在斑马鱼中，中枢神经系统中的血清素信号传导对于脊柱的正常形态发生是必需的

《Current Biology》：Serotonin signaling in the central nervous system is required for correct spine morphogenesis in zebrafish

　　亮点：
- tph2突变型斑马鱼在3周大时出现脊柱侧弯表型，并且随着年龄的增长而恶化。
- tph2+神经元与分泌Sspo的器官有接触，但在tph2突变体中Reissner纤维仍然完好无损。
- 受精后第二周和第三周，脊神经中的5-羟色胺能神经元数量增加。
- 在tph2突变体中，5-羟色胺能脊神经元及其投射选择性丧失。

摘要：
尽管青少年特发性脊柱侧弯（AIS）影响全球超过1%的儿童和青少年，但其原因尚不完全清楚。虽然5-羟色胺系统的缺陷与某些家族性AIS病例有关，但根本原因仍不明确。在过去十年中，斑马鱼已成为研究脊柱畸形机制的宝贵模型，揭示了纤毛、感觉反馈和Reissner纤维（RF）的作用。在色氨酸羟化酶2（tph2）突变型斑马鱼中，我们发现5-羟色胺（5HT）的缺乏会导致渐进性的三维脊柱错位，类似于人类的AIS。突变体幼鱼在受精后21天内发育正常，此时脊柱弯曲开始出现。与AIS一样，tph2突变体的畸形在矢状面和冠状面都会随着年龄的增长而恶化，但没有椎骨畸形。值得注意的是，Reissner纤维完好无损，但脊髓中缺乏5-羟色胺。从受精后到脊柱侧弯发生，脊神经中的5-羟色胺能神经元及其投射逐渐减少，到21天时所有5-羟色胺来源均被消除。我们的研究结果表明，5-羟色胺在胚胎后期脊柱发育过程中的对齐中起着关键作用。

图解摘要：
青少年特发性脊柱侧弯（AIS）是一种影响全球1.65%儿童和青少年的三维脊柱畸形，在欧洲和美洲的发病率更高（>2.5%）。异常脊柱弯曲通常在青春期生长高峰期出现，此时体重的迅速增加增加了脊柱的负荷，并且会随时间进展，尽管支具可以延缓病情并避免手术的需要。AIS是一种多因素疾病，具有遗传成分；相关基因的功能范围从纤毛结构、肌肉发育、激素受体到软骨和椎间盘的形成。神经成分也在AIS的病因中起作用。研究表明，轴突运动控制受损可能是原因之一，在该模型中，支配轴向肌肉的脊髓上投射在运动和姿势调整过程中接收来自周围感觉系统的反馈。因此，脊柱错位可能是由于大脑中心（如前庭系统）接收到的感觉反馈改变所致，前庭系统评估垂直位置并相应地调节运动行为以恢复正确的身体姿势。最近的研究显示，AIS患者在前庭刺激期间存在姿势控制缺陷。然而，一个重要问题仍未得到解答：是脊柱弯曲导致姿势控制能力丧失，还是姿势控制功能障碍导致了脊柱不对称？AIS通常在脊柱弯曲已经可见时被诊断出来，这使得在人类中研究姿势控制与脊柱弯曲之间的关系只能通过回顾性分析来进行。

遗传动物模型提供了感觉功能障碍与AIS脊柱畸形之间联系的证据。在哺乳动物中，背根神经节（DRG）中的本体感觉神经元将来自肌肉梭体和戈尔基腱器官（GTO）的信息传递到脊髓。多个DRG本体感觉神经元功能异常的遗传小鼠模型（如Runx3、Piezo2、Asic2突变体）会发展出脊柱畸形。影响中央管中纤毛运动的突变也会导致脊柱侧弯，因为这会阻碍脑脊液（CSF）的流动。在鱼类中，纤毛运动缺陷会破坏Reissner纤维（RF）的组装，这是一种从第三脑室延伸到中央管尾端的丝状细胞外蛋白质结构，鱼类无法形成直立的躯干。SCO-spondin（Sspo）蛋白的突变会导致躯干轴畸形，即使纤毛运动和CSF流动基本正常。Reissner纤维的丢失也会导致小鼠脊柱畸形，尽管程度不如鱼类严重。Reissner纤维对于涉及CSF的神经元（CSF-cNs）检测身体的机械弯曲是必要的；这些神经元投射到脊髓中的运动中枢（CPGs）并调节运动和姿势回路。斑马鱼的dmrt3a、eph4b和efnb3b功能丧失突变体分别影响抑制性dI6神经元和广泛的脊神经元，表现出运动CPGs缺陷、运动活性降低和左右协调能力差，并发展为脊柱侧弯。5-羟色胺（5HT）与某些人类AIS病例有关。TPH1启动子中的一个SNP突变与AIS的发生相关，携带该突变的患者对支具治疗的反应较差。有趣的是，色氨酸羟化酶2（tph2）ct817/ct817斑马鱼突变体被认为在成年后会发展出脊柱侧弯（Oikonomou等人的数据未显示）。tph2是5-羟色胺生物合成的限速酶之一，在斑马鱼中，它首先在精巢中表达，然后在受精后68小时在脊髓中表达。松果体是大脑中主要的5-羟色胺来源之一。早期研究表明，如果给去松果体的鸡腹腔内注射5-羟色胺前体5-HTP，它们不会出现脊柱弯曲。这些观察促使我们研究神经元5-羟色胺在斑马鱼胚胎后期发育过程中维持身体对齐的作用。我们表征了tph2突变型斑马鱼的脊柱错位情况，发现脊柱畸形在受精后约3周开始出现，最初集中在身体尾部，但随着鱼体的生长，胸部也会出现三维畸形。这些畸形与椎骨畸形无关，并且随着年龄的增长而恶化。我们在脊柱侧弯表型出现之前发现了5-羟色胺能神经元及其投射的特异性丧失。tph2纯合突变体的脊髓中5-羟色胺完全缺失，因为5-羟色胺的脊髓上投射也不存在。总的来说，我们的研究表明5-羟色胺在维持脊柱直立姿势的神经机制中起着关键作用。

