《Frontiers in Microbiology》：Antifungal activity of pyrrolnitrin produced by Burkholderia seminalis strain R456 against Alternaria brassicicola in broccoli
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摘要 引言：由Alternaria brassicicola引起的黑斑病显著降低西兰花的产量与品质。对环境污染和杀菌剂抗性的日益关注，促使人们将有益微生物作为植物病害可持续生物防治剂的兴趣不断增加。方法：本研究评价了源于水稻根际的细菌Burkholderia
摘要 引言：由Alternaria brassicicola引起的黑斑病显著降低西兰花的产量与品质。对环境污染和杀菌剂抗性的日益关注，促使人们将有益微生物作为植物病害可持续生物防治剂的兴趣不断增加。方法：本研究评价了源于水稻根际的细菌Burkholderia seminalis R456所产无细胞培养滤液（cell-free culture filtrates，CFFs）对A. brassicicola的离体（in vitro）和活体（in planta）抗真菌活性，并探究了与所观察到的抗真菌效应相关的候选生物活性代谢物。结果与讨论：R456 CFF以发酵时间和浓度依赖的方式抑制菌丝生长；发酵5 d后获得的滤液表现出最佳活性，在平板试验条件下50% CFF引起完全或近乎完全的抑制。该滤液将分生孢子萌发率降至3.87%。显微观察显示，CFF处理与A. brassicicola显著的形态异常相关，包括菌丝和分生孢子的变形、皱缩、塌陷及表面不规则。在受控条件下的活体试验表明，R456 CFF可抑制黑斑病，在离体叶片和整株植物上的防效分别达到71.56%和70.72%。在受试各组分中，100%乙醇洗脱组分表现出最佳活性，与真实标准品的LC-MS/MS比对支持吡咯菌素（pyrrolnitrin）为重要的候选抗真菌代谢物。利用吡咯菌素标准品进行的功能验证进一步显示出浓度依赖性的病害抑制效果，50 mg/L时在离体叶片和整株植物上的防效分别为100%和96.50%。总体而言，这些发现支持R456源胞外代谢物作为潜在抗真菌资源，并提供了吡咯菌素在A. brassicicola-西兰花病理系统中具有生物学活性的直接证据；然而，其定量贡献仍有待阐明。
研究背景方面，西兰花（Brassica oleracea var. italica）是重要蔬菜作物，其商品价值高度依赖叶片和花球品质。由Alternaria brassicicola引起的黑斑病通过侵染地上部组织造成坏死病斑、褪绿、叶枯和花球腐烂，严重威胁西兰花生产与品质。该病原菌可经带菌种子和种苗传播，在中国浙江部分主产区快速蔓延；十字花科作物长期连作、病残体田间留存及带菌种子使用，均有利于病原菌在土壤中存续，增加后续生长季病害暴发风险。A. brassicicola的坏死营养型生活方式使病害一旦建立即难以治理。当前防控主要依赖清洁种子、抗病品种、田园卫生、农艺措施和杀菌剂，但杀菌剂长期反复使用导致田间抗药性上升并引发公众与环境担忧。微生物生防菌可通过营养竞争、诱导抗性、产生裂解酶和抗菌代谢物等途径抑制植物病原菌，因而成为重要的补充策略。Burkholderia属代谢多样，可产生吡咯菌素、吩嗪、铁载体、挥发性物质、非核糖体肽、环二肽和聚酮等多种抗菌化合物，部分植物相关菌株已被报道可促进植物生长并抑制病原菌。