利用瞬时基质效应改善人血浆中药物GC-MS分析的策略研究

《Forensic Toxicology》：Exploiting the transient matrix effect for improved GC-MS analysis of drugs in human plasma

目的：本研究旨在开发并优化一种新型分析方法，利用瞬时基质效应（transient matrix effect, TME） simultaneously增强人血浆中不同类药物（tramadol、doxepin、diazepam）及蛋白同化雄激素类固醇（testosterone、nandrolone）的测定。方法：采用GC-MS方法结合QuEChERS萃取。为可控诱导TME，评估了不同类别的分析物保护剂（PEG-400、C14-NH₂、IPM-98和Triton X-100）单独及作为多组分混合物的效果。随后在真实人血浆样本中评估了优化程序的来源间基质变异性。结果：将具有不同亲和力的保护剂组合可显著改变其保护作用。四组分混合物在纯溶剂中提供最高增强效果，但在血浆提取物中产生竞争性吸附。PEG-400与C14-NH₂的二元组合被确定为血浆中最有效的混合物——与标准样品相比，nandrolone和diazepam分别提高314%和221%。诱导的基质效应严格为瞬时的——保护剂在两次分析之间被完全从色谱柱冲洗。结论：提出使用高沸点保护剂（PEG-400和C14-NH₂）的二元混合物有意调控TME，以在色谱柱起始端引发瞬态冷凝膜的形成。分析物冷凝于该膜上，导致其浓度带的强聚焦。该现象显著提高了血浆中结构多样的药物和类固醇的检测灵敏度。通过归一化吸附环境，该方法中和了内源性基质变异性，为法医毒理学和常规案件检验提供了稳健且可重现的工具。

研究背景方面，现代医学使用了多样化的药理活性物质，包括中枢神经系统调节剂如tramadol、doxepin、diazepam以及蛋白同化雄激素类固醇如testosterone、nandrolone。由于这些化合物具有高成瘾性和兴奋剂潜力，其非医疗使用受到严格管制，包括世界反兴奋剂机构（WADA）的监管。因此，在血液血浆等复杂生物基质中监测这些结构多样的化合物对临床和法医毒理学至关重要。气相色谱-质谱联用（GC-MS）仍然是此类多残留筛查的首选技术。然而，复杂生物基质中的痕量分析面临重大分析挑战。GC-MS分析中的主要限制是基质效应。传统上，共洗脱基质组分通过逐步污染色谱系统产生信号抑制，在衬管和色谱柱上形成活性位点，促进分析物吸附或降解。相反，当内源性组分即分析物保护剂（APs）竞争性阻断这些活性位点时，可产生基质诱导增强效应（MIEE），增加分析信号。由于天然MIEE不可预测且取决于特定样品基质和仪器历史，当使用无基质标准品时会导致结果显著高估。虽然基质匹配校准可以补偿这一点，但获取用于多残留研究的真实空白生物基质往往困难且昂贵。为可控地利用这种信号增强，引入了瞬时基质效应（TME）的概念。TME涉及有意向样品和校准溶液中添加特定高沸点分析物保护剂。进样后，根据文献描述的涂层机制，这些保护剂被提出会迅速冷凝在色谱柱较冷的初始段，形成模拟额外固定相的临时膜。这聚焦了分析物谱带，显著增加色谱信号，远超简单补偿吸附损失。关键的是，保护剂在单次运行中完全从色谱柱洗脱，防止后续分析间的残留。先前研究已证明单一保护剂对特定化合物类别的有效性，如聚乙二醇（PEG-400）对蛋白同化雄激素类固醇。然而，单一保护剂无法为具有不同极性和挥发性的广泛分析物提供最佳增强，而这对于同时多类分析至关重要。为解决这一局限，本研究旨在开发并优化一种利用TME的新型分析方法，用于人血浆中结构多样的药理活性物质（tramadol、doxepin、diazepam、testosterone、nandrolone）的同时多类测定。