结果：
- tph2ct817/ct817突变型斑马鱼幼鱼出现三维脊柱错位，这种错位随着年龄的增长而恶化，且不伴随椎骨畸形。
- 我们研究了tph2ct817突变型斑马鱼在发育过程中的纵向躯干轴形态（图1）。受精后6天和14天时，纯合突变体幼鱼的躯干轴在矢状面和冠状面都是直的（图1A和1B；平均体长±标准差：6天3.61±0.3毫米；14天6.22±0.18毫米）。受精后21天时（平均体长8.80±0.37毫米），tph2ct817/ct817在冠状面出现错位，但在矢状面没有（图1C）。畸形通常出现在尾部，且右侧比左侧更常见（图1Ci）。受精后3周是tph2ct817/ct817鱼脊柱错位开始的阶段。
- 图1：tph2ct817/ct817突变型斑马鱼幼鱼在受精后3周出现脊柱错位

图例说明：
(A–C) 野生型（WT）、tph2ct817杂合子以及tph2ct817纯合子突变体在受精后6天（A）、14天（B）和21天（C）的典型明场图像（Ai、Bi和Ci）以及手动追踪的躯干轴（Aii、Bii和Cii）。在6天和14天时未检测到躯干轴缺陷，但在21天时纯合子突变体的尾部冠状面出现躯干轴错位（Ci中的黑色箭头）。在(Ai)、(Bi)和(Ci)中，虚线白色线条表示用于矢状面和冠状面追踪的躯干轴。在(Aii)、(Bii)和(Cii)中，线条是从眼睛最背部（矢状面）或两眼之间的中线（冠状面）开始，沿着SC追踪到尾部尖端生成的。每条线代表一条鱼，虚线黑色/白色线条代表平均躯干轴追踪。冠状面追踪结果被镜像显示，以便所有躯干弯曲都显示在同一侧（图像中向上，对应于以鱼为中心的参考框架的右侧）。

接下来，我们通过3个月、8个月和18个月大的斑马鱼骨骼标本量化了其三维脊柱畸形（图2A和2B）。3个月大的tph2ct817/ct817鱼在矢状面和冠状面都出现脊柱错位（图2C和2E），随着鱼的生长到8个月和18个月，脊柱畸形进一步恶化，表现为椎骨的更大位移（图2H和2K）。尽管野生型（WTs）在年龄增长时也可能出现轻微的躯干轴畸形（图2Ki），但18个月大的tph2ct817/ct817鱼在矢状面和冠状面显示出更明显的脊柱畸形（图2Kii）。所有调查的成年阶段中，所有tph2ct817/ct817鱼都表现出脊柱畸形，表明这种表型是完全显性的。tph2ct817/ct817鱼中没有椎骨畸形或融合。3个月大时，tph2ct817/ct817鱼在尾部脊柱（第21-30节椎骨）的背腹方向上表现出更多的椎骨不对称性，而WT和tph2ct817+/ct817杂合子则没有（图2D）。8个月大时，tph2ct817/ct817鱼的椎骨对称性与WT和杂合子相当（图2G）；而在18个月大时，tph2ct817/ct817鱼在背腹方向和头尾方向上的椎骨不对称性增加，特别是在尾部和中部躯干（第11-21节椎骨）（图2J）。

