《Experimental Hematology & Oncology》：CAR immunotherapy for cancer: from ex vivo manufacturing to in vivo immune cell engineering
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在过去十年中，嵌合抗原受体（CAR）T细胞疗法已使复发或难治性血液恶性肿瘤患者获得持久缓解。然而，其更广泛的临床应用仍受限于患者特异性的离体制造、显著的治疗相关毒性以及在实体瘤中有限的疗效。体内CAR免疫疗法能够直接在体内对内源性免疫细胞进行遗传重编程，从而绕
在过去十年中，嵌合抗原受体（CAR）T细胞疗法已使复发或难治性血液恶性肿瘤患者获得持久缓解。然而，其更广泛的临床应用仍受限于患者特异性的离体制造、显著的治疗相关毒性以及在实体瘤中有限的疗效。体内CAR免疫疗法能够直接在体内对内源性免疫细胞进行遗传重编程，从而绕过白细胞分离术、离体扩增和个体化细胞制造。本综述专门聚焦于用于癌症治疗的体内CAR免疫细胞工程，涵盖血液恶性肿瘤和实体瘤；其在非恶性疾病（包括自身免疫性疾病）中的应用不在本文讨论范围内。研究人员审视了在体内生成CAR免疫细胞的新兴技术，并讨论了病毒载体、非病毒纳米载体以及仿生递送系统如何提高癌症免疫疗法的精准度、可扩展性和可控性。研究人员进一步强调了超越CAR T细胞的免疫效应细胞，包括CAR巨噬细胞和CAR自然杀伤（NK）细胞，它们独特的细胞毒性、吞噬作用和免疫调节功能可能为治疗实体瘤提供互补方法。研究人员讨论了涉及肿瘤微环境重塑、代谢适应和精准基因组工程的策略，以改善免疫细胞持久性、减轻功能性耗竭、增强肿瘤浸润并限制抗原逃逸。新兴的血液恶性肿瘤临床研究提供了初步概念验证，表明可以在患者体内生成功能性CAR细胞，尽管长期安全性、持久性和可重复性仍有待确定。一个核心挑战是在维持对其活性随时间控制的同时，以足够的细胞和空间精度生成这些细胞。研究人员讨论了细胞亚群特异性递送、可编程CAR回路、多细胞工程、智能生物材料和人工智能如何支持将体内CAR免疫疗法发展成为一种可扩展、可控且可能可重复的癌症治疗方法。
主体内容总结
传统离体CAR免疫疗法的主要局限性
嵌合抗原受体（CAR）是经过基因工程改造的合成受体，能使免疫细胞以主要组织相容性复合体（MHC）非依赖的方式识别并清除恶性细胞。尽管CAR-T疗法在血液恶性肿瘤中取得了显著成功，但传统的离体CAR疗法仍面临四大挑战：制造与可及性障碍、免疫细胞耗竭与功能损伤、治疗相关毒性与安全性问题，以及在实体瘤中有限的抗肿瘤疗效。
复杂的离体制造与大规模临床实施的障碍
虽然CAR-T细胞疗法在血液恶性肿瘤中取得了显著的临床成功，但相当一部分患者因制造和可及性限制而无法接受或获益于治疗。临床经验表明，既往接受过苯达莫司汀治疗的患者，特别是近六个月内用药者，其CAR-T制造失败的风险显著增加。一项跨北美、欧洲和澳大利亚学术制造机构的多中心调查显示，约73%的机构经历了显著的批次间产品质量差异。为解决这些问题，CAR-T制造已逐步向更结构化、标准化和自动化的生产流程演进。此外，加速制造策略，如减少离体扩增方案和床旁生产，以及引入体内CAR制造的概念，正被积极探讨。异体CAR-T产品的开发是另一种代表性方法，但必须克服移植物抗宿主病（GVHD）和宿主介导的同种异体免疫排斥这两大基本免疫学屏障。
离体扩增诱导的T细胞耗竭与功能失调