本研究评估的分析物保护剂选择由两个关键因素驱动：在色谱柱入口有效冷凝所需的高沸点，以及独特的化学官能团。通过选择不同化学类别的代表物——聚醚（PEG-400）、长链伯胺（C14-NH₂）、脂肪酸酯（IPM-98）和非离子表面活性剂（Triton X-100），旨在覆盖广泛的物理化学相互作用。研究人员假设，由于它们对目标碱性药物和类固醇的不同官能团具有互补亲和力，这些保护剂的适当混合物将作为通用保护混合物发挥作用。这项工作涵盖了保护剂混合物组成的优化以及方法在真实法医血浆样本中痕量分析适用性的最终验证。

研究人员开展的研究方面，在材料与方法部分，研究使用了LC-MS级溶剂包括丙酮、乙酸乙酯和甲醇（MeOH），以及diazepam、doxepin、nandrolone、testosterone和tramadol的分析标准品，购自Merck（Darmstadt, Germany）。Merck还提供了用于触发瞬时基质效应的高沸点保护剂，即聚乙二醇（PEG-400）、肉豆蔻酸异丙酯（IPM-98）、正十四胺（C14-NH₂）和Triton X-100（非离子表面活性剂）。氯化钠和无水硫酸镁购自Avantor（Gliwice, Poland）。对于QuEChERS萃取方案，Sepra C18-E吸附剂（50 μm, 65 ?）购自Phenomenex（Torrance, CA, USA）。血液样本采集方面，为获得空白血浆基质，从健康个体采集静脉血，这些个体在研究前至少五天 abstained from精神活性物质以及处方药和非处方药。血液样本（每人两份5 mL）由认证医疗专业人员使用适合血浆采集的封闭Sarstedt Monovette采血系统（Sarstedt, Nümbrecht, Germany）采集。采集后立即轻轻匀质并以2500 × g离心10 min分离血浆。获得的血浆小心转移至无菌聚丙烯管中，在?20 ± 2 °C下保存直至萃取程序。所有样本均在标准化实验室条件下采集、处理和保存，以确保分析结果的完整性和可重现性。血液样本由医务人员合法采集并匿名进行毒理学分析。所有人体程序符合赫尔辛基宣言，未进行动物研究。样品制备方面，分析了标准品和工作液的制备：分析物储备液（tramadol、doxepin、diazepam和testosterone浓度各为0.1 mg/mL甲醇溶液，nandrolone浓度各为1 mg/mL甲醇溶液）；保护剂储备液（PEG-400、C14-NH₂、IPM-98、Triton X-100浓度各为0.5 mg/mL乙酸乙酯/丙酮（80:20, v/v）溶液）。QuEChERS萃取程序：将600 μL血浆等分试样置于1.5 mL Eppendorf管中，加入60 μL目标物质，涡旋30 s。随后加入200 mg MgSO₄和50 mg NaCl，涡旋1 min。萃取时加入500 μL预冷乙酸乙酯。混合物再涡旋30 s，随后以14,700 rpm离心1.5 min。净化阶段，将350 μL收集的上清液转移至含17.5 mg C18吸附剂的新管中。该悬浮液涡旋（30 s）并如上一步精确离心（14,700 rpm, 1.5 min）。所得纯化上清液（300 μL）移至预装100 μL保护剂储备液的新管中，并用乙酸乙酯进一步稀释至500 μL。在相同条件下最终离心后，萃取物直接进行GC-MS分析。GC-MS分析方面，色谱分离和质谱分析使用Shimadzu GC-MS/MS TQ8040系统（Kyoto, Japan）。仪器配备Phenomenex ZB-5 MSi熔融石英毛细管柱（长30.0 m，内径0.25 mm，膜厚0.25 μm）。5.0级氦气作为载气，恒定流速1.25 mL/min。