合。细胞离心（850 × g，5分钟，室温），然后丢弃上清液。细胞沉淀物在含有1%无核酸酶BSA和0.2 U/μL RNA酶抑制剂（Protector RNase Inhibitor，Sigma，PN-3335399001）的PBS中重新悬浮，以便进行FACS分选。分选后的细胞直接收集到PBS + 1% BSA + 0.2 U/μL RNA酶抑制剂中。细胞沉淀物（850 × g，5分钟，室温）后，在冷却的Quenching Buffer B中重新悬浮，并在冰上用移液器轻轻混匀5次。Enhancer（10x Genomics，PN-2000482）预先加热到65°C 10分钟，然后以1:10的体积比加入到样本中（例如，100 μL Enhancer加入1,000 μL样本）。固定后的细胞用PI或DAPI染色以进行质量控制并计数。样本在4°C下保存过夜，之后送交Gladstone Genomics Core进行杂交和后续的GEM-X Flex处理。

**单细胞RNA-seq的质量控制、数据处理和细胞类型注释**

原始测序文件使用10x Genomics Cell Ranger多管道（v9.0.1）和默认参数进行处理，以小鼠基因组组装GRCm39作为参考。得到的原始计数矩阵使用Seurat（v5.1.0）进行分析。根据以下标准过滤掉低质量的细胞核和双重细胞：nFeature_RNA > 200, nFeature_RNA < 9000, percent.mt < 20，然后使用DoubletFinder（v2.0.6）。标准化、特征选择、对数转换和降维按照Seurat的官方教程进行。初始聚类使用louvain算法（分辨率=0.1）进行，然后使用‘FindAllMarkers’函数中的Wilcoxon秩和测试识别每个簇的关键特征。通过与公开可用的小鼠大脑转录组数据集（Cell x Gene，Allen Brain Atlas，http://mousebrain.org/）中的已知典型细胞类型标记进行匹配，进行广泛的细胞类型注释。移除了非星形胶质细胞、低质量细胞和混合细胞群，从而得到31,218个高质量星形胶质细胞核的重新聚类结果。

**潜在可渗透蛋白受体相互作用的鉴定**

为了识别可渗透蛋白与脑内皮细胞受体之间的潜在相互作用，我们从STRING数据库（版本12.0）中提取了已知且置信度高的相互作用。只保留涉及可渗透蛋白的相互作用。这些相互作用进一步通过两种方式过滤：1. 子细胞定位：与可渗透蛋白相互作用的伙伴需要在UniProt（版本2025_02）注释中显示为在细胞表面、跨膜或细胞外区域的定位。2. 内皮表达：与可渗透蛋白相互作用的伙伴需要在脑内皮细胞中有RNA表达的证据。我们使用一个公开可用的小鼠脑内皮细胞的scRNA-seq数据集来评估表达情况（“Brain Endothelial Cells Are Exquisite Sensors of Age-Related Circulatory Cues”）。保留平均标准化表达水平高于0.05的基因。为了确定实质细胞进入大脑后与血脑屏障（BBB）可渗透蛋白的潜在相互作用，我们采用了类似的方法，但使用了包含多种神经、胶质、免疫和血管细胞类型的公开可用小鼠脑scRNA-seq数据集（http://dropviz.org/）。

**蛋白质指标的计算**

主要氨基酸序列从UniProt数据库（版本2025_02）中获取。为了收集全局蛋白质指标，使用Biopython包（版本1.85）中的ProteinAnalysis模块分析每个序列，计算了以下化学性质：质量、芳香性、不稳定性指数、疏水性（GRAVY）、pH 7.4下的净电荷和蛋白质灵活性。其他全局蛋白质指标还包括序列长度和氨基酸百分比组成。为了识别每种蛋白质的结构特征，我们使用NetSurfP 3.0网络工具预测每个氨基酸残基的二级结构、表面可及性和内在无序性。为了测试非渗透蛋白和可渗透蛋白之间的统计显著性，我们使用scipy.stats包（版本1.13.1）中的ttest_ind函数对每个指标进行了独立的双样本t检验。极端的异常值（绝对z分数≥5）被排除在统计分析之外。P值使用Benjamini-Hochberg校正进行调整，统计显著性阈值设定为padjust < 0.05。为了评估每个蛋白质组（非渗透蛋白和实质蛋白）的蛋白质长度与每种二级结构数量之间的关系，我们使用MASS包（v7.3.64）中的rlm()函数对蛋白质长度与每种二级结构数量之间的关系进行了建模。在输入数据之前，对数值进行对数转换，以获得蛋白质长度与每种二级结构数量之间的线性关系。结构计数被定义为NetSurfP3预测的至少连续5个相同结构的氨基酸片段。在每个模型拟合后，我们使用emmeans包（v1.11.1.1）中的‘emmtrends’函数和‘contrast’函数来评估不同蛋白质组之间蛋白质长度与结构计数关系的统计差异。比较是在模型斜率值上逐对进行的。