研究人员前期研究表明，源于水稻根际的Burkholderia seminalis菌株R456可抑制Rhizoctonia solani菌丝生长，环（Phe-Pro）（cFP）参与该互作；但在本研究的预备试验中，cFP在所测试条件和浓度范围内对A. brassicicola未表现出明显拮抗效应，故本研究未将cFP作为生物活性导向分析的重点。鉴于A. brassicicola作为十字花科作物病原真菌的重要性，有必要鉴定具有可重复抗真菌活性且环境相容的微生物资源；表征胞外代谢物尤为重要，因为分泌型化合物可直接参与病原菌抑制，有助于明确生防活性的化学基础并为天然抗真菌产品开发提供先导。因此，本研究旨在确定菌株R456及其分泌代谢物能否抑制该西兰花病原菌，并将所观察到的活性与经实验支持的候选代谢物相关联。生物活性导向分离结合LC-MS/MS可有效缩小活性成分范围并通过与真实标准品比对鉴定候选活性化合物，但仅凭分析匹配不足以证明候选化合物能重现所观察到的生物学表型，因此用真实标准品在寄主病害系统中直接测试病原菌构成化学鉴定的重要功能补充。本研究目的是评价B. seminalis菌株R456及其胞外代谢物能否在离体条件下于多个发育阶段抑制A. brassicicola，并在受控条件下减轻西兰花黑斑病。研究人员考察了活细胞拮抗作用以及不同发酵时间和浓度所得CFF的活性，通过测定菌丝生长、量化分生孢子萌发、观察真菌表面形态以及评价离体叶片和整株植物的病害抑制效果进行评估；最后通过生物活性导向分离结合LC-MS/MS并与真实吡咯菌素标准品比对，探究与抗真菌活性相关的代谢物，并进一步在平板抑制试验及离体叶片和整株植物防病试验中直接评价吡咯菌素标准品，以确定该候选代谢物能否在A. brassicicola-西兰花病理系统中重现抗真菌和防病活性。本研究的创新性不仅在于发现吡咯菌素是B. seminalis菌株R456的一种抗真菌化合物，还在于整合了活细胞拮抗、CFF活性测定、代谢物分析、真实标准品比对以及吡咯菌素在平板、离体叶片和整株植物试验中的直接验证，以考察特定的R456-CFF-A. brassicicola-西兰花系统，提供了从离体拮抗细菌到胞外抗真菌活性、候选代谢物鉴定及多种受控条件下病害抑制的连续证据链。因此，吡咯菌素被解释为经实验支持且具有生物学活性的候选抗真菌代谢物，而其相对于其他R456代谢物的定量贡献仍有待阐明。
关键技术方法方面，研究人员采用平板对峙培养法评价R456活细胞对A. brassicicola的拮抗作用；制备不同发酵时间（1~5 d）的R456无细胞培养滤液，并以不同浓度掺入PDA培养基测定其对菌丝生长的抑制作用；采用分生孢子萌发试验量化萌发率；利用扫描电子显微镜（SEM）观察菌丝和分生孢子表面形态变化；在离体叶片和整株植物上开展防病试验，通过病斑面积比、病情指数和防效评价病害抑制效果；采用AB-8大孔吸附树脂吸附及梯度乙醇洗脱进行生物活性导向分离，结合LC-MS/MS与真实吡咯菌素标准品比对进行候选代谢物鉴定，并用吡咯菌素标准品在平板、离体叶片和整株植物试验中进行功能验证。病原菌A. brassicicola由浙江省农业科学院蔬菜研究所Yusen Shen博士提供，分离自中国浙江省感病西兰花植株；供试西兰花品种为“Lisong”。