样品引入（1.0 μL）通过AOC-20i + s自动进样器（Shimadzu）以不分流模式执行。进样口温度维持285 °C。应用高压进样技术（250 kPa产生4.9 mL/min柱流1.5 min），随后立即1.5 min平衡阶段。GC炉温程序从40 °C开始（保持5 min），以6 °C/min升至285 °C，最后25 min等温保持。MS检测方面，电子电离（EI+）源操作于70 eV和225 °C。尽管使用三重四极杆仪器，但本分析方法严格以单MS模式操作。定性评估涉及Q1-SCAN数据采集，m/z范围45至400。定量数据使用选择离子监测（Q3-SIM）模式收集。监测离子（m/z）如下：tramadol – 263, 188和159；doxepin – 277, 219和178；diazepam – 283, 256和221；testosterone – 336, 298和225；nandrolone – 257, 239和147。粗体离子用于定量分析。最终，这种组合配置允许同时监测分子离子和特定碎片，为标准溶液和复杂基质提供最佳选择性和灵敏度。方法验证和统计分析方面，分析方法根据标准性能标准验证，评估线性、检测限（LOD）和定量限（LOQ），以及日内和日间准确度和精密度。为评估线性，使用最小二乘回归基于每个浓度点五次重复构建校准曲线，以决定系数（R2）作为线性度量。LOD和LOQ参数使用加标空白基质确定，分别对应信噪比（S/N）3:1和10:1。为确定准确度和精密度，在单日内（日内）和连续三天内（日间）分析五个独立加标样品。每种目标化合物的校准模型在有和无分析物保护剂添加的情况下开发。工作浓度水平设置如下：tramadol、doxepin、diazepam和testosterone为0.1、1、5、10、25、50和150 ng/mL；nandrolone为0.1、1、5、10、25、50和250 ng/mL。为保证统计稳健性和可重现性，每个溶液制备三份。

研究结果方面，TME在降低定量限方面的有效性可能不仅限于掩蔽系统的活性位点。基于文献，假设这里的关键机制可能是分析物对高沸点保护剂层的高物理化学亲和力，该层在分析初始阶段可能在色谱柱起始段冷凝。以这种方式形成的瞬态膜被提出作用如同额外固定相，分析物分子可能比标准条件下更有效地吸附于其上。这将导致其浓度带的强聚焦，从而增强源自分析物的信号。然而，由于这种亲和力的强度严格取决于分析物与保护剂之间的结构匹配，假设没有单一保护剂能够为如此多样的化合物类别产生通用冷凝膜。这 necessitated一种创新方法，包括开发专用的多组分保护剂混合物。为全面研究保护剂混合物的潜力，计划并进行了系统系列实验。这些包括评估其影响、选择最佳保护混合物以及优化真实样品分析程序。保护剂类别对分析物信号增强的影响方面，为研究不同类别保护剂对测定物质分析信号的影响，评估了四种不同保护剂类别代表物——聚乙二醇（PEG-400）、伯脂肪胺（C14-NH₂）、肉豆蔻酸异丙酯（IPM-98）和非离子表面活性剂（Triton X-100）——的影响。测试在基质为乙酸乙酯并添加所有分析物混合物的样品中进行，其中引入适当保护物质溶液。所有数据以相对于无保护剂添加样品的100%归一化相对响应表示。对于tramadol、doxepin和diazepam，所有测试保护剂类别均导致其信号强度增加，尽管观察到由其结构组成导致的显著差异。使用IPM-98和Triton X-100提供中等分析信号强度改善。添加PEG-400显示稍强效果，将测试物质的检测器响应平均提高至226%。该组化合物中迄今最强且最一致的增强在应用长链胺（C14-NH₂）后观察到，将分析信号大幅提高至平均290%水平。对于蛋白同化雄激素类固醇（testosterone和nandrolone），观察到不同模式。