基于时序mRNA与miRNA表达特征作为切创创龄及生活反应分子标志物的研究

《Egyptian Journal of Forensic Sciences》：Temporal mRNA and miRNA expression signatures as molecular markers of incised wound age and vitality

背景 精确的创龄推断在法医病理学中仍是一项重大挑战，对犯罪现场重建、创口生活反应判定及法医学解释具有关键意义。传统组织病理学在损伤后早期阶段敏感性有限，促使研究人员探索客观的分子学方法。本研究检测了实验性切创皮肤创口中TNF-α与VEGF mRNA以及miRNA-29a、miRNA-15b和miRNA-125b的时序表达模式，并评估其在创龄推断与生活反应判定中的效用。在大鼠皮肤制作切创，于多个时间点（伤后0 h至10天）取样。提取总RNA并采用逆转录定量聚合酶链反应（RT-qPCR）进行分析。采用适当的统计学方法比较各创龄组间以及生前创与死后创之间的mRNA和miRNA标志物表达谱。结果 TNF-α mRNA在整个愈合过程中持续上调，而VEGF mRNA呈现明显的双相模式：早期受抑、24 h过表达达峰及持续回升。miRNA-29a呈双峰表达，峰值出现在12 h和7–10天。miRNA-15b和miRNA-125b以下调为主。对于早期创龄推断（0–24 h），多变量线性回归模型显示除TNF-α外所有受检标志物共解释84.7%的总方差（R²= 0.847，p < 0.001），其中VEGF具有最强的独立关联。VEGF、miRNA-15b和miRNA-125b在生前组与死后组间差异显著。ROC分析验证miRNA-125b为最佳诊断指标（AUC = 0.917），VEGF（AUC = 0.889）和miRNA-15b（AUC = 0.861）紧随其后。不同创口愈合时间点间mRNA–miRNA标志物亦存在显著关联，提示潜在的调控相互作用。结论 本探索性研究通过mRNA和miRNA时序表达谱为创龄推断和生活反应判定提供了客观的分子学方法，尤其在损伤后早期较传统方法具有更高的精确性。

创龄推断（wound age estimation）是法医病理学（forensic pathology）领域的重大挑战，对犯罪现场重建、嫌疑人抓捕及法医学解释具有重要意义。在涉及多名施暴者造成多处创伤的案件中，法医病理学家需通过推断损伤的时间及顺序来辅助判定，因为量刑往往取决于损伤严重程度。在暴力死亡案件中，研究人员关注损伤系生前还是死后形成，以及生前伤的生存间隔。创口愈合是一个复杂而有组织的生物学过程，包括三个阶段：炎症期、肉芽组织形成期和重塑期。每个阶段涉及众多调控分子，如细胞因子（cytokine）和生长因子（growth factor）；任何阶段的紊乱均可改变正常愈合过程。多种外部和内部因素已被证实影响该过程。值得注意的是，单一参数不足以推断创龄，因此联合使用多种参数可减少潜在误差。目前已报道多种创龄推断方法，包括常规组织病理学检查、免疫组织化学染色（immunohistochemical staining）以及通过定量逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）进行基因表达谱分析。在损伤后最初数分钟或数小时内，标准组织病理学检查可能无法判断创口系生前还是死后形成。分子病理学技术及生物标志物，包括血管内皮生长因子（VEGF）、转化生长因子（TGF）及促炎细胞因子如白细胞介素-1（IL-1）、IL-6和肿瘤坏死因子（TNF-α），已被证明对创龄判定具有价值。TNF-α由损伤区域血管内皮细胞、角质形成细胞和成纤维细胞迅速释放，通过促进炎性白细胞募集至创伤组织而启动炎症期。VEGF是创口愈合过程中形成新肉芽组织的关键血管生成因子，可作为创龄判定的标志物。基于mRNA的检测适用于早期创龄推断，因为创伤后细胞因子和酶的mRNA水平变化早于蛋白质水平和组织形态学改变。此外，miRNA是一类长约21–25个核苷酸的非编码小内源性RNA，被认为可调控多达50%的蛋白质编码基因。其功能包括通过与信使RNA（mRNA）结合在转录后水平控制蛋白质编码基因的表达，导致降解或翻译抑制。既往关于miRNA在法医学创口时间推断中的研究明显匮乏，但在皮肤疾病和外科延迟愈合创口中已有一定探索。miRNA几乎参与创口愈合的每一步骤，以高度协调的方式既作为激动剂又作为拮抗剂恢复皮肤屏障功能。多项研究表明miRNA表达在创口愈合的重叠阶段中上调或下调。若能鉴定出最佳miRNA，则有望开发新的创口时间推断方法和治疗手段。miRNA-125b是miRNA微阵列分析中发现的在银屑病皮肤病变中较健康皮肤显著降低的miRNA之一。在人角质形成细胞中，它抑制增殖但促进终末分化。此外，miRNA-125b是TGF-β促纤维化信号通路最重要的靶向miRNA之一，是诱导成纤维细胞向肌成纤维细胞转化（FMT）所必需的。另一miRNA标志物miRNA-15b被描述为血管生成的关键负性调节因子。在缺氧条件下其表达受抑，导致血管内皮生长因子（VEGF）水平升高。越来越多的证据表明microRNA-29a的失调在多种纤维化疾病的发生发展中发挥作用。在胶原沉积方面，热力皮肤损伤后miR-29a表达增高与1型胶原α2（COL1α2）和VEGF-A减少同时出现，提示二者存在反向调控关系。通过抑制miR-29a可显著促进成纤维细胞增殖和迁移，进一步证实了这一点。因此，皮肤再生过程中miR-29a的自然下调似乎是增强1型胶原合成和血管生成、促进再生过程的机制之一。近期研究已确立mRNA和miRNA作为法医病理学创龄推断的有前景的生物标志物。Du研究组基于富含腺苷酸-尿苷酸元件（ARE）结构和基因本体论（GO）分类开发了mRNA筛选标准，提高了早期死后间隔的准确性。Manetti等的系统综述强调了miRNA作为生活反应标志物的潜力及其在区分生前与死后损伤中的可能效用。然而，Wang等证明仍存在诸多挑战，包括大量基于RNA的创龄标志物缺乏人体验证以及缺乏方案标准化。本研究旨在通过分析TNF-α、VEGF、miR-29a、miR-15b和miR-125b在涵盖切创皮肤创口愈合主要阶段的时间点上的表达，实验性研究损伤后间隔和生活反应，并探索这些mRNA和miRNA标志物之间的调控关系，以评估其联合表达谱是否可为法医创龄推断提供客观的分子学指标。