结果部分：3.1 菌株R456抑制A. brassicicola菌丝生长并诱导菌丝异常。通过平板对峙培养发现，与仅接种病原菌的对照相比，R456共培养限制了A. brassicicola菌落扩展，并在R456接种点附近形成清晰抑菌带；光学显微镜观察显示对照菌丝连续、形态规则且正常延伸，而抑菌带边缘菌丝弯曲、变细并呈异常生长模式，这些观察记录了7 d终点的生长受限及相关菌丝形态变化，但未区分抑菌与杀菌效应。3.2 菌株R456滤液以发酵时间和浓度依赖方式抑制菌丝生长。通过比较不同发酵时间CFF对菌丝生长的影响发现，与匹配的无菌LB对照相比，R456 CFF抑制菌落扩展且净抑制效应随发酵时间延长而增强；随发酵时间由1 d延长至5 d，菌落直径减小而菌丝生长抑制率升高，1 d和2 d滤液抑制作用相对较弱，4 d和5 d滤液活性较强，表明在所测试发酵期内CFF总体抑制活性增强，但因未对各批次单个代谢物进行绝对定量，该结果不应解释为证明任一单一化合物积累。进一步以5 d R456 CFF不同浓度掺入PDA评价浓度依赖抑制活性发现，随CFF浓度由5%增至50%，A. brassicicola菌落变小；在培养3、5和7 d时，CFF处理平板菌落直径均低于匹配对照，菌丝生长抑制率相应升高，50% CFF在平板试验条件下引起完全或近乎完全抑制，该50%水平为实验筛选浓度，不应解释为自然暴露浓度。3.3 菌株R456发酵滤液抑制分生孢子萌发并造成菌丝和分生孢子结构损伤。通过分生孢子萌发试验发现，12 h后无菌水对照多数分生孢子已萌发并形成明显芽管，萌发率为84.55%，LB broth处理略低为75.45%，而R456 CFF使分生孢子萌发率降至约3.87%，嘧菌酯阳性对照几乎完全抑制萌发；图4E定量值来自三次独立生物学重复每次至少100个分生孢子（每处理至少300个分生孢子），并非来自图4A~D所示单个代表性显微视野；代表性图板间分生孢子大小的表观差异未作为定量形态终点，不应解释为CFF诱导膨大的证据。扫描电子显微镜进一步显示，未处理菌丝和分生孢子表面相对光滑规则，而CFF处理样品出现变形、皱缩、塌陷、表面粗糙化及其他不规则表面特征，这些观察与CFF处理后真菌表面形态改变一致；但本研究SEM未将细胞壁和细胞膜分辨为独立结构，也未直接测定细胞膜通透性、细胞壁组成和氧化应激，因此这些图像不应解释为特定膜或细胞壁损伤机制的直接证据。3.4 菌株R456滤液减轻A. brassicicola在离体西兰花叶片和整株植物上的侵染。通过离体叶片试验发现，阴性对照（水）和LB broth处理病斑广泛发展，而R456 CFF和嘧菌酯处理显著减轻病斑发展；病斑面积比在阴性对照（水）中为5.88%，LB broth处理为6.29%，R456 CFF处理为1.66%，嘧菌酯处理为0.79%；相对于阴性对照（水），R456 CFF和嘧菌酯在受控离体叶片试验条件下的防效分别为71.56%和86.17%。整株植物试验观察到类似响应，阴性对照（水）发病率100.00%，LB broth处理86.90%，R456 CFF处理后34.44%，嘧菌酯处理后28.15%；病情指数在阴性对照（水）中为72.69，LB broth处理为65.87，R456 CFF为21.25，嘧菌酯为12.96；相对于阴性对照（水），R456 CFF和嘧菌酯相应防效分别为70.72%和82.20%；实验期间未观察到可归因于未稀释CFF处理的明显褪绿、坏死、萎蔫或可见生长抑制，这些发现支持受控条件下的病害抑制潜力，但独立生物学重复数有限（n = 3）需谨慎解释。3.5 活性导向分离和LC-MS/MS分析鉴定吡咯菌素为候选抗真菌代谢物。通过AB-8大孔吸附树脂吸附并依次用递增浓度乙醇洗脱发现，在平板抑制试验中100%乙醇洗脱组分在24 h和48 h均产生最明显抑菌带，而75%、50%和25%乙醇洗脱组分及水和乙醇对照抑制微弱或可忽略，嘧菌酯阳性对照显示稳定抗真菌活性，表明在所采用分离条件下活性富集于高乙醇组分，但仅凭抑菌带大小不能直接比较粗CFF与纯化组分的内在效价，因回收率、浓度、溶解度、稳定性和琼脂扩散可能不同。