在该组中，脂肪胺产生平均117%的信号增强。引入IPM-98和Triton X-100分别导致轻微增加104%和155%。使用PEG-400记录到类固醇的稳健保护效果——平均增加至148%。值得注意的是， specifically for nandrolone，最高信号提升并非使用PEG-400记录，而是使用Triton X-100，增加达到242%。研究基质效应的瞬态性质方面，为确认测试保护剂诱导的基质效应的瞬态性质，进行了一系列交替注射模型样品且分析物浓度恒定的实验。四个类似制备的样品，含有先前选定的化学类别单个保护剂（PEG-400、C14-NH₂、IPM-98和Triton X-100），进行分析。对于每种保护剂，样品顺序引入GC-MS系统，交替于含分析物无保护剂的样品和含相应保护剂的 otherwise相同制备样品之间。首先分析无保护剂的分析物溶液以建立参考，紧接着分析含保护剂添加的溶液。该交替注射序列对四种保护混合物各重复五次，以评估现象的重复性并验证其瞬态特征。获得的结果显示注射样品中保护剂存在与分析物响应之间清晰且可重现的关系。含保护剂的注射导致分析物信号增加，而每个后续无保护剂注射中记录的信号返回至与初始无保护剂注射中观察到的水平相当。该模式在所有四种测试保护剂的重复注射序列中一致观察到。此外，重复注射含保护剂样品未导致分析物响应的渐进增加。因此，在所研究的实验条件下，观察到的信号增强是可重现的、瞬态的且可逆的，无证据表明对后续无保护剂注射有累积或持续效应。多组分保护剂混合物对信号增强的影响方面，下一阶段研究旨在评估选定高沸点保护剂混合物的潜力。在设计实验框架内，系统比较了三种不同变体样品添加保护剂后获得的相对检测器响应：(i) 含单一保护剂类别的样品，(ii) 添加两种不同保护剂组合的样品，和(iii) 用所有四类化合物综合混合物保护的样品。信号参考对照样品获得的响应（100%）。分析结果表明，组合具有不同亲和力的保护剂显著改变并拓宽其保护作用范围。使用适当二元混合物导致靶向性极强信号提升。例如，C14-NH₂和IPM-98组合增加碱性药物响应（doxepin 521%，tramadol 407%），但对类固醇提供较弱保护（testosterone 127%）。相反，PEG-400和IPM-98混合物显示对类固醇组更高亲和力，将testosterone信号提高至213%。另一方面，PEG-400与C14-NH₂混合物提供有利折衷，显著增加doxepin（470%）和nandrolone（244%）信号。在模型系统中迄今最全面增强在应用四组分保护剂混合物（PEG-400 + C14-NH₂ + IPM-98 + Triton X-100）后注意到，为所有类别产生极高分析信号增加（doxepin 559%，tramadol 404%，nandrolone 301%）。基于获得的结果，选择四种最有效且有前景的保护变体用于真实样品工作：综合四组分混合物和三种二元组合（PEG-400 + C14-NH₂、PEG-400 + IPM-98和C14-NH₂ + IPM-98）。在血浆基质和来源间变异性中评估优化保护剂混合物方面，在纯溶剂实验后，通过在加标人血浆提取物中评估测试分析物的信号增量，在真实生物条件下验证选定保护剂混合物的性能。血浆基质初步评估显示TME动力学与模型系统根本不同。虽然综合四组分混合物在纯乙酸乙酯中 exhibit最高效力，但在血浆提取物中产生通用但仅中等增强，在有效性上让位于靶向二元组合。在测试变体中，PEG-400和C14-NH₂二元组合被确定为复杂分析物面板最有效且平衡的保护系统。它提供实质性和通用增长，diazepam平均达221%，testosterone达199%，同时其他物质可靠增强（doxepin 156%，tramadol 135%，nandrolone 114%）。