研究人员开展了以下研究：在66只成年雄性Sprague-Dawley大鼠背部制作长约1 cm的单一线性切创，随机分为无创对照组、9个生前切创组（生存间隔为0 h、1 h、6 h、12 h、24 h、48 h、4天、7天和10天）及1个死后切创组。于各时间点采集创缘全层皮肤样本（50 mg），提取总RNA，采用RT-qPCR检测TNF-α和VEGF mRNA以及miRNA-29a、miRNA-15b和miRNA-125b的表达，以GAPDH和U6 snRNA为内参基因，采用2^?ΔΔCt法计算相对表达量。采用方差分析（ANOVA）及Tukey HSD事后检验比较各创龄组间差异，采用独立样本t检验比较生前0 h组与死后组，采用Pearson相关分析评估标志物与创龄及mRNA-miRNA间的关联，采用单变量和多变量线性回归评估各标志物对早期创龄（0–24 h）的预测价值，并采用Bootstrap重采样（1000次）验证回归模型的稳健性，采用受试者工作特征（ROC）曲线分析评估生活反应判定效能。

结果如下：

Temporal expression patterns of mRNA markers in antemortem wound groups（生前创组mRNA标志物的时序表达模式）：与对照组相比，TNF-α mRNA在整个愈合过程中持续上调，于1 h（3.99 ± 2.35倍变化）和48 h（4.3 ± 1.98倍变化）达峰，至第10天仍保持升高（3.78 ± 1.5倍变化）。VEGF mRNA呈现双相模式：伤后早期（0–6 h）显著受抑，6 h降至最低；12 h显著升高，24 h达峰为最高水平；48 h急剧下降，随后在愈合后期（4–10天）再次升高。单因素方差分析（ANOVA）及Tukey HSD事后检验显示TNF-α和VEGF mRNA在各创龄组间均存在高度显著的动力学变化（P < 0.001），几乎所有时间组与对照组差异均具有统计学意义。

Temporal expression patterns of miRNAs across antemortem wound groups（生前创组miRNA的时序表达模式）：与对照组相比，miRNA-29a呈双峰表达模式，伤后极早期（0 h、1 h）下调（0.40 ± 0.05至0.96 ± 0.31倍变化），6 h急剧升高（3.46 ± 1.42倍变化），12 h达峰（5.7 ± 2.15倍变化），持续至48 h，4天恢复至基线（1.77 ± 0.67倍变化），7–10天出现第二个显著升高（7天4.68 ± 2.19倍变化，10天5.21 ± 0.55倍变化）。miRNA-15b伤后以下调为主，0 h表达最低（0.1 ± 0.07倍变化），逐渐升高至12 h（1.03 ± 0.20倍变化）和24 h（0.98 ± 0.32倍变化）接近基线，48 h再次下降并持续至4天和7天，10天为0.78 ± 0.16倍变化。miRNA-125b时序模式与miRNA-15b大致一致，0 h显著下调（0.15 ± 0.06倍变化），12 h接近基线（0.87 ± 0.15倍变化），24 h轻度下降、48 h稳定后，4天（0.23 ± 0.09倍变化）和7天（0.36 ± 0.22倍变化）再次下降，10天出现第二峰值（0.97 ± 0.08倍变化）。ANOVA分析显示三种miRNA在各创龄组间均存在高度显著的时序变异（P < 0.001），早期与后期创龄区间差异明显，呈明显的时间依赖性表达模式。