图2：tph2ct817/ct817成年斑马鱼出现随着年龄增长而恶化的三维脊柱畸形，且不伴随椎骨畸形
(A和B) 描述了从骨骼标本中量化脊柱对齐情况的示意图（矢状面（A）和冠状面（B）。图像沿纵向中线对齐（品红色）。局部位移是从每个椎骨（Ai和Bi中的V3）计算得出的（ld1–ld4；见STAR方法）。
(C–E) 在3个月大的tph2ct817纯合子突变体中，脊柱错位非常明显。(C) 矢状面（Ci）和冠状面（Cii）的代表性骨骼标本。(D) 背腹（左）和头尾（右）方向的椎骨对称性。(E) 矢状面（左）和冠状面（右）的局部椎骨位移（Ei）和曲线严重程度（Eii)。
(F–H) 8个月大时纯合子突变体的脊柱弯曲进一步加重。(F) 矢状面（Fi）和冠状面（Fii）的代表性骨骼标本。(G) 背腹（左）和头尾（右）方向的椎骨对称性。(H) 矢状面（左）和冠状面（右）的局部椎骨位移（Hi）和曲线严重程度（Hii)。
(I–K) 18个月大时tph2纯合子突变体的脊柱弯曲进一步加重。(I) 矢状面（Ii）和冠状面（Iii）的代表性骨骼标本。(J) 背腹（左）和头尾（右）方向的椎骨对称性。(K) 矢状面（左）和冠状面（右）的局部椎骨位移（Ki）和曲线严重程度（Kii)。
(C)、(F) 和 (I) 中的白色箭头表示椎骨错位。(D)、(G) 和 (J) 中每个数据点代表一条鱼的一个椎骨。(Ei)、(Hi) 和 (Ki) 中的一条线代表一条鱼。在(Eii)、(Hii)和(Kii)曲线中，严重程度是通过积分(Ei)、(Hi)和(Ki)中的位移曲线来计算的；每个数据点代表一条鱼。另见表S1。总体而言，tph2ct817/ct817鱼的形态缺陷再现了人类脊柱侧弯症的三个重要特征：(1)矢状面和冠状面上的三维脊柱曲率；(2)随着年龄增长而恶化的脊柱错位；(3)没有椎骨畸形。tph2ct817/ct817的脊柱侧弯表型与RF缺陷无关。RF由Sspo蛋白聚集形成，对鱼类直立身体轴的发育和维持至关重要。在胚胎发育过程中，Sspo由底板和衬里大脑第三脑室的SCO产生。在啮齿类动物中，SCO接收5-羟色胺能神经投射，这可能调节Sspo的分泌。我们怀疑在tph2ct817鱼中，Sspo的分泌是否受到影响，从而导致Reissner纤维缺陷和脊柱侧弯表型。为了评估这一点，我们在6 dpf的Tg(sspo:sspo-GFP;tph2:GAL4;UAS:NTR-mCherry)ut24Tg,y228Tg,rw0144Tg幼鱼中对RF进行了活体成像（图3），显示tph2+投射到达SCO（图3A）和底板细胞（图3B）。尽管在斑马鱼幼体中tph2表达的轴突能够到达SCO和FP细胞，但在tph2ct817纯合突变体中RF是完整的。

接下来，我们在6和20 dpf的Tg(sspo:sspo-GFP)转基因幼鱼中活体成像，观察RF的变化。结果表明tph2+投射到达SCO（图3A）和底板细胞（图3B）。尽管tph2表达的轴突到达SCO和FP细胞，但在tph2ct817纯合突变体中RF是完整的。图3(A) 示意性地展示了6 dpf幼鱼中SCO的位置和Reissner纤维。(Aii) 显示tph2+连接投射到达SCO的头部（白色箭头），而tph2+纵向投射到达SCO的尾部（空心箭头）并向头部延伸。(Aiii 和 Aiv) 是来自(Aii)的单平面图像，显示tph2+纵向投射到达SCO的尾部（Aiii，空心箭头）和连接投射到达SCO的头部（Aiv，白色箭头）。比例尺，20 μm。(B) 显示tph2表达的轴突到达FP细胞（黑色）的单平面图像。(Bii) 在侧向观察的6 dpf Tg(sspo:sspo-GFP)幼鱼中。FP为底板；RF为Reissner纤维。(Biv) 示意性地展示了tph2+脊髓内5-羟色胺能神经元（ISNs）与FP细胞（绿色）的接触。比例尺，20 μm。(C) 示意图展示了6 dpf幼鱼中RF的三个主要躯干区域（洋红色），这些区域被成像。活体Tg(sspo:sspo-GFP)野生型（WT）、tph2ct817杂合或纯合突变体幼体的RF代表性图像显示所有躯干部分的连续纤维（3 WT，10 tph2ct817/+"，4 tph2ct817/ct817）。比例尺，50 μm。(D) 与(C)相同的展示方法，用于20 dpf的Tg(sspo:sspo-GFP)幼鱼，结果显示纤维或羽毛状壶腹（AC）没有差异（3 WT，3 tph2ct817/+"，3 tph2ct817/ct817）。比例尺，200 μm。(E) 示意图展示了20 dpf幼鱼中RF尾部的结构。Sspo-GFP+细胞排列在纤维的背面和腹面，绿色荧光蛋白（GFP）揭示出从中央管(CC)延伸到尾鳍的羽毛状结构。接下来，我们在6和20 dpf对Tg(sspo:sspo-GFP)转基因幼鱼与WT、tph2ct817/+和tph2ct817/ct817基因型进行了活体成像（图3C和3D）。在两个阶段，所有幼鱼的RF都表现为中央管中的连续纤维。在20 dpf时，RF延伸进入尾鳍，末端形成由强烈sspo-GFP信号标记的方形细胞组成的羽毛状结构（图3D和3E）。总之，我们在6和20 dpf的tph2ct817鱼中观察到RF在躯干中是完整的，表明脊柱侧弯表型不是由于RF的结构缺陷引起的。值得注意的是，在20 dpf时，tph2ct817/ct817幼鱼的RF在尾部区域是完整的，而这个区域正是这些鱼开始出现弯曲的地方。

