《Frontiers in Molecular Neuroscience》：DNA methylation and gene expression patterns across brain regions following chronic social defeat stress
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背景：慢性社会应激可诱导持久的行为和分子改变，但表观遗传与转录反应在应激反应性脑区之间如何协调仍不清楚。方法：研究人员整合了慢性社会挫败应激（CSDS）小鼠模型中海马（HP）、伏隔核（NAc）和前额叶皮层的全基因组DNA甲基化与转录组图谱。探索性分析包括鉴定候
背景：慢性社会应激可诱导持久的行为和分子改变，但表观遗传与转录反应在应激反应性脑区之间如何协调仍不清楚。方法：研究人员整合了慢性社会挫败应激（CSDS）小鼠模型中海马（HP）、伏隔核（NAc）和前额叶皮层的全基因组DNA甲基化与转录组图谱。探索性分析包括鉴定候选差异甲基化探针（DMPs）和差异表达基因（DEGs）、基因位点水平整合、基于网络的分析以及经实验性应激暴露校正的中介分析。结果：在各脑区均鉴定到候选甲基化和表达变化，区域间候选列表重叠有限。基因位点水平整合在NAc中鉴定到8个DMP相关基因、在HP中鉴定到1个同时符合候选DEG标准的基因。经错误发现率校正后，一个海马共表达模块与社交回避的个体差异显著相关，而一个共甲基化模块与同一行为指标呈名义关联。这些模块的特征基因（eigengenes）呈正相关，其共享基因在白细胞介素-1产生和持久性突触增强调控方面显示名义基因本体（GO）富集。经实验性应激暴露校正后，探索性中介分析提示海马甲基化模块与社交回避之间可能通过表达模块存在间接关联。结论：这些发现描述了三个脑区的甲基化和表达模式，并突出了与社交回避相关的海马分子网络。整合表观基因组和转录组信息可能为应激相关行为个体差异的分子基础提供互补性见解，并为未来研究产生假设。
研究背景方面，慢性应激是抑郁及其他应激相关精神疾病的主要环境风险因素，但个体对同等应激暴露的行为反应存在显著差异。慢性社会挫败应激（CSDS）已被广泛用于研究这种异质性的生物学基础，可区分易感与弹性表型，并伴随不同的分子、细胞和环路适应。既往研究表明这些适应具有高度脑区特异性：在伏隔核（NAc）和内侧前额叶皮层中，CSDS诱导的神经元活动、突触功能和树突结构变化与应激相关行为有关；应激易感性和弹性还与区域特异性转录程序、NAc和海马（HP）中的代谢与线粒体适应以及涉及中枢和外周的炎症信号有关。然而，这些分子和细胞变化在应激反应性脑区之间如何相互协调仍不完全清楚。表观遗传调控可能参与持续性应激诱导的脑功能改变，DNA甲基化因对环境因素敏感且与转录调控相关而尤为重要。应激相关动物研究已在多个脑区鉴定到DNA甲基化改变，但受影响位点和通路因实验条件和组织而异。在NAc中，CSDS改变Dnmt3a表达，操纵DNA甲基化可影响应激相关行为和神经元可塑性；HP中DNA甲基化改变与应激易感性相关，CSDS后HP和前额叶皮层（PFC）特定位点也有报道。全基因组研究进一步鉴定了皮层中与转录变化相关的应激表观基因组改变以及CSDS后NAc中广泛的甲基化改变。整合DNA甲基化和基因表达有助于表征这两个分子层之间的关系，而基于网络的方法可捕捉单个位点不明显的协调变异。本研究整合了同一批CSDS小鼠匹配的HP、NAc和PFC样本的全基因组DNA甲基化和转录组数据，首先表征各脑区候选甲基化和基因表达改变并检查基因位点水平的两层重叠，然后分别构建各脑区的共甲基化和共表达网络以鉴定与社交回避个体差异相关的协调分子模块。通过结合多区域图谱与基因位点及网络水平整合，研究人员试图确定慢性社会应激如何在脑区和不同分子组织水平上得到反映。
