《Frontiers in Molecular Biosciences》：Synergistic and antagonistic modulation of PI3K-Akt, MAPK, and NF-κB pathways by velvet antler in osteoporosis: an integrated network pharmacology, single-cell transcriptomic, and experimental validation study
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背景：骨质疏松日益被视为一种骨-免疫交互调控（bone-immune crosstalk）紊乱，其中破骨细胞（osteoclast）骨吸收与成骨细胞（osteoblast）骨形成之间的平衡受相互作用的PI3K-Akt、MAPK和NF-κB信号通路调控。鹿茸（L
背景：骨质疏松日益被视为一种骨-免疫交互调控（bone-immune crosstalk）紊乱，其中破骨细胞（osteoclast）骨吸收与成骨细胞（osteoblast）骨形成之间的平衡受相互作用的PI3K-Akt、MAPK和NF-κB信号通路调控。鹿茸（Lu Rong，Cervus nippon）是一种传统中药，据报道具有抗骨质疏松活性，但其分子靶点尚未明确。方法：将药物靶点（BATMAN-TCM、SymMap）与疾病靶点（GeneCards、OMIM、TTD）取交集，获得核心靶点，用于蛋白-蛋白相互作用（PPI）分析（STRING）、枢纽基因（hub-gene）鉴定（CytoHubba）以及GO/KEGG富集分析。基于GSE56815数据集，通过加权基因共表达网络分析（WGCNA）和三种机器学习算法（LASSO、SVM-RFE、随机森林）筛选诊断生物标志物，并在GSE7158、GSE13850和GSE35959中进行验证。随后进行免疫浸润分析（ssGSEA）、单细胞图谱分析（GSE169396；Seurat v5/SingleR）以及CB-Dock2分子对接。最后在原代小鼠骨髓间充质干细胞（BMSCs）中，于成骨诱导条件下联合或不联合雌酮（E1；10和100 nM）对上述预测进行验证，采用RT-qPCR、Western blotting、碱性磷酸酶（ALP）染色和CCK-8检测。结果：鉴定出28种活性化合物和1,312个核心靶点，并从中筛选出8个枢纽基因（MAPK1、MAPK3、SRC、TP53、PRKACA、PRKACB、PRKACG、PIK3R1）。一个十基因诊断特征在训练集中达到AUC 0.947，在外部队列中分别为0.838、0.674和1.000。对18,916个细胞的单细胞分析将枢纽基因和诊断基因定位到不同的细胞群体，分子对接显示雌酮-MAPK1的结合能最高（?9.4 kcal/mol）。在BMSCs中，雌酮促进成骨分化，呈双相剂量反应（10 nM时最强）地增加ALP染色和细胞活力，同时上调Mapk1/ERK1/2并剂量依赖性地下调NF-κB反馈抑制因子Nfkbia，而p-AKT则下降而非升高。结论：鹿茸作用于PI3K-Akt/MAPK/NF-κB网络以促进成骨细胞形成；实验表明，其成分雌酮促进BMSC成骨，最可能通过MAPK/ERK而非PI3K-Akt激活实现，而对破骨细胞活性的抑制作用仍为计算预测，尚待专门验证。本文报道的十基因诊断面板和细胞类型表达图谱为更精准的抗骨质疏松策略提供了基础。
骨质疏松症（osteoporosis）影响全球超过2亿人，其脆性骨折（fragility fractures）仍是重大临床与经济挑战。长期以来该病被视为单纯的代谢性骨病，但这一观点已经转变，越来越多研究将骨质疏松置于骨免疫学（osteoimmunology）领域，认为骨重塑（bone remodeling）受骨骼与免疫细胞间交互调控（crosstalk）支配。在分子层面，PI3K-Akt、MAPK（ERK1/2、JNK、p38）和NF-κB三条信号级联被认为是骨量增减的主要决定因素。在骨髓内，RANKL诱导的NF-κB激活与MAPK信号协同推动单核-巨噬细胞前体向破骨细胞（osteoclast）谱系分化；另一方面，PI3K-Akt维持成骨细胞（osteoblast）存活并与Wnt/β-catenin协同促进新骨形成。