相反，C14-NH₂和IPM-98组合导致最弱整体增强，而PEG-400和IPM-98混合物主要 favor类固醇组和diazepam，未为碱性药物提供最佳保护。因此，PEG-400 + C14-NH₂组合被选为优化保护剂混合物用于全面适用性测试。为最终确认开发程序在常规实践中的实用性并评估来源间基质变异性的影响，五个独立人血浆样品加标分析物并经受优化QuEChERS萃取。这些样品特征为自然个体间生物变异性，包括预期但未量化的内源性脂质谱、蛋白质含量、金属离子存在和典型不同患者背景的代谢副产物差异。尽管这些微妙生物差异，结果显示在所有测试化合物中稳定且可重现的分析信号增强。例如，doxepin增强严格波动于151%至161%的紧范围，tramadol在所有五个测试血浆样品中仅从129%变化至140%。剩余分析物注意到类似卓越稳定性，确认优化程序的高可重现性和耐用性。为视觉展示优化保护剂混合物在复杂生物基质中的效力，呈现人血浆提取物的代表性GC-MS色谱图。无和有保护剂添加分析样品之间的直接比较清楚说明所有研究分析物检测器响应显著增加。此外，二元混合物应用不仅放大信号强度而且锐化色谱峰。分析程序评估的重要组成部分是其验证。如上所示，使用优化二元保护剂混合物（PEG-400和C14-NH₂）的应用程序有效中和内源性基质变异性并确保不同人血浆样品中稳定分析信号增强。具体而言，提出的分析程序在研究浓度范围内 exhibit高度线性，所有化合物决定系数（R2）一致高于0.99。方法精密度和准确度，通过日内和日间重复性研究评估，产生远在普遍接受限内的值，确认方法稳健性和可重现性。重要的是，从验证参数总结可见，诱导的瞬时基质效应导致所有目标分析物检测限（LOD）和定量限（LOQ）与无保护剂添加分析相比显著降低。总之，这些发现证明优化方法提供高灵敏度、准确度和可靠性，使其非常适合复杂样品基质中结构多样药物和类固醇的常规多类测定。讨论部分，综合考虑所有分析物和保护剂，出现与其物理化学亲和力相关的清晰关系。对于含碱性基团的化合物，最有效保护剂是脂肪胺（C14-NH₂），而相对于具有羟基和酮基的分析物（类固醇），PEG-400和Triton X-100 exhibit最高有效性。反过来，IPM-98展示中等增强性质，无论分析物类别。该趋势在整个测试群体中一致维持并在收集数据中统一反映。鉴于这种清晰关系，进一步实验策略选择由考虑分析物结构多样性的必要性决定。由于没有单一保护剂为整个测试物质面板提供最佳且同时增强，认识到创建其混合物将是解决方案。选定化合物（PEG-400、C14-NH₂、IPM-98和Triton X-100）展示彼此互补的保护性质。结果，所有四种保护剂被认为分析上有前景并选入下一阶段研究，旨在优化其混合物组成以诱导协同TME现象。对多组分混合物痕量分析特别重要的是，诱导的基质效应在所研究实验条件下显示可重现且瞬态响应。对于所有四种测试保护剂，重复注射未导致分析物信号渐进增加，而后续无保护剂注射未显示响应持续升高。因此，在所采用条件下，未观察到测试保护剂对后续分析的累积或持续效应证据，无论其分子量、粘度或结构组成。这种行为从分析可靠性和定量结果可重现性角度重要。它还提供本研究调查的有意诱导TME与复杂生物样品色谱分析中可能出现的记忆现象或长期基质污染相关持续效应之间的相关区别。在所研究条件下对四种保护剂每种未观察到累积效应为随后组合评估提供实验基础，包括多组分保护剂混合物开发。重要的是，该结论限于本研究中调查的保护剂、分析物、色谱条件和注射序列。使用保护剂混合物观察到的Methods灵敏度增加证明其互补作用。结果确认假设，在剧烈多样多残留分析中，化合物组合应用允许创建更复杂冷凝膜。