在技术方法上，研究人员采用7–9周龄雄性C57BL/6N小鼠与雄性退役种鼠ICR小鼠（购自Charles River Laboratories Japan），建立10天CSDS模型并以社交互动测试进行行为表型分型（易感、弹性、未分类），采集HP、NAc和PFC组织；使用Infinium Mouse Methylation BeadChip进行全基因组DNA甲基化谱分析（60个样本，经minfi预处理、Noob归一化、质控后保留266,787个常染色体CpG探针），并以RNA测序（Illumina NovaSeq 6000，paired-end 150 bp）进行转录组分析（STAR比对、RSEM定量、edgeR准似然框架差异分析）；采用基因位点水平整合比较DMP相关基因与DEGs，并使用加权基因共表达网络分析（WGCNA）分别构建共甲基化和共表达网络，通过线性回归（以实验性应激暴露为协变量）检验模块特征基因与回避行为百分比的关联，最后采用中介分析评估跨组学间接关联。
研究结果方面，第一，CSDS诱导社交互动反应下降：经过10天社会挫败应激后，CSDS暴露小鼠在目标鼠存在时互动区时间显著减少（配对t检验，p = 0.022）、回避区时间显著增加（p = 0.002）；与对照组相比，CSDS小鼠互动区时间下降幅度（p = 0.014）和回避区时间增加幅度（p = 0.011）均显著更大；CSDS小鼠行为反应存在明显个体差异，按互动百分比（POI）和回避百分比（POA）标准分类为6只易感、3只弹性、1只未分类；CSDS小鼠社交互动（SI）比值低于对照组（Welch's t检验，p = 0.006）。第二，甲基化谱具有脑区差异性：质控后甲基化谱的主成分分析（PCA）显示HP、NAc和PFC样本清晰分离，表明全基因组DNA甲基化模式存在显著脑区特异性差异；FDR校正后无探针显著，故按预设标准鉴定候选DMPs：HP 69个（43个高甲基化、26个低甲基化）、NAc 1,040个（570个高甲基化、470个低甲基化）、PFC 47个（28个高甲基化、19个低甲基化）；GO富集分析显示HP高甲基化DMP相关基因富集于机械感觉行为、锌离子细胞反应、抑制性突触组装和单链RNA结合等术语，NAc高甲基化DMP相关基因富集于钙相关和突触功能、低甲基化DMP相关基因富集于Wnt信号和突触术语，PFC高甲基化DMP相关基因富集于肌质网和前缘膜、低甲基化DMP相关基因富集于白细胞分化调控、血细胞生成和凋亡过程。第三，转录组谱具有脑区差异性：基于TPM的表达谱PCA同样显示三脑区分离；因FDR校正后HP仅11个基因、PFC仅9个基因显著，故按预设标准鉴定候选DEGs：HP 445个（167个上调、278个下调）、NAc 571个（395个上调、176个下调）、PFC 474个（273个上调、201个下调）；GO富集分析显示HP上调候选DEGs富集于抗氧化和受体活性、下调基因富集于有机酸转运和突触膜相关术语，NAc上调基因富集于免疫相关功能、下调基因富集于生长因子活性，PFC上调基因富集于氧转运和血红素/血红蛋白相关功能、下调基因未检测到富集。第四，DMP相关基因与DEGs的跨脑区重叠有限：无DMP在三个脑区共享，4个候选DEGs为三脑区共有；基因位点水平整合仅在HP鉴定到1个重叠基因（L1td1上游1–5 kb位点高甲基化伴表达下降）、NAc鉴定到8个重叠基因（启动子相关甲基化变化伴反向和同向表达变化，两个内含子高甲基化伴表达增加，内含子和第一外显子低甲基化伴表达增加，Kcnk15外显子低甲基化伴表达下降），PFC无重叠。第五，基于网络的分析鉴定到行为相关模块：WGCNA在各脑区独立进行，共甲基化分析在HP、NAc、PFC分别鉴定到19、8、7个模块，共表达分析分别鉴定到9、12、12个模块；经应激暴露校正的线性回归显示5个模块与POA名义相关，最强关联为HP表达turquoise模块与POA负相关（estimate = ?0.906，p = 0.0003，FDR = 0.0023）且FDR校正后仍显著，限制于CSDS暴露动物时该负关联仍显著（estimate = ?0.871，p = 0.0022）；HP甲基化tan模块与turquoise模块呈名义正相关（Spearman's ρ = 0.47，未校正p = 