开发并验证了一种多重实时RT-PCR检测方法，能够同时检测登革热病毒、基孔肯雅病毒和寨卡病毒

《Archives of Virology》：Development and validation of a multiplex real time RT-PCR assay for simultaneous detection of dengue, chikungunya and Zika viruses

摘要

登革热、基孔肯雅热和寨卡病毒（DCZ）同时在人群中传播，因此需要开发多重实时RT-PCR检测方法以实现早期鉴别诊断。在本研究中，我们开发了一种多重实时RT-PCR检测方法来识别这些病毒，该方法使用β-actin基因作为内部对照，以验证RNA提取效率并评估PCR抑制情况。通过已知病毒滴度（PFU/ml）的病毒株测试了检测限（LOD）。使用相关病毒进行了交叉反应性测试。该检测方法使用DCZ病毒阳性和阴性临床样本（DENV，n=257；CHIKV，n=113；ZIKV，n=4；阴性样本，n=220）以及2022至2025年的分子诊断质量控制（QCMD）能力评估面板进行了验证。通过计算机模拟包含性分析评估了引物和探针结合区域的序列一致性。未发现与引起急性发热疾病的相关黄病毒、呼吸道病毒、细菌和原生动物病原体之间的交叉反应性。DCZ目标的95%检测限为每反应0.02至0.66 PFU。DENV和CHIKV的临床敏感性分别为95.3%（95% CI 91.99%至97.56%）和98.2%（95% CI 93.64%至99.78%）。所有目标的临床特异性均为100%。所有测试样本在ZIKV检测结果上保持一致。所有QCMD分子检测能力评估面板样本均被正确分类为DCZ病毒阳性或阴性。该检测方法在实验天数、试剂批次和实时PCR平台上表现出可重复的性能。计算机模拟分析显示，DENV和ZIKV的引物和探针结合区域具有高度的序列一致性。尽管在CHIKV探针结合区域的5’端发现了一个频繁出现的单核苷酸错配，但CHIKV的正向和反向引物的序列一致性仍超过99%。这些发现支持该检测方法在DCZ病毒的早期鉴别诊断和公共卫生监测中的潜力。然而，需要使用更多ZIKV阳性临床样本进行进一步评估，以确定其针对ZIKV的诊断性能。