这些通路之间持续相互影响：PI3K-Akt可磷酸化IKKα从而减弱NF-κB驱动的炎症，而ERK1/2对NF-κB的增强或抑制则取决于细胞类型和刺激。因此，明确治疗药物如何改变这一平衡对设计更优的抗骨质疏松药物至关重要。鹿茸（Lu Rong，Cervus nippon或Cervus elaphus未骨化的生长鹿角）具有数百年强筋健骨的应用历史。实验研究部分支持这一传统用途：鹿茸提取物可刺激成骨细胞增殖、抑制破骨细胞形成并改善去卵巢（ovariectomized）啮齿动物的骨密度。化学上鹿茸组成复杂，含雌酮（estrone）、雌二醇（estradiol）、睾酮（testosterone）等类固醇激素以及生长因子（IGF-1、TGF-β、BMP-2）、多胺（精胺、亚精胺）、磷脂和植物蜕皮激素β-蜕皮酮。然而现有药理文献多集中于粗提物或单一组分，尚无研究系统探讨这些结构多样的分子如何汇聚于骨质疏松相关通路。网络药理学（network pharmacology）通过蛋白互作网络和通路富集将多组分药物作用映射到疾病相关生物学，与WGCNA、机器学习生物标志物筛选、单细胞RNA测序（scRNA-seq）和分子对接（molecular docking）结合后其效能显著增强。研究人员已用类似流程研究淫羊藿、续断和菟丝子在骨病中的作用，但鹿茸尚未被如此考察。本研究构建了以协同-拮抗（synergy-antagonism）问题为核心的多组学网络药理学流程：鹿茸成分能否在骨髓微环境中同时激活合成代谢通路（PI3K-Akt、Wnt）并抑制破骨生成通路（NF-κB、MAPK）。本研究的特点是每个分析模块均从通路协同与拮抗的视角进行评估，而非将网络构建、转录组学和对接视为相互独立的模块。具体目标为：（i）通过网络拓扑确定活性化合物和核心靶点；（ii）用机器学习发现转录组诊断生物标志物；（iii）通过scRNA-seq解析细胞类型特异性；（iv）通过分子对接检验化合物-靶点结合。研究结果显示，BATMAN-TCM返回94个候选化合物，经评分和P值过滤后保留28种活性成分，共映射到4,651个蛋白靶点；SymMap基于症状-成分-靶点映射提供3,161个靶点；两数据库去重后的并集包含6,561个基因。活性化合物以类固醇激素为主，其次为氨基酸、嘌呤/核苷酸、氮代谢物、维生素等。疾病侧GeneCards贡献1,947个基因，OMIM提供482个，TTD提供352个，去重后疾病靶点并集为2,520个。药物靶点与疾病靶点交集获得1,312个核心靶点。PPI网络包含1,298个连通节点和28,467条边，呈无标度拓扑。CytoHubba三种拓扑算法取交集后确定8个枢纽基因：MAPK1、MAPK3、SRC、TP53、PRKACA、PRKACB、PRKACG、PIK3R1，分别编码ERK/MAPK级联、非受体酪氨酸激酶信号、肿瘤抑制与细胞周期控制、cAMP依赖性PKA催化亚基和PI3K调节亚基相关蛋白。GO富集返回4,209个显著生物过程条目、376个分子功能条目和190个细胞组分条目，顶级生物过程为骨化（ossification）、腺体发育、对肽类激素的反应等。KEGG鉴定出215条显著富集通路，包括PI3K-Akt信号（112个基因）、MAPK信号（92个基因）、破骨细胞分化（54个基因）、NF-κB信号（37个基因）、Wnt信号（54个基因）和TGF-β信号（57个基因）。化合物-靶点-通路（CTP）网络包含51个节点和132条边，SRC和TP53接收最多化合物的输入（分别为18和16个），类固醇激素类化合物连接最广。转录组分析在GSE56815中鉴定出105个差异表达基因（DEGs），WGCNA划分为4个共表达模块，灰色模块与低骨密度状态正相关最强（r=0.55，P=2×10??），棕色模块显著负相关（r=?0.25，P=0.03）。两模块基因与1,312个核心靶点交集形成候选池，LASSO、SVM-RFE和随机森林分别选择10、14和14个基因，共识得到10个诊断基因：CTNNB1、FOXO3、NFKBIA、HMOX1、HSPB1、CTSD、IL1R2、LPIN1、APPL1、RHBDF2。逻辑回归模型训练AUC为0.947，外部验证GSE7158、GSE13850和GSE35959的AUC分别为0.838、0.674和1.000。