**AAV载体的生产和注射**

重组AAV载体是在HEK293T细胞中内部生成的。转移质粒（pAAV-Cdh5-HA-SR-B1和pAAV-hSyn-HA-SR-B1）从VectorBuilder获得，而pAAV-TBG-APOA1则是通过限制性酶切割和连接，用合成的APOA1插入片段替换pAAV-TBG-eGFP中的eGFP cassette来内部构建的。衣壳质粒（pAAV-2/8、pUCmini-iCAP-PHP.V1和pUCmini-iCAP-PHP.eB）从Addgene获得，所有载体制备都使用了相同的辅助质粒。HEK293T细胞在添加了10% FBS、100 U/mL青霉素和100 μg/mL链霉素的Dulbecco改良Eagle培养基（DMEM）中培养，在37°C下、5% CO2的潮湿培养箱中进行培养。细胞在15-cm培养皿中以30%–40%的浓度接种，在转染前24小时进行培养，转染时细胞密度为70%–80%，使用基于聚乙烯亚胺（PEI）的方法进行转染。转染后3天，通过四次冻融循环收获细胞。 lysates通过0.45 μm PES过滤器过滤澄清，然后通过差速超速离心纯化AAV颗粒。使用针对ITR序列的引物和标记探针通过定量PCR（qPCR）确定载体基因组滴度。注射前，小鼠用2%–3%异氟烷麻醉，然后使用连接在胰岛素注射器上的31G针头将AAV载体注入眼底窦道。AAV8-TBG-APOA1（滴度约1 × 10^13 vg/mL）每只小鼠注射200 μL（总量约2 × 10^12 vg）。AAV-V1-Cdh5-HA-SR-B1（滴度约2.5 × 10^12 vg/mL）每只小鼠注射200 μL（总量约5 × 10^11 vg）。AAV-PHPeB-hSyn-HA-SR-B1（滴度2.5 × 10^12 vg/mL）每只小鼠注射200 μL（总量约5 × 10^11 vg）。

**行为测试**

行为测试在4个月大的30只雄性小鼠上进行。在所有测试之前，小鼠在测试室内适应60分钟。所有设备在每次测试之间用70%乙醇清洁，在不同测试组之间用Vimoba清洁。

**高架plus迷宫：**使用Kinder Scientific的高架plus迷宫（在昏暗的光线下）评估类似焦虑的行为。迷宫高出地面63厘米，由两个开放式臂和两个封闭的黑色不透明臂组成，侧墙高度为16.5厘米。小鼠被放置在国家中心的开放式臂中，允许其自由探索设备10分钟。使用红外光束中断来量化在开放式臂和封闭式臂中花费的时间和行驶的距离。

**新物体识别：**小鼠被放置在一个30 × 30厘米的灰色亚克力竞技场内，竞技场位于隔音室内。在训练试验中，两个相同的物体被放置并固定在竞技场内。在物体内部放置了一个含有20 μL香草提取物的棉签以增加探索行为。四小时后进行测试试验，其中呈现一个来自训练试验的熟悉物体和一个新的物体（也含有香草提取物）。每次试验持续10分钟，并使用Noldus EthoVision XT记录视频。使用CleverSys TopScan软件分析视频，将物体相互作用定义为小鼠在物体1.5厘米范围内嗅探的行为。新物体识别量化为与新物体互动的时间相对于熟悉物体的时间。

**新位置识别：**使用新位置识别任务评估空间记忆，该任务包括两次训练试验和一次测试试验。小鼠被放置在一个40 × 40厘米的白色亚克力竞技场内，竞技场位于隔音室内。在训练试验中，两个相同的物体被放置在彼此相距相等的位置，并且与竞技场的墙壁等距。在物体内部放置了一个含有20 μL香草提取物的棉签以增加探索行为。为了便于空间定位，在竞技场的两个角落固定了两个不同的黑白视觉提示（4 × 4厘米）。训练试验间隔24小时进行，测试试验在第二次训练试验后1小时开始。在测试试验中，一个物体被移动到对面的墙壁上，代表一个新的空间位置，而另一个物体保持在其原始位置。使用Noldus EthoVision XT记录10分钟内的行为，并使用CleverSys TopScan软件进行分析。物体相互作用时间定义为小鼠在物体1.5厘米范围内嗅探的时间。空间记忆表现量化为新位置物体上的互动时间相对于熟悉位置的时间。