我们进一步研究了tph2ct817突变如何影响脊髓和大脑中的5-羟色胺能神经元，通过在6、10、14和21 dpf进行5-羟色胺免疫染色来观察（图4）。在每个阶段，我们成像了整个躯干（图4A）并量化了tph2ct817/ct817、WT和tph2ct817/+同源幼鱼脊髓中的5-羟色胺能神经元数量。在6 dpf时，tph2ct817/ct817幼鱼的5-羟色胺阳性（5HT+）细胞较少（图4B和4F），并且沿头尾轴均匀减少（图4B和4Fii）。源自脊柱上核和脊髓内5-羟色胺能神经元（ISNs）的5-羟色胺能投射在tph2ct817幼鱼的脊髓中不存在（图4Biii）。这种5-羟色胺阳性脊髓神经元的丧失在10和14 dpf时更为明显（图4C和4D），并且在tph2ct817幼鱼的脊髓中所有5-羟色胺能投射都不存在（图4Ciii和4Diii）。虽然WT和tph2ct817/+幼鱼的5-羟色胺阳性ISNs数量在发育过程中增加（图4F–4I），但在tph2ct817/ct817幼鱼的脊髓中，只有少数5-羟色胺阳性细胞位于最尾部（图4Gii和4Hii）。在21 dpf时，tph2ct817幼鱼的5-羟色胺标记完全丧失（图4E和4I）。

接下来，我们使用免疫染色技术在6、10、14和21 dpf观察了tph2ct817突变如何影响脊髓和大脑中的5-羟色胺能神经元（图4）。在每个阶段，我们成像了整个躯干（图4A）并量化了tph2ct817/ct817、WT和tph2ct817/+同源幼鱼脊髓中的5-羟色胺能神经元数量。在6 dpf时，tph2ct817/ct817幼鱼的5-羟色胺阳性细胞较少（图4B和4F），并且沿头尾轴均匀减少（图4B和4Fii）。源自脊柱上核和脊髓内5-羟色胺能神经元（ISNs）的5-羟色胺能投射在tph2ct817幼鱼的脊髓中不存在（图4Biii）。这种5-羟色胺阳性脊髓神经元的丧失在10和14 dpf时更为明显（图4C和4D），并且在tph2ct817幼鱼的脊髓中所有5-羟色胺能投射都不存在（图4Ciii和4Diii）。虽然在发育过程中WT和tph2ct817/+幼鱼的5-羟色胺阳性ISNs数量增加（图4F–4I），但在tph2ct817/ct817幼鱼的脊髓中只有少量5-羟色胺阳性细胞位于最尾部（图4Gii和4Hii）。在21 dpf时，tph2ct817幼鱼的5-羟色胺标记完全丧失（图4E和4I）。

在WT和杂合突变体中，与14、10和6 dpf相比，21 dpf时5-羟色胺阳性ISNs的数量显著增加（图4F–4I）。在纯合突变体中，从6 dpf到10 dpf数量略有增加后，随后逐渐减少（图4F–4I）。接下来，我们比较了6 dpf时tph2ct817/ct817与WT和tph2ct817/+同源幼鱼的大脑5-羟色胺能神经元。下边缘（inferior raphe）受到突变的影响（图4J–4M），而所有其他主要的大脑5-羟色胺能细胞群（即松果体[图4Ki–4Mi]、垂体[图4Kii–4Mii]、下丘脑[图4Kiii–4Miii]、上边缘[图4Kiv–4Miv]和延髓[图4Kvi–4Mvi]在5-羟色胺染色上没有差异。在WT和tph2杂合幼鱼中，上边缘和下边缘侧方的5-羟色胺能投射在tph2纯合突变体中减少（图4Miv和4Mv）。这些结果表明，在21 dpf时，tph2ct817鱼的5-羟色胺在下边缘和脊髓中耗尽，导致在脊柱变形开始时脊髓完全失去了5-羟色胺信号。

tph2ct817突变在早期幼体阶段部分耗尽了脊髓神经元中的5-羟色胺（5HT），而在晚期幼体阶段变形发生时完全丧失。接下来，我们通过在6、10、14和21 dpf使用5-羟色胺免疫染色来研究tph2ct817突变如何影响脊髓和大脑中的5-羟色胺能神经元（图4）。在每个阶段，我们成像了整个躯干（图4A）并量化了tph2ct817/ct817、WT和tph2ct817/+同源幼鱼脊髓中的5-羟色胺能神经元数量。在6 dpf时，tph2ct817/ct817幼鱼的脊髓5-羟色胺阳性细胞较少（图4B和4F），并且沿头尾轴均匀减少（图4B和4Fii）。源自脊柱上核和脊髓内5-羟色胺能神经元（ISNs）的5-羟色胺能投射在tph2ct817幼鱼的脊髓中不存在（图4Biii）。这种5-羟色胺阳性脊髓神经元的丧失在10和14 dpf时更为明显（图4C和4D），并且在tph2ct817幼鱼的脊髓中所有5-羟色胺能投射都不存在（图4Ciii和4Diii）。虽然WT和tph2ct817/+幼鱼的5-羟色胺阳性ISNs数量在发育过程中增加（图4F–4I），但在tph2ct817幼鱼的脊髓中只有少量5-羟色胺阳性细胞位于最尾部（图4Gii和4Hii）。在21 dpf时，tph2ct817幼鱼的脊髓5-羟色胺标记完全丧失（图4E和4I）。