T细胞耗竭最初在慢性病毒感染背景下被描述，现被广泛认为是由持续抗原刺激结合免疫抑制性肿瘤微环境（TME）驱动的独特功能障碍分化状态，其特征是效应功能逐渐丧失及多种抑制性受体持续表达。在临床实践中，经历多轮化疗的患者常表现出不同程度的预先存在的T细胞功能障碍，而后续CAR-T制造过程中的离体激活与扩增可能进一步加剧这种耗竭表型。CAR-T细胞的耗竭由两大因素驱动：一是输注后的持续性抗原刺激与免疫抑制性TME；二是离体制造过程中长时间的激活和人工培养条件对细胞适应性的不利影响。长期持久性是决定持久临床反应的关键因素，但在实体瘤中，CAR-T细胞在恶劣TME中的有限持久性是导致治疗失败和疾病复发的主要原因之一。为克服CAR-T细胞耗竭，已开发出多种治疗策略，包括c-Jun过表达和CRISPR-Cas9介导的基因编辑等遗传工程方法，以及表观遗传重编程和代谢干预策略。
临床CAR-T细胞疗法相关的毒性与安全限制
CAR-T细胞疗法相关的毒性是其最令人担忧的临床挑战之一，也是限制其更广泛应用的主要障碍。这些毒性主要包括细胞因子释放综合征（CRS）、免疫效应细胞相关神经毒性综合征（ICANS）、免疫效应细胞相关血液毒性（ICAHT）和免疫效应细胞相关噬血细胞性淋巴组织细胞增多症样综合征（IEC-HS）。临床研究显示，CRS发生率约为84.1%，其中≥3级CRS约占8.0%；ICANS发生率约为40.5%，其中≥3级神经系统毒性约占12.1%。目前的管理策略主要分为两大类：一是通过药理学手段抑制过度免疫激活，包括优化剂量、使用皮质类固醇或托珠单抗，以及采用IL-1受体拮抗剂或酪氨酸激酶抑制剂达沙替尼；二是依靠基因工程安全开关实现CAR-T细胞活性的可控调节，例如可诱导的半胱天冬酶-9（iCasp9）自杀系统。
实体瘤CAR-T疗法中免疫抑制性肿瘤微环境的挑战
免疫抑制性肿瘤微环境（TME）是限制CAR-T细胞疗法在实体瘤中成功应用的最严峻障碍之一。TME通过多种相互关联的机制抑制CAR-T细胞功能：首先，肿瘤微环境内的代谢异常，包括缺氧和营养物质匮乏，严重损害CAR-T细胞的扩增、存活和功能持久性；其次，TME内多种免疫抑制成分，如调节性T细胞（Tregs）和髓系来源的抑制细胞（MDSCs），通过直接细胞相互作用和分泌抑制性介质来抑制CAR-T功能；此外，趋化因子信号失调严重限制了CAR-T细胞的运输和肿瘤归巢能力。在持续性肿瘤抗原刺激和TME介导的免疫抑制双重压力下，CAR-T细胞逐渐获得耗竭表型。为克服这些挑战，已提出两大主要治疗策略：一是直接重塑TME以减轻免疫抑制；二是设计“武装型”CAR-T细胞，使其具备更强的抵抗能力。
区分制造优势与持久的生物学局限
上述局限性在其根本原因上有所不同，因此不太可能受到体内CAR工程的同等影响。体内CAR工程最直接的优点是绕过了白细胞分离术和患者特异性的细胞离体活化、基因修饰和扩增，可能缩短治疗时间并简化制造物流。然而，有几个生物学障碍并不能通过体内工程本身得到解决：预先存在的T细胞功能障碍、慢性抗原刺激和CAR信号传导仍可促进功能障碍；抗原异质性和抗原逃逸依然存在；异常的血管系统、致密的细胞外基质、缺氧和免疫抑制信号继续限制着实体瘤中的活性。治疗相关毒性也可能发生。在一项ESO-T01的I期研究中，5名患者中有4名出现了CRS，其中3名为3级CRS，所有患者均经历了≥3级不良事件。体内工程还改变了治疗控制的关键要求：工程化的细胞群体在给药前无法直接表征或选择，递送产品剂量并不指定随后生成的CAR细胞的数量、表型或表达谱。总体而言，体内CAR工程直接解决了重要的制造障碍，而细胞适应性、安全性和抗肿瘤功效的改善则取决于递送设计、CAR结构、宿主生物学和疾病背景。