**新臂识别：**使用新臂识别任务评估空间记忆，该任务在一个白色的Y形迷宫中进行。每个臂的长度为49.5厘米，宽度为8厘米，壁高为23.5厘米。在两个目标臂的末端放置了不同的黑白视觉提示以帮助区分臂。在测试室的两个墙壁上也放置了不同的黑白视觉提示。所有测试都在昏暗的光线下进行，以最大化探索。在训练试验期间，使用白色亚克力隔板挡住了其中一条通道，使得小鼠无法进入该通道。将小鼠放置在起始通道内，允许它们自由探索起始通道和唯一可进入的目标通道，持续5分钟。1小时后，移除隔板，小鼠再次被放回起始通道进行5分钟的测试试验，在此期间它们可以探索所有三个通道，包括之前无法进入的通道（新通道）。记录并分析了小鼠进入各通道的次数、行进的距离以及在每个通道中停留的时间，使用的是Noldus EthoVision XT软件。

量化与统计分析：
统计分析使用GraphPad Prism 10、R和Python进行。所使用的统计检验方法、重复次数以及每个实验的P值详细信息见相关图表及其图例。简要来说，对于大规模的差异表达分析（比较蛋白质丰度和生物物理特性），通过非配对Welch's t检验来评估统计显著性，并使用Benjamini-Hochberg方法对P值进行FDR调整。对于两组之间的直接比较，使用带Welch校正的双尾非配对t检验或配对t检验。对于涉及多于两组的比较，根据情况应用单因素方差分析（ANOVA）后跟Bonferroni多重比较检验或双因素方差分析后跟Tukey多重比较检验。曲线之间的线性回归斜率比较使用额外平方和F检验进行。对于参数分析，通过视觉检查数据分布是否存在明显的偏态和异常值。未对数据的正态性和方差齐性进行正式检验。在需要时使用Welch校正进行非配对t检验，以允许组间方差不等。样本量的确定基于以往使用类似实验设计的研究的先例，没有正式的统计方法预先确定样本量。除非图例中另有说明，否则条形图显示的是平均值±平均值的标准误差（SEM）。箱线图显示中位数和四分位数区间。具体样本量和单位n在相应的图例中给出。

附加资源：
一个用于查询 BBB 通透性蛋白质的交互式网页浏览器位于：https://yang-lab-ucsf-gladstone.shinyapps.io/bbb_permeability/。

补充信息（10）：
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文档S1：图S1–S25
电子表格（73.91 KB）：三个Alb-/- 副泌蛋白组（与图1相关）的质谱数据，包括未标记的样本、未标记的非特异性结合对照以及用Tz-PEG4-生物素标记并通过磁珠富集的NHS-PEG4-TCO标记的血浆样本。
电子表格（311.71 KB）：四个数据集的质谱分析结果（与图1相关），包括生物素标记的野生型（WT）血浆、TCO标记的WT血浆、注射生物素标记WT血浆后的全脑检测结果与注射PBS的对照组结果、以及注射TCO标记WT血浆后的全脑检测结果与注射PBS的对照组结果。
电子表格（335.15 KB）：七个数据集的质谱分析结果（与图2相关），包括TCO标记的Alb-/- 副泌蛋白库、不可通透的血浆蛋白、在WT大脑中的BBB相互作用蛋白和BBB保留蛋白、WT大脑实质中的BBB通透性血浆蛋白与注射PBS的基线对照及注射TF的假阳性对照的结果，以及WT大脑中的BBB通透性血浆蛋白与小脑实质中的区域摄取情况。
电子表格（2.48 MB）：与图3相关的星形胶质细胞和微胶质细胞聚类的标记基因及微胶质细胞对SERPINA1反应的差异表达基因（DEGs）。
电子表格（4.29 MB）：与图4相关的初级小鼠星形胶质细胞对APOA1反应的差异表达基因（DEGs）。
电子表格（5.42 MB）：与图5相关的两个数据集的质谱分析结果，包括LPS处理的小鼠与WT小鼠之间大脑中的泄漏血浆蛋白，以及5xFAD处理的小鼠与WT小鼠之间大脑中的BBB通透性蛋白质摄取差异。
电子表格（1.45 MB）：与图5相关的初级小鼠星形胶质细胞在Aβ42处理与Aβ42 + APOA1处理后的差异表达基因（DEGs）。
电子表格（8.84 KB）：本文主要蛋白组数据集的重现性指标（与图2和图5相关）。
PDF（51.28 MB）：文章及补充信息