在WT和杂合突变体中，与14、10和6 dpf相比，21 dpf时5-羟色胺阳性ISNs的数量显著增加（图4F–4I）。在纯合突变体中，从6 dpf到10 dpf数量略有增加后，随后逐渐减少（图4F–4I）。接下来，我们比较了6 dpf时tph2ct817/ct817与WT和tph2ct817/+同源幼鱼的大脑5-羟色胺能神经元。下边缘受到突变的影响（图4J–4M），而所有其他主要的大脑5-羟色胺能细胞群（即松果体[图4Ki–4Mi]、垂体[图4Kii–4Mii]、下丘脑[图4Kiii–4Miii]、上边缘[图4Kiv–4Miv]和延髓[图4Kvi–4Mvi]在5-羟色胺染色上没有差异。在WT和tph2杂合幼鱼中，上边缘和下边缘侧方的5-羟色胺能投射在tph2纯合突变体中减少（图4Miv和4Mv）。这些结果表明，到21 dpf时，tph2ct817鱼的5-羟色胺在下边缘和脊髓中耗尽，导致在脊柱变形开始时脊髓完全缺乏5-羟色胺信号。

由于tph2ct817突变导致5-羟色胺合成受损，tph2ct817鱼的5-羟色胺在脊髓中丢失，但这并不意味着tph2+细胞的丢失。因此，我们对6、14和21 dpf的tph2 WT、tph2ct817/+和tph2ct817/ct817同源幼鱼的脊髓进行了tph2转录本的杂交链反应（HCR）（图5A–5F）。在所有阶段，tph2ct817幼鱼的脊髓中的tph2+细胞数量与其WT和杂合同源幼鱼相当（图5Di、5Ei和5Fi），并且它们的头尾分布没有差异（图5Dii、5Eii和5Fii）。这些结果表明，tph2纯合突变体中5-羟色胺的丧失是由于合成受损，而不是由于tph2+细胞的丢失。

图5清楚地展示了tph2ct817纯合突变体在整个幼体发育过程中5-羟色胺阳性脊髓中间神经元的数量和头尾分布保持正常。图5(A–C) 显示了6 dpf（A）、14 dpf（B）和21 dpf（C）时野生型（WT）、tph2ct817杂合和纯合突变体中tph2+脊髓神经元的数量和头尾分布。白色箭头表示tph2+细胞体。比例尺，20 μm。(D–F) 量化了tph2+脊髓神经元。（Di, Ei, 和 Fi) 表示tph2+脊髓神经元的总数。（Dii, Eii, 和 Fii) 表示沿头尾轴的tph2+脊髓神经元的分布。数据来源于相同的幼鱼（Di, Ei, 和 Fi）。(G–K) 显示了6 dpf WT、杂合和纯合突变体大脑中5-羟色胺阳性神经元的数量（F, 10 dpf (G), 14 dpf (H), 和 21 dpf (I)。（Fi, Gi, Hi, 和 Ii) 分别表示6、10、14和21 dpf时的5-羟色胺阳性神经元总数。（Fii, Gii, Hii, 和 Iii) 表示相应发育阶段沿头尾轴的5-羟色胺阳性神经元分布。数据来源于相同的幼鱼（Fi, Gi, 和 Ii）。在(Fi, Gi, 和 Ii)中，每个数据点代表一条鱼；误差条表示标准偏差。(J) 示意性地展示了6 dpf幼鱼大脑中的5-羟色胺阳性神经元群体。PG为松果体；PT为垂体神经元；Hyp为下丘脑；sRa为上边缘；iRa为下边缘；MO为延髓。

在WT和杂合突变体中，与14、10和6 dpf相比，21 dpf时5-羟色胺阳性ISNs的数量显著增加（图4F–4I）。在纯合突变体中，从6 dpf到10 dpf数量略有增加后，随后逐渐减少（图4F–4I）。接下来，我们比较了6 dpf时tph2ct817/ct817与WT和tph2ct817+/+同源幼鱼的大脑5-羟色胺能神经元。下边缘受到突变的影响（图4J–4M），而所有其他主要的大脑5-羟色胺能细胞群（即松果体[图4Ki–4Mi]、垂体[图4Kii–4Mii]、下丘脑[图4Kiii–4Miii]、上边缘[图4Kiv–4Miv]和延髓[图4Kvi–4Mvi]在5-羟色胺染色上没有差异。在WT和tph2杂合幼鱼中，上边缘和下边缘侧方的5-羟色胺能投射在tph2纯合突变体中减少（图4Miv和4Mv）。这些结果表明，到21 dpf时，tph2ct817鱼的5-羟色胺在下边缘和脊髓中耗尽，导致在脊柱变形开始时脊髓完全缺乏5-羟色胺信号。