随后用吡咯菌素标准品进行平板抑制试验和LC-MS/MS比对发现，较高吡咯菌素浓度下可见对A. brassicicola的抑制，平板试验呈明显浓度依赖模式；LC-MS/MS分析显示活性R456组分含有与吡咯菌素标准品保留时间一致的色谱特征，其MS/MS碎片模式与标准品高度相似；这些数据共同支持吡咯菌素为与R456 CFF抗真菌活性相关的重要候选代谢物，但粗CFF中吡咯菌素实际浓度未测定，故图7B所用标准品浓度的生物学相关性不能直接确立；此外，分离可能去除粗CFF中存在的挥发性或半挥发性化合物、不同极性代谢物或加和/协同组合，因此其他共洗脱或非共洗脱代谢物也可能贡献总体抗真菌效应，需靶向定量和单化合物/组合活性试验以解析其相对贡献。3.6 吡咯菌素（标准品）在离体叶片和整株植物上抑制西兰花黑斑病。通过离体叶片试验发现，施用吡咯菌素（标准品）以浓度依赖方式减轻黑斑病发展，病斑面积比由1%甲醇溶剂对照的10.46%降至1、5、10和50 mg/L吡咯菌素处理的7.15%、3.08%、1.13%和0.00%；所有吡咯菌素浓度相对于溶剂对照均显著减小病斑面积（p < 0.05），尽管10和50 mg/L处理间病斑面积无显著差异；相应防效分别为31.45%、70.16%、88.97%和100%，最高测试浓度在离体叶片试验条件下完全阻止可见病斑发展。整株植物试验观察到类似浓度依赖响应，发病率在1%甲醇对照中为100%，1 mg/L时仍为100%，5 mg/L时为85.52%，10和50 mg/L时分别降至44.88%和9.72%；1和5 mg/L发病率与溶剂对照无显著差异，而10和50 mg/L降低显著（p < 0.05）；病情指数由溶剂对照的70.65降至1、5、10和50 mg/L的58.58、38.29、11.22和2.43，所有吡咯菌素处理相对于溶剂对照均显著降低病情指数，10和50 mg/L间无显著差异；相应防效分别增至17.17%、45.83%、84.02%和96.50%；这些结果表明外源施用吡咯菌素在受控条件下于离体叶片和整株植物试验中均抑制A. brassicicola病害发展。
讨论部分总结：本研究结果表明，B. seminalis菌株R456的CFF在受控条件下抑制A. brassicicola菌丝生长和分生孢子萌发，并减轻离体叶片和整株西兰花黑斑病发展；此外，吡咯菌素（标准品）在平板试验中直接抑制A. brassicicola，并以浓度依赖方式在离体叶片和整株植物上抑制黑斑病。微生物生防菌通常通过多种可能重叠的机制而非单一途径抑制植物病害；对峙培养中真菌生长受限可能反映胞外代谢物、挥发性有机化合物（VOCs）、营养竞争、空间竞争或其综合效应，而植物相关响应也可能在活体中起作用；去除活细菌细胞后CFF仍保留抑制活性，支持分泌型胞外产物的贡献，但本研究数据未确立任一单一机制单独或主要介导R456总体拮抗活性。与CFF抑制活性一致，R456对峙培养限制A. brassicicola菌落扩展并伴异常菌丝形态，CFF处理伴SEM观察到的变形、皱缩、塌陷等不规则表面特征；这些形态变化更宜解释为抗真菌胁迫的表型后果而非机制本身。吡咯菌素已被报道抑制S. cerevisiae真菌呼吸电子传递，在Neurospora crassa中可干扰渗透信号转导并诱导分生孢子膨大、破裂和异常萌发，这些扰动为吡咯菌素或R456 CFF中其他活性代谢物贡献所观察菌丝和分生孢子异常提供了可能机制；但由于未在A. brassicicola中直接测定这些生理和分子过程，该解释仍为假说而非已证明机制。