ssGSEA显示低骨密度与高骨密度组间单核细胞（P=0.0015）和树突状细胞（P=0.0036）浸润存在显著差异（名义P值，未校正）。枢纽基因-免疫细胞相关性分析显示SRC与单核细胞（r=0.51）和M2巨噬细胞（r=0.56）正相关，PIK3R1与中性粒细胞负相关（r=?0.32）。单细胞分析中18,916个细胞通过质控，SingleR注释识别出29种细胞类型，最大群体为单核细胞、中性粒细胞和B细胞。MAPK1在髓细胞、中性粒细胞和单核细胞中表达最高，呈髓系偏向分布；PIK3R1在NK细胞和T细胞中占主导；NFKBIA在中性粒细胞、巨噬细胞和单核细胞中高表达；CTNNB1表达较广，在HSCs和软骨细胞中有富集；RHBDF2在Pro-B细胞和巨噬细胞中最突出；IL1R2由中性粒细胞主导。分子对接对7种代表性化合物与6个枢纽蛋白晶体结构共生成42个Vina结合能评分，范围?4.6至?9.4 kcal/mol，29对（69%）达到强结合（≤?7.0 kcal/mol）。前五位为雌酮-MAPK1（?9.4）、雌酮-MAPK3（?9.4）、雌三醇-MAPK1（?9.3）、雌酮-PIK3R1（?9.2）和皮质酮-PIK3R1（?9.1 kcal/mol）。TP53在所有靶点中结合能最弱。实验验证在原代小鼠BMSCs中进行，分为未分化对照（Ctrl）、成骨诱导（OI）和成骨诱导联合雌酮10 nM或100 nM四组。RT-qPCR显示成骨诱导上调Mapk1，雌酮未逆转该升高，Mapk1在第7天和第14天两个剂量下均保持升高；Pik3r1同样被诱导并被雌酮轻度削减；Nfkbia随诱导急剧升高，随后被雌酮剂量依赖性降低；Src随雌酮处理升高。Western blotting显示总ERK1/2蛋白在诱导和雌酮处理组升高，SRC维持或升高，而磷酸化AKT（p-AKT）未升高反而下降。ALP染色显示雌酮以双相方式增强成骨诱导的ALP信号，10 nM最强，100 nM较弱；CCK-8细胞活力呈相同趋势，10 nM E1达峰值（P<0.0001），100 nM时回落但仍高于对照。讨论部分指出，据研究人员所知，尚无研究将网络药理学、WGCNA、机器学习、scRNA-seq和分子对接整合于鹿茸抗骨质疏松的单一研究中。既往对淫羊藿、续断和菟丝子的网络药理学工作通常止步于化合物-靶点-通路映射和分子对接，未纳入转录组生物标志物发现或单细胞验证。本研究围绕PI3K-Akt、MAPK和NF-κB在骨-免疫界面如何交互这一具体问题组织分析，使每个结果均可在同一协同-拮抗框架下解读。与既往鹿茸提取物研究相比，本研究从无偏的网络层面筛选优先确定雌酮为特异性候选驱动成分，并在原代BMSCs中直接检验其机制，而非仅依赖提取物层面的表型读数。雌酮主要经MAPK/ERK而非PI3K-Akt激活发挥作用，这一机制分辨率在鹿茸单一成分中尚属首次报道。八个枢纽基因映射到该框架：MAPK1和MAPK3在破骨前体中与NF-κB协同放大RANKL驱动的分化，而在成骨细胞中同一ERK级联与Wnt/β-catenin协同促进矿化，体现协同-拮抗的实际表现；但scRNA-seq数据仅对MAPK1支持髓系偏向表达，MAPK3在内皮细胞中达峰，故不能仅凭自身数据将破骨前体论点扩展至MAPK3。PIK3R1位于生长因子信号与细胞存活、炎症控制的交汇点，雌酮和皮质酮分别以?9.2和?9.1 kcal/mol结合PIK3R1，提示鹿茸化合物可介入PI3K-Akt–FOXO3轴。SRC缺失小鼠因破骨细胞无法形成骨吸收所需肌动蛋白环而发生骨硬化症（osteopetrosis），但SRC也参与成骨谱系细胞的PI3K-Akt信号；雌酮和皮质酮对SRC的结合能分别为?8.9和?8.7 kcal/mol。诊断基因中NFKBIA编码IκBα，其在高骨密度组高表达符合抑制NF-κB过度破骨形成的观点；CTNNB1编码β-catenin，属Wnt通路，ssGSEA分析显示其与M2巨噬细胞浸润显著负相关（r=?0.35，P=0.0017），与M1巨噬细胞无显著关联（r=0.10，P=0.38）。CTNNB1同时出现在1,312个核心靶点中，经靶点映射和机器学习两条独立路径双重验证。