tph2ct817突变导致的5-羟色胺丢失并不影响Mauthner细胞、CoLo中间神经元或CSF-神经元（CSF-cNs）的形态。tph2ct817突变损害了5-羟色胺的合成，导致tph2ct817鱼的脊髓和下边缘中的5-羟色胺阳性神经元丢失。然而，这并不意味着tph2+细胞的丢失。因此，我们在6、14和21 dpf对tph2 WT、tph2ct817/+和tph2ct817/ct817同源幼鱼的脊髓进行了tph2转录本的杂交链反应（HCR）（图5A–5F）。在所有阶段，tph2ct817幼鱼的脊髓中的tph2+细胞数量与其WT和杂合同源幼鱼相当（图5Di、5Ei和5Fi），并且它们的头尾分布也没有差异（图5Dii、5Eii和5Fii）。这些结果表明，tph2纯合突变体中5-羟色胺的丢失是由于合成受损，而不是由于t我们使用Tg(Tol56:GFP)品系来比较tph2ct817/+和tph2ct817/ct817同源个体中的Mauthner细胞形态（图5G–5I）。在6天和21天的发育阶段（dpf），tph2ct817/ct817鱼类的Mauthner细胞体显示出典型的形态，因为它们的连合轴突在菱形节（rhombomere 4）处穿过中线（图5H和5I）。tph2纯合子和杂合子21天龄幼鱼沿着Mauthner轴突的突触小丘也无法区分（图5J）。通过使用Tg(Tol56:GFP)品系，我们还研究了抑制性连合局部神经元（CoLos）和同侧上升的脑脊液-中枢神经系统（CSF-cNs），并发现它们的形态没有差异（图5J和5K）。为了研究tph2ct817鱼类中的肌肉纤维是否受到影响，我们使用免疫组织化学（IHC）检测了快速肌肉纤维中表达的肌球蛋白轻链LC1f/3f，并未发现轴向骨骼肌的缺陷（图5L和5M）。总体而言，tph2纯合子突变体中脊髓5HT的丧失并不影响典型的网状脊髓神经元（即Mauthner细胞）、连合抑制性神经元（CoLos）、同侧感觉脊髓神经元CSF-cNs和快速骨骼肌纤维的形态。控制身体轴线的脊髓5HT系统在cilia和RF通路突变体中似乎是完整的。

先前关于轴线矫正的研究将纤毛的运动功能与脑脊液流动联系起来，并且随后在脑脊液-中枢神经系统（CSF-cNs）中表达了尿促肽相关肽类（URPs），这些肽类作用于背部骨骼肌中的受体。在缺陷纤毛突变体中，尿促肽1和2（Urp1和Urp2）在脑脊液-中枢神经系统（CSF-cNs）中的表达减少，表现出蜷缩的表型。此外，urp1;urp2双突变体从3天龄开始就会出现脊柱侧弯。我们使用了spoicm13和elipsatp49d纯合子突变体，这些突变体在早期幼虫阶段表现出蜷缩的表型，以测试这些通路是否会影响5HT信号传导。为了评估有或没有RF的幼鱼脊髓中的tph2+5-羟色胺能神经元，我们对6天龄的spoicm13 WT、杂合子和纯合子同源个体进行了5HT（图6A）和tph2转录本（图6B）的IHC检测。不同基因型之间的脊髓5HT+和tph2+细胞数量相似（图6C和6D）。为了研究有或没有运动纤毛的幼鱼脊髓中的tph2+神经元，我们对6天龄的elispatp49d WT、杂合子和纯合子突变体进行了5HT和tph2转录本的IHC检测（图6E和6F）。不同基因型之间的脊髓5HT+神经元数量相当（图6G）。然而，纯合子elipsatp49d突变体中的tph2+脊髓细胞数量低于WT和杂合子同源个体（图6Hi）。

图6 控制身体轴线维持的脊髓5-羟色胺系统通过与纤毛-脑脊液流动-Reissner纤维和URPs通路平行的机制起作用

完整的标题显示：
图浏览器（A–D）spoicm13突变体中5HT+和tph2+脊髓神经元的数量及其头尾分布。（A）6天龄野生型（WT）、spoicm13杂合子突变体和spoicm13纯合子突变体中免疫染色为5HT（白色）的5HT+ ISNs的最大Z轴投影。洋红色箭头表示ISNs，洋红色箭头表示5HT+投影上的扩大的静脉曲张。（B）用HCR标记为tph2（绿色）的tph2+脊髓神经元的最大Z轴投影。白色箭头表示tph2+细胞体。刻度条，20 μm。（Ci和Di）5HT+和tph2+脊髓神经元的总数。（Cii和Dii）5HT+和tph2+脊髓神经元沿头尾轴的分布。数据来自图（Ci）和（Di）中显示的同一条鱼。
（E–H）elipsatp49d突变体中5HT+和tph2+脊髓神经元的数量及其头尾分布基本保持不变。（E）免疫染色为5HT（白色）的5HT+ ISNs的最大Z轴投影。洋红色箭头表示ISNs，洋红色箭头表示5HT+投影上的扩大的静脉曲张。（F）用HCR标记为tph2（绿色）的tph2+脊髓神经元的最大Z轴投影。白色箭头表示tph2+细胞体。刻度条，20 μm。（Gi和Hi）5HT+和tph2+脊髓神经元的总数。（Gii和Hii）5HT+和tph2+脊髓神经元沿头尾轴的分布。数据来自图（Gi）和（Hi）中显示的同一条鱼。
（I–M）脊髓5HT的丧失不会改变脑脊液-中枢神经系统（CSF-cNs）中urp1的表达。（I–L）6天龄WT、杂合子和tph2ct817纯合子突变体中pkd2l1a+（绿色）和urp1+（洋红色）脑脊液-中枢神经元的代表性HCR图像。白色箭头表示腹侧的pkd2l1a+/urp1+脑脊液-中枢神经系统（CSF-cNs）；空箭头表示缺乏urp1表达的背侧pkd2l1a+脑脊液-中枢神经系统（CSF-cNs）。刻度条，20 μm。（Mi）pkd2l1a+细胞（白色条）和pkd2l1a+/urp1+细胞（堆叠阴影条）的总数。（Mii）标准化的urp1荧光强度（与Mi中的同一条鱼）。
（N–R）脊髓5HT的丧失不会改变脑脊液-中枢神经系统（CSF-cNs）中urp2的表达。（N–Q）pkd2l1a+（绿色）和urp2+（洋红色）脑脊液-中枢神经元的代表性HCR图像。白色箭头表示腹侧的pkd2l1a+/urp2+脑脊液-中枢神经系统（CSF-cNs）；空箭头表示背侧的pkd2l1a+/urp2+脑脊液-中枢神经系统（CSF-cNs）。刻度条，20 μm。（Ri）pkd2l1a+细胞（白色条）和pkd2l1a+/urp2+细胞（堆叠阴影条）的总数。（Rii）标准化的urp2荧光强度。SC，脊髓；CC，中央管。