本研究表明发酵时间和浓度均影响无细胞滤液对A. brassicicola菌丝生长的抑制活性，发酵5 d滤液在50%浓度时对菌丝生长抑制最大，这与许多既往研究一致，即拮抗微生物滤液对植物病原菌的抑制效应随发酵时间和滤液浓度增加而增强。A. brassicicola等病原真菌成功侵染西兰花依赖有效菌丝生长和分生孢子萌发；本研究中对照处理分生孢子萌发率约85%表明孢子有活力，而5 d发酵CFF相对于对照引起超过95%的分生孢子萌发抑制；此外SEM观察表明5 d发酵CFF也破坏分生孢子形态，这可能是真菌孢子萌发率显著降低的主要原因。活体试验是平板拮抗试验的重要延伸，因为微生物制剂效力常受多种自然和环境因素影响，强离体活性并不总能转化为可靠活体防病；本研究中R456 CFF相对于阴性对照（水）在受控条件下于离体叶片和整株植物上防效分别为71.56%和70.72%，表明CFF在两种试验形式中均显示病害抑制活性，但生物学重复数有限且缺乏田间验证，意味着该效应的稳定性和实际幅度应谨慎解释。本研究中100%乙醇洗脱组分在所采用分离条件下回收各组分中抑菌带活性最强，该组分中LC-MS/MS特征在保留行为和碎片模式上与真实吡咯菌素标准品匹配；用真实标准品进行的额外生物学试验通过显示吡咯菌素本身可直接抑制A. brassicicola并抑制西兰花病理系统中病害，强化了该化学关联；然而这些观察并未表明吡咯菌素解释粗滤液全部甚至大部分活性，R456 CFF为复杂代谢物混合物，其他次生代谢物可能独立或通过加和或协同互作贡献。这也与研究人员前期研究中cFP参与R456对R. solani活性相关；两个系统间差异可能反映病原菌依赖敏感性、发酵或试验条件及混合物效应，因此本研究结果不应解释为证明靶标物种单独决定活性代谢物谱。吡咯菌素已被视为Burkholderia及其他生防细菌中抑制真菌病原菌的成熟抗真菌代谢物；近期研究揭示了吡咯菌素生产相关基因，例如Chen等（2021）显示Pseudomonas chlororaphis G05中LysR型转录调控基因FinR缺失显著降低吡咯菌素生物合成操纵子转录和吡咯菌素产量，从而削弱菌株抗真菌代谢物生产系统；Ajijah等（2023）在Pseudomonas protegens ML15中鉴定出完整吡咯菌素生物合成基因簇，其细菌培养物和无细胞上清抑制Botrytis cinerea并减轻采后番茄果实灰霉病发展，提示吡咯菌素可能与该菌株产生的其他代谢物共同贡献抗真菌活性；这些近期发现为理解吡咯菌素产生机制提供了分子基础。重要的是，独立研究也提供了吡咯菌素可贡献病害抑制的植株水平证据：Howell和Stipanovic（1979）报道在R. solani污染的土壤中播种时用吡咯菌素处理棉籽使幼苗存活率由13%提高至70%；Pawar和Chaudhari（2020）显示以30 μg/mL吡咯菌素拌种保护Vigna radiata对抗Fusarium oxysporum，并相对于病原菌挑战对照改善种子萌发和植株生长；此外Huang等（2018）利用prn生物合成操纵子缺失和互补证明吡咯菌素对P. chlororaphis G05介导的Fusarium graminearum抑制及谷类作物抗赤霉病生物保护至关重要；这些研究共同为吡咯菌素的植株水平防病潜力提供了独立生物学支持。