RNA markers as a predictive timer for early wound age estimation（RNA标志物作为早期创龄推断的预测计时器）：Pearson相关分析显示，创龄（0 h至10天）与VEGF mRNA（r = ?0.552，P < 0.001）和miR-29a（r = ?0.426，P < 0.001）呈高度显著的中度负相关。限制于早期创龄（前24 h）时关联更强，VEGF mRNA（r = ?0.872，P < 0.001）、miR-29a（r = ?0.685，P < 0.001）、miRNA-15b（r = ?0.725，P < 0.001）、miRNA-125b（r = ?0.516，P = 0.004）均纳入分析。简单线性回归显示miRNA-29a、miRNA-15b、miRNA-125b和VEGF表达水平可显著预测创龄组（0–24 h），而TNF-α不能。miRNA-29a解释47%的变异（R² = 0.470），miRNA-15b解释53.6%（R² = 0.526），miRNA-125b仅解释26.6%（R² = 0.266），VEGF解释76%为最高（R² = 0.760），TNF-α不是显著预测因子（R² = 0.045，p = 0.306）。多变量模型纳入miRNA-29a、miRNA-15b、miRNA-125b和VEGF后，联合预测因子解释84.7%的创龄组变异（校正R² = 0.823，F = 34.618，p < 0.001），VEGF仍为显著独立预测因子（B = ?2.123，95% CI ?2.798至?1.474，p = 0.002），miRNA-29a呈临界关联（B = ?3.158，95% CI ?6.283至?0.108，p = 0.050），miRNA-15b和miRNA-125b在多变量背景下不显著。Bootstrap结果（1000次重采样）证实了回归发现的稳定性，尤其VEGF ΔCt的Bootstrap 95% CI不包含零，单变量和多变量模型中p值均< 0.001，表明VEGF作为独立创龄预测因子的稳健性。

Vitality assessment from expression profiles of mRNAs and miRNAs（基于mRNA和miRNA表达谱的生活反应判定）：死后分析显示TNF-α在即刻死后与生前0 h创组间无统计学显著差异（p = 0.321），VEGF差异显著（p < 0.001）。miRNA-15b和miRNA-125b在即刻死后组的表达水平显著高于生前0 h创组（p < 0.001），miRNA-29a无统计学显著差异（p = 0.504）。ROC曲线分析显示三种候选标志物均具有显著诊断效能，曲线下面积（AUC）均显著偏离随机参考基线（P ≤ 0.001）。miRNA-125b个体准确度最高，AUC为0.917，在优化相对表达截断阈值≤ 0.441时，灵敏度100%、特异度83.33%、总体诊断准确度91.7%。VEGF的AUC为0.889，miRNA-15b的AUC为0.861，在各自数学优化截断边界（VEGF ≤ 0.1342，miRNA-15b ≤ 0.1817）下，两者表现一致，灵敏度均为83.33%、特异度均为83.33%、总体准确度均为83%。

Interplay of mRNA and miRNA markers across wound time intervals（不同创口时间间隔mRNA与miRNA标志物的相互作用）：Pearson相关分析揭示了miRNA（miRNA-29a、miRNA-15b、miRNA-125b）与mRNA编码标志物TNF-α和VEGF在0 h–10天损伤后间隔内的时间依赖性关联。对于TNF-α，miRNA-15b和miRNA-29a在多个时间点（0 h、1 h、48 h、4天和10天）呈强负相关（r ≈ ?0.92至?1.00），表明这些miRNA的高表达在创口愈合早期和晚期均与较低的TNF-α水平一致相关。相反，miRNA-125b在6 h和7天与TNF-α呈中至强正相关（r ≈ 0.79–0.81），提示在活跃炎症和早期肉芽组织形成期间存在短暂共表达。对于VEGF，miRNA相关性的方向和强度随创龄显著变化。miRNA-29a从0 h和10天的强负相关（r ≈ ?0.99至?0.88）转变为6 h、48 h和4天的极强正相关（r ≈ 0.95–1.00），与miR-29和VEGF介导的血管生成之间的时间依赖性调控关系一致。miRNA-15b和miRNA-125b在若干中间时间点（尤其48 h–7天）与VEGF呈强正相关（r ≈ 0.90–1.00），但在10天呈近乎完全负相关（r ≈ ?1.00），表明随着创口接近重塑阶段，促血管生成信号协同下调。