相反，我们研究了脊髓5HT的丧失是否会影响urp1和urp2的表达。在6天龄的tph2ct817幼鱼中，我们对pkd2l1a进行了HCR检测作为脑脊液-中枢神经系统（CSF-cNs）的标记物，同时检测了urp1（图6I–6M）和urp2（图6N–6R）。在tph2纯合子突变体中，表达urp1和urp2的脑脊液-中枢神经系统（CSF-cNs）的数量及其表达水平与对照组同源个体相当（图6Mi、6Mii、6Ri和6Rii）。总体而言，这些结果表明，维持身体轴线的脊髓5HT信号传导并未因纤毛和RF通路的破坏而改变。此外，脊髓5HT的耗尽并不影响URPs的表达。因此，依赖tph2的脊髓5-羟色胺能信号传导似乎是维持幼年斑马鱼生理上直线身体轴线所必需的一种新机制。

讨论
最近有研究表明，5-羟色胺与人类脊柱侧弯（AIS）有关，携带突变TPH1的脊柱侧弯患者对支具治疗没有反应。这表明5-羟色胺系统有助于维持人类的脊柱直线。在这里，我们研究了5-羟色胺在斑马鱼从早期幼虫阶段到成年期的身体对齐维持中的作用。tph2ct817/ct817斑马鱼表现出脊柱侧弯的表型。我们的表型分析显示，tph2ct817/ct817突变在3个月龄时导致100%的脊柱错位，发病时间大约在受精后3周。在21天龄时，斑马鱼正在进行变态，这一过程发生在10到30天龄之间。变态是一个快速形态和生理变化的时期，由甲状腺激素调节。尽管人类不经历变态，但青春期类似地代表了向成年的激素调节发育转变。AIS出现在青春期，同样，tph2ct817/ct817鱼类的弯曲也发生在快速且不可逆的生理变化期间。tph2ct817/ct817突变导致渐进性的三维脊柱错位，但没有椎骨畸形。这些特征与人类AIS相似，支持将tph2ct817/ct817斑马鱼作为研究AIS病因的模型。

RF在tph2突变体中未受影响
我们显示tph2+突触伸展到达SCO和底板，后者产生并分泌Spo来形成Reissner纤维。这表明在鱼类中可以发生5-羟色胺对Spo生产和/或分泌的调节。在大鼠中，5-羟色胺突触与SCO室管膜层建立突触联系。有人提出5-羟色胺可以调节Spo的生产和分泌，尽管结果因物种而异。5-羟色胺在大鼠中下调RF物质的合成，而在猫、蜥蜴和沙威鱼中增加了SCO中的分泌颗粒。我们研究了tph2ct817/ct817鱼类的表型是否与Reissner纤维缺陷相关，发现6天和20天龄的tph2ct817/ct817鱼类的纤维保持完整。在20天龄时，我们在尾鳍中识别出由spo-GFP转基因标记的立方形细胞，这些细胞类似于分泌Spo的底板细胞，可能代表晚期的Spo来源，并有助于在尾端固定纤维。尽管成年斑马鱼中存在表达foxj1a等标志物的底板衍生室管膜细胞，并被鉴定为室管膜放射状胶质细胞（ERG），但它们的形态与这些立方形的spo-GFP+细胞有显著差异。据认为，修改过的血管可能与尾壶腹中的RF物质接触，从而使其降解。我们观察到的羽毛状结构可能代表了RF从中央管出来并进入血管进行降解的位置。它在tph2ct817/ct817突变体、WT和杂合子同源个体中的类似外观表明，这个可能的Spo分泌和降解位置并未受到突变的影响。