外源施用吡咯菌素的直接验证强化了本研究特定A. brassicicola-西兰花病理系统中化学鉴定与生物学功能之间的联系；两种试验形式中病害抑制均随吡咯菌素浓度增加而增强，10 mg/L时离体叶片和整株植物防效分别达88.97%和84.02%，50 mg/L时分别达100%和96.50%；较低浓度下整株植物防效低于离体叶片（1 mg/L时17.17%对31.45%，5 mg/L时45.83%对70.16%），该差异可能反映完整植株更大的结构和生理复杂性、处理分布和保留差异或其他寄主和微环境因素，但这些可能性未直接测试；由于每个吡咯菌素处理和匹配溶剂对照均含相同终浓度1%（v/v）甲醇，吡咯菌素处理间浓度依赖差异不能归因于甲醇浓度变化；这些实验证明外源施用吡咯菌素足以在受控条件下抑制黑斑病，但R456 CFF中吡咯菌素天然浓度仍未知，故标准品试验不能量化CFF活性中有多少归因于吡咯菌素或排除其他代谢物贡献；需对R456 CFF中吡咯菌素进行靶向定量，随后进行匹配浓度比较和吡咯菌素生物合成遗传验证，以解析其相对贡献。文献比较也将本研究创新性置于更适当背景：Zameer等（2025）显示纯化吡咯菌素抑制A. alternata产孢，而A. alternata与A. brassicicola为同属真菌，可能共享生理特征和对相关抗真菌代谢物的敏感性；因此对A. brassicicola的活性不应解释为吡咯菌素本身代表新发现抗真菌原理或根本不同作用模式的证据；然而A. brassicicola与Brassica作物密切相关且是西兰花黑斑病重要病原，为该病理系统中独立评价提供了生物学相关性；据此本研究贡献在于对特定R456-CFF-A. brassicicola-西兰花系统的整合评价，结合活细胞拮抗、CFF测定、代谢物分析、真实标准品确认、吡咯菌素直接生物活性测定及离体叶片和整株植物防病试验；在此框架内，吡咯菌素为经实验支持并功能验证的候选代谢物，而吡咯菌素和其他代谢物对完整CFF活性的定量贡献仍未解决。微生物制剂生物安全性日益受到关注，这对Burkholderia属尤为重要，该属既包括有益植物相关菌株也包括机会性人类病原菌；基于基因组的毒力和抗微生物耐药决定簇筛查应先于活菌农业应用；然而源自该菌株的代谢物产品可能降低与活细胞应用相关的担忧，但仍需在温室和田间条件下进行毒理学和环境评估；本研究吡咯菌素试验提供了直接效力证据，但在受控条件下进行且未包括专门用于正式植物毒性评价的未接种吡咯菌素系列；进一步工作应定量R456 CFF中吡咯菌素，在匹配生物学相关浓度下比较CFF与纯化吡咯菌素，利用功能遗传方法研究吡咯菌素生物合成基因，评价与有益微生物的相容性及对其他Brassica病原菌的效应，并在多变田间条件下验证效力和生物安全性。
结论部分翻译：本研究结果表明，B. seminalis菌株R456的无细胞培养滤液在受控条件下抑制A. brassicicola菌丝生长和分生孢子萌发，改变真菌表面形态，并减轻离体叶片和整株植物上的西兰花黑斑病。100%乙醇组分在回收各组分中活性最强，与真实标准品的LC-MS/MS比对支持吡咯菌素为重要候选代谢物。与该鉴定一致，吡咯菌素（标准品）显示出直接的、浓度依赖的抗真菌和防病活性；50 mg/L时离体叶片和整株植物防效分别达100%和96.50%。总之，这些结果提供了吡咯菌素在A. brassicicola-西兰花病理系统中具有生物学活性的直接功能证据，并强化了其可能贡献R456 CFF相关活性的证据。然而，由于R456 CFF中吡咯菌素绝对浓度未测定且其他代谢物未被排除，其对完整CFF贡献的幅度尚不能量化。因此，在确定吡咯菌素或R456源代谢物产品的具体贡献和实际防控潜力之前，需进行靶向代谢物定量、功能遗传验证、生物安全性评估和田间评价。