讨论部分总结：本研究检测了实验性切创中TNF-α mRNA、VEGF mRNA、miRNA-29a、miRNA-15b和miRNA-125b的时序表达谱，评估其在生活反应判定和创龄推断中的潜在效用。所有受检标志物在创口愈合过程中均呈时间依赖性表达模式。TNF-α mRNA伤后上调，于1 h和48 h出现双相峰值，初始1 h峰值反映炎症激活，48 h峰值对应急性期向增殖期过渡。VEGF mRNA伤后早期显著受抑，24 h上调，愈合后期（4–10天）进一步升高，与其作为血管生成和血管重塑关键调控因子的角色一致。miRNA-29a呈独特双峰模式，伤后第一小时下调，早期（6–48 h）显著升高支持其早期组织修复作用，后期（7–10天）升高可能通过影响胶原沉积和瘢痕成熟参与重塑。miRNA-15b和miRNA-125b伤后早期以下调为主，愈合后期逐渐恢复，中间时段出现第二次下调，提示这些miRNA在创口愈合中受严格调控，早期抑制可能促进即刻创口反应。生前与死后创口比较显示VEGF mRNA、miRNA-15b和miRNA-125b差异高度显著，表明与损伤后活跃生物学反应相关的分子变化可在RNA水平识别，有助于区分生前与即刻死后损伤。TNF-α mRNA生前组高于即刻死后组但差异不显著。VEGF是区分生前与死后创口最强的单一标志物，ROC分析表现良好。三种miRNA在即刻生前切创中均下调，尤其miRNA-15b和miRNA-125b，与死后水平差异显著。与传统依赖大体外观和组织学的方法相比，分子标志物提供了更客观的生活反应检测方式，尤其在腐败掩盖组织学征象时。早期损伤后（前24 h）若干RNA标志物具有中至强关联及预测性能，支持VEGF和特定miRNA作为大鼠切创模型早期创龄推断分子标志物的效用。单变量分析中miRNA-29a、miRNA-15b、miRNA-125b和VEGF在伤后24 h的表达与创龄显著相关，而TNF-α无判别力，这与创口愈合动力学一致，前24 h特征为从止血和早期炎症向血管生成和再上皮化等增殖过程过渡。miRNA与mRNA标志物间的时间依赖性相关模式支持miRNA在创口愈合中调控炎症和血管生成的作用。本研究识别出潜在新颖之处，如在实验性皮肤创口模型中联合包含TNF-α和VEGF mRNA与三种microRNA的多参数面板，追踪其跨越各愈合阶段的时序表达并比较生前与死后创口。标志物在全程创口时间间隔（0 h–10天）中多呈非线性、阶段依赖性表达模式，提示其有助于更精确区分创口愈合阶段。同时，研究存在若干局限性：实验模型使用特定种属和性别的大鼠，皮肤愈合机制存在差异，应用于人体需谨慎并专门验证；仅分析雄性动物避免周期性激素变化但限制对雌性的推广；预测建模为探索性，限于小标志物面板和样本量，缺乏独立外部验证；创口在受控实验室条件下制作，未模拟环境变化、个体健康差异或多发伤复杂性；参考基因的实际验证对可靠qPCR结果至关重要；靶向mRNA-miRNA调控相互作用验证、功能获得或缺失实验、报告基因试验及蛋白质水平检测有待开展以确立稳定的调控机制；当前生活反应结论仅限于区分生前创与即刻死后创或伪影，未来需涵盖全面死后时间过程的研究以验证标志物在晚期腐败中的稳定性。

结论部分翻译：本研究证明了TNF-α、VEGF、miRNA-29a、miRNA-15b和miRNA-125b在切创皮肤创口愈合过程中具有明确的时序表达模式。VEGF mRNA、miRNA-15b和miRNA-29a对早期创龄推断显示出显著预测价值，依次递减，而联合mRNA–miRNA模型大幅提高了预测准确性，VEGF mRNA在该模型中成为高度稳定的独立创龄预测因子。此外，生前与即刻死后创口间的显著差异及ROC分析支持的高诊断准确度，突显了这些生物标志物在生活反应判定中的潜在应用。这些标志物间的阶段依赖性和时间相关性揭示了miRNA调控组织修复的潜在协调模式。总体而言，这些发现支持整合mRNA和miRNA表达谱分析作为法医创龄推断的有前景的分子学方法，尤其在传统组织学方法诊断价值有限的损伤后早期阶段。在常规法医应用前，尚需在人体组织和更大队列中进一步验证。