0.04997），且与POA呈名义负相关（estimate = ?0.797，p = 0.0037）；HP表达turquoise模块含5,814个基因，主要富集于RNA加工和线粒体功能相关生物学过程，其模块特征基因与测序指标无显著相关，仅Snap25和Syn1两个神经元标记呈名义显著相关；HP甲基化tan模块含338个探针相关基因，富集于钙黏蛋白信号相关过程；两模块共享60个基因，FDR校正后无显著GO术语，但名义富集术语包括白细胞介素-1产生正调控（由Hmgb1、Nlrp1b和Malt1代表）和持久性突触增强调控（由Adcy8、Paip2和Nptn代表）。第六，跨组学关系表征行为相关海马网络：中介分析显示经应激暴露校正后，甲基化tan模块与表达turquoise模块正相关（β = 0.59，p = 0.01），表达turquoise模块与POA负相关（β = ?0.46，p < 0.01），平均因果中介效应（ACME）显著（β = ?0.27，p = 0.049），而甲基化tan模块对POA的平均直接效应（ADE）不显著（p = 0.13），提示海马甲基化tan模块与回避行为之间可能通过表达turquoise模块存在间接关联。
讨论部分总结了本研究的主要发现：甲基化和转录组谱均按脑区强烈组织，候选DMP和DEG列表在HP、NAc和PFC之间重叠有限；基因位点水平整合在HP鉴定到1个重叠基因、NAc 8个、PFC无；基于网络的分析揭示了HP中共甲基化和共表达模块与社交回避个体差异相关的独特模式。与既往研究比较，与Bagot et al. (2016)比较在HP、NAc和PFC分别鉴定到9、4和13个重叠候选DMP相关基因，包括三脑区共有的S100a8、S100a9和Lrg1以及HP和PFC中的Lcn2；NAc中96个候选DMP相关基因与O'Toole et al. (2026)报道共享，包括Adcy5、Itpr1和Rbfox1；PFC中分别有7个和14个候选DMP相关基因与Kuehner et al. (2023)报道的3月龄和6月龄小鼠皮层差异甲基化基因共享，Tiam1和Tshz3在两个年龄均重叠。重叠基因的功能注释提供假设：HP中L1td1编码主要在多能干细胞中研究的RNA结合蛋白；NAc中Lncpint编码氧化应激诱导的长非编码RNA，Kcnk15编码TASK-5双孔域钾通道亚基，Wfikkn2编码GDF8和GDF11的细胞外拮抗剂。尽管HP中单个DMP相关基因和DEG重叠较少，网络分析鉴定到经应激暴露校正和FDR校正后仍与POA显著相关的共表达模块，共甲基化模块也呈名义关联，提示HP协调分子变异可捕捉基因位点水平分析不明显的社交回避个体差异。共享基因的名义术语涉及白细胞介素-1产生和持久性突触增强调控，其中Hmgb1已在前额叶神经元中与重复CSDS诱导的社交回避相关联。中介分析为行为相关网络间的跨组学关系提供了额外支持，但不应解释为因果通路证据。研究局限性包括：样本量相对较小（尤其易感与弹性亚组分类后），可能限制统计功效及差异和网络分析的稳定性；候选DMPs和DEGs采用名义统计阈值与效应量标准的预设组合而非全基因组校正，个体位点应视为需独立重复的候选，候选列表重叠仅作描述性解释；DNA甲基化和基因表达在批量组织中测量，无法确定变化来源于特定神经元或胶质细胞群体还是细胞组成变化，且Mouse Methylation BeadChip仅检测部分基因组CpG位点；甲基化、表达和行为在单一终末时间点评估，无法推断时间或因果 relationships；目标缺失和目标存在 sessions 连续两天固定顺序进行，session间差异和SI比值可能反映日期、顺序或习惯化效应；研究仅限于雄性小鼠和三个脑区，限制跨性别和其他应激反应性神经环路的推广。未来需要更大队列、细胞类型分辨和纵向方法以及独立重复来确立这些跨组学关联的稳健性和机制意义。研究结论翻译：这些发现描述了三个脑区的甲基化和表达模式，并突出了与社交回避相关的海马分子网络。整合表观基因组和转录组信息可能为应激相关行为个体差异的分子基础提供互补性见解，并为未来研究产生假设。