在这些系统中，脂肪胺有效与含氮原子碱性化合物相互作用，PEG-400强烈与具有羟基和酮基分析物相互作用，而IPM-98作为具有中间效果的通用保护剂。尽管获得数据明确表明在模型系统中四组分混合物提供最通用增强，该阶段仅视为初步研究。应记住在真实样品（血浆提取物）情况下，内源性生物基质组分存在可通过竞争GC-MS系统活性位点改变TME现象动力学。为此，最终决定选择一个最佳混合物变体推迟到下一阶段研究，在目标条件下进行——使用人血浆生物提取物。纯溶剂和生物提取物中获得结果之间的鲜明对比强调控制瞬时基质效应诱导机制的复杂性。四组分保护剂混合物在血浆基质中相对有效性明显降低可合理解释为内源性生物组分存在，如残留脂质或脂肪酸。这些化合物自然在QuEChERS程序中共萃取，固有 exhibit对GC-MS系统活性位点高亲和力，有效作为天然基质保护剂。向这个已经饱和环境引入多达四种额外强吸附化学修饰剂最可能诱导严重竞争吸附和系统过载。因此，过量保护分子开始不仅与活性位点竞争而且与分析物自身竞争接近色谱柱固定相，从而限制谱带聚焦机制效率。为此，在本研究调查的实验条件下，使用仔细选择二元保护剂混合物提供比四组分系统更有效分析方法。特别是PEG-400和C14-NH₂组合提供分析信号显著增强同时避免应用更复杂保护剂组成需要。观察性能表明，对于本研究中调查血浆样品和分析物，PEG-400/C14-NH₂组合在单个化学修饰剂贡献和所得信号增强之间提供有利平衡。该观察基于测试混合物实验性能，不应解释为一般热力学最优证据或普遍适用于其他生物基质、分析物或分析条件。此外，在独立血浆样品中评估该优化混合物成功模拟临床和法医毒理学实验室真实工作条件。内源性个体间差异，由饮食或健康状况等因素导致，通常构成痕量分析中最大挑战，频繁导致基质效应不受控波动和定量精密度严重降低。在五个不同基质中获得高度一致增强结果构成优化保护剂混合物有效性和稳定能力 definitive证明。PEG-400和C14-NH₂组合引入确保GC-MS系统中形成的瞬态冷凝膜完全主导内源性血浆背景。应用保护混合物有效归一化色谱柱内吸附环境，大幅最小化患者个体生物变异性影响。然而，由于内源性组分如金属离子变化仍可能出现轻微残余信号波动，建议应用内标以确保定量分析严格准确度。使分析程序免疫于此类生物干扰从法医医学意见角度至关重要。这些数据强烈确认优化多组分QuEChERS方法结合TME现象不仅大幅降低结构多样药物和类固醇定量限而且保证现代分析实验室常规实施所需严格可重现性。结论部分翻译：复杂生物基质中结构多样物质的同时痕量测定由于信号抑制和不可预测基质诱导变化仍然是法医毒理学中艰巨挑战。本研究成功证明通过仔细选择分析物保护剂混合物有意调控瞬时基质效应提供高度有效且稳健分析解决方案。研究人员确立虽然复杂四组分保护剂混合物在溶剂基模型系统中表现最佳，但应用于真实生物提取物时导致竞争吸附和系统过载。相反，包含PEG-400和C14-NH₂的靶向二元混合物证明是血浆样品最佳分析平衡。该特定组合利用两种保护剂互补物理化学亲和力，显著且同时增强碱性药物和蛋白同化雄激素类固醇的GC-MS检测器响应。重要的是，诱导基质效应在所研究实验条件下显示瞬态和可逆特征。重复注射测试保护剂未导致分析物响应渐进增加，后续无保护剂注射中未观察到持续信号增强。这些发现在所研究条件下提供无证据表明测试保护剂对后续分析有累积或持续效应。此外，PEG-400/C14-NH₂保护剂混合物在独立获得血浆样品中提供一致信号增强，表明其应用可降低所研究实验条件下个体间基质变异性影响。该观察支持优化保护剂混合物提高血浆样品痕量分析可重现性的潜在效用。因此，将优化QuEChERS萃取与该二元TME策略耦合不仅大幅降低定量限而且确保常规实施所需严格分析可重现性。该方法显著提升毒理学发现证据价值，为现代法医实验室提供真实案件检验多类筛查可靠工具。