其余诊断基因涉及氧化应激防御（HMOX1）、应激 chaperone（HSPB1）、溶酶体降解（CTSD）、IL-1诱饵受体（IL1R2）、脂代谢与骨髓脂肪（LPIN1）及Akt信号衔接蛋白（APPL1）。RHBDF2（iRhom2）在骨领域关注较少，但编码金属蛋白酶ADAM17（TACE）的辅因子，负责髓系细胞表面TNF-α的剪切；单细胞数据显示其在Pro-B细胞和巨噬细胞中最突出，提示髓系TNF-α加工与低骨密度转录组特征之间可能存在此前未被认识的联系。单细胞数据提供细胞类型分辨率，但图景并非清晰的髓系-基质二分：MAPK1和NFKBIA集中于单核细胞、巨噬细胞和中性粒细胞，MAPK3和SRC在内皮细胞和血小板中意外达峰，PIK3R1由NK细胞和T细胞主导，仅CTNNB1的表达模式与间充质/基质区室一致。ssGSEA数据显示低骨密度组单核细胞评分反而略低，尽管NFKBIA在单细胞水平于单核细胞中高表达，提示该区室的疾病相关变化可能更多在于NF-κB信号在单核细胞内的调控方式而非单核细胞总体丰度，需单核细胞内在功能数据加以解析。鉴于细胞类型表达模式与预期髓系/间充质分离并不一致，研究人员将“抑制髓系NF-κB/MAPK以减缓吸收、促进间充质祖细胞成骨分化以加速形成”的双臂模型视为主要由NFKBIA和CTNNB1表达模式驱动的假设，而非在全部枢纽和诊断基因集中得到证实；间充质臂在实验中直接检验。BMSC实验部分支持该方案：雌酮确能促进成骨分化（ALP和活力均在10 nM达峰），伴随Mapk1/ERK1/2持续上调，与对接中雌酮-MAPK1排名第一一致；Nfkbia在分化中急剧诱导后被雌酮剂量依赖性削减，提示雌酮在该区室也调节NF-κB张力；但p-AKT未升高反而随分化下降，不支持雌酮通过开启PI3K-Akt发挥作用的预期，故研究人员倾向于修正解释：雌酮主要经MAPK/ERK促进BMSC成骨，NF-κB减弱为次要影响，而非通过PI3K-Akt激活；10 nM优于100 nM的双相剂量反应与类固醇激素对骨细胞的非单调行为一致，确定10 nM为本体系的有效浓度。从转化角度看，十基因诊断面板可能对早期骨质疏松风险分层有实用价值，尤其对绝经后妇女常规血液检查；外周血单核细胞易于获取，基于这十个转录本的靶向基因表达检测原则上可补充基于DXA的骨密度筛查。治疗方面，对接结果指向雌酮及相关类固醇激素为鹿茸药理活性最强的成分，其对MAPK1、PIK3R1和SRC的结合亲和力可与已知小分子激酶调节剂媲美；但这些化合物口服鹿茸制剂后能否在骨髓达到治疗浓度仍需药代动力学研究。局限性包括：化合物-靶点相互作用来自 curated 数据库，不可避免遗漏部分代谢物；转录组训练集GSE56815来自外周血单核细胞而非骨组织，但单核细胞是真正的破骨前体，数据并非与生物学无关；单细胞分析依赖样本量适中的单一数据集GSE169396，独立重复将显著增强细胞类型发现；标记基因验证确认SingleR注释对采样充分的群体得到良好支持，但簇大小极不均匀，血小板和角质形成细胞等群体仅含1或2个细胞，其枢纽基因表达值反映单细胞转录组而非验证的群体水平模式，不应过度解读；ssGSEA和枢纽基因-免疫细胞相关性分析未对28种免疫细胞类型的多重比较进行校正，应视为假设生成而非确证；分子对接仅捕捉结合的静态快照，不反映蛋白柔性、代谢稳定性或组织分布，PRKACB和PRKACG因缺乏解析晶体结构未能对接，未来可用AlphaFold预测模型重新考察；确证这些计算预测最终需要表面等离子共振、报告基因实验或免疫共沉淀等 bench 实验；自身验证虽确认雌酮的成骨效应，但仅检测BMSC（成骨谱系）区室的四个转录本，未检验预测的髓系/破骨臂；蛋白水平测量的是总ERK1/2而非磷酸化ERK，p-AKT未测定总AKT，NF-κB活性仅由Nfkbia转录本推断而非p65磷酸化，故实验得出的机制图景是方向性的而非确定性的。研究结论部分翻译如下：鹿茸是一种作用于骨髓免疫微环境中PI3K-Akt/MAPK/NF-κB网络的多组分药物；本文描述的十基因诊断面板和细胞类型表达图谱可指导未来更精准的抗骨质疏松干预；在已鉴定的基因中，RHBDF2/iRhom2尤为突出——它是TNF-α剪切的调节因子，在本数据集中于Pro-B细胞和巨噬细胞中最突出，此前未与骨质疏松诊断相关联；RHBDF2/iRhom2能否成为可行的治疗靶点仍是一个开放问题，值得严格的实验探索。