在畸形开始时，脊髓中的5-羟色胺信号传导出现缺陷
为了识别tph2突变体中可能受影响的回路，我们比较了突变体和对照组同源个体大脑和脊髓中的5-羟色胺能神经元的分布。在tph2ct817/ct817斑马鱼幼体中，下缝区缺乏5-羟色胺，而其他5-羟色胺能神经元群体则保留了5-羟色胺。在鱼类中，不同的脑区表达不同的tph2亚型。松果体和下丘脑神经元表达tph1a，解释了这些核中5-羟色胺合成的保持；而垂体腺、上缝区、下缝区、延髓和部分松果体中的神经元表达tph2。所有5-羟色胺能脑群体还表达特定的（如slc6a4a和slc6a4b）和非特定的（vmat2）5-羟色胺膜转运蛋白。这可以解释为什么在tph2ct817/ct817幼体中，松果体、垂体腺、延髓和缝区中用tph2标记的神经元保留了5-羟色胺；由tph1a+神经元合成的5-羟色胺可以被tph1a+和tph2+神经元中的膜转运蛋白摄取。然而，这一机制不适用于下缝区，在tph2ct817/ct817幼体中下缝区完全缺乏5-羟色胺。值得注意的是，下缝区神经元向脊髓和向上至背缝区发送下行突触，后者也缺乏5-羟色胺。此外，在tph2ct817/ct817斑马鱼的脊髓中，我们显示了脊髓内5-羟色胺的完全丧失，但tph2+神经元并未丧失。这证实了在早期出生的ISNs和CSF-cNs中短暂表达tph1a之后，所有脊髓5-羟色胺能细胞都通过tph2合成5-羟色胺。ISNs起源于侧板，并从2天龄开始表达tph2，因此从6天龄起，tph2纯合子突变的脊髓中没有5-羟色胺可供摄取。在WT和杂合子突变体中，6天龄后5-羟色胺+和tph2+脊髓神经元的数量显著增加，这与先前的证据一致，即新的ISNs在胚胎神经发生之后形成。生命第三周5-羟色胺+ ISNs的显著增加，加上tph2纯合子突变体中脊髓5-羟色胺的完全丧失，表明5-羟色胺对脊髓回路的调节在晚期幼虫阶段尤为重要，其丧失可能导致脊柱畸形。

控制身体轴线的脊髓5-羟色胺系统似乎独立于纤毛-脑脊液流动-Reissner纤维和URPs通路
纤毛运动、RF和URPs有助于斑马鱼的脊柱直线化。中央管中的纤毛跳动促进脑脊液流动，这对于RF聚集是必要的。反过来，脑脊液-中枢神经系统（CSF-cNs）与纤维相互作用，增加了它们表达urp1和urp2的水平，这些肽作用于背部骨骼肌中的受体。脊髓5-羟色胺的合成并未因纤毛跳动或RF的丧失而受损。然而，elipsa纤毛缺陷突变体中的tph2+脊髓神经元数量较少，尽管5-羟色胺+神经元数量相当。这种明显的不一致可能是因为纤毛跳动对于神经管域中的Hedgehog信号传导是必要的，在那里它起高级作用，例如在侧板（LFP）中，从而延迟了LFP衍生的ISNs从tph1a+向tph2+的完全转换。相反，尽管脊髓5-羟色胺丧失，tph2突变体在脑脊液-中枢神经系统（CSF-cNs）中的urp1和urp2表达没有缺陷。总体而言，控制胚胎后斑马鱼身体轴线维持的5-羟色胺通路在很大程度上独立于纤毛/RF/CSF-cNs/URPs机制，表明脊髓5-羟色胺信号传导是维持胚胎后鱼类身体直线性的新机制。

5-羟色胺在脊柱形态发生期间的潜在功能
在斑马鱼中，ISNs突触延伸至运动神经元的细胞体和轴突，并在发育过程中向头部和尾部延伸，这与它们通过内源性释放5-羟色胺来调节运动的作用一致。在幼虫中，ISNs释放的5-羟色胺减少了游泳次数，而在成年鱼中，脊髓5-羟色胺减少了游泳频率。一致地，tph2ct817/ct817幼体在白天和夜间都表现出过度活跃。然而，这种表型是否源于脊髓中局部5-羟色胺传递功能的受损目前尚不清楚。脊髓中5-羟色胺的缺乏也可能影响控制姿势的运动输出。为了避免翻滚，斑马鱼幼鱼通过背部肌肉的不对称收缩来纠正身体姿势，这是由于背部和腹部运动神经元激活的不同步导致的扭矩效应。这种机制即使在没有功能性的前庭系统的情况下也能持续存在，这表明局部脊髓回路可以调节姿势的矫正。tph2ct817/ct817鱼种中5-羟色胺的缺失是否通过异常的轴向肌肉收缩破坏精细的姿势控制，还有待进一步研究。tph2突变鱼是否可以作为神经肌肉性脊柱侧弯的模型？由于tph2ct817突变鱼的所有脊髓和向脊髓投射的神经元都缺乏5-羟色胺，并且它们的运动行为与对照组不同，因此也可以被视为神经肌肉性脊柱侧弯的模型。神经肌肉性脊柱侧弯源于肌肉或其神经控制的缺陷，通常是由脑瘫、脊髓性肌萎缩（SMA）或杜兴氏肌营养不良等病理引起的（脊柱侧弯研究协会，www.srs.org）。然而，我们没有观察到tph2ct817纯合突变鱼的骨骼肌肉有任何缺陷。它们增加的运动能力进一步表明肌肉的直接神经控制并未受损。Oikonomou及其同事专注于背侧缝核（dorsal raphe）在睡眠中的作用，而我们发现，在脊柱侧弯发生之前，向脊髓投射的下侧缝核（inferior raphe）和中间缝核（ISNs）中的5-羟色胺已经减少。尽管如此，5-羟色胺对运动神经元兴奋性的调节最终可能会影响tph2突变鱼的肌肉张力。由于我们没有评估这些参数，因此将tph2ct817突变鱼视为特发性脊柱侧弯的模型。

**色氨酸羟化酶与鱼类和人类的脊柱畸形**
将5-羟色胺与人类特发性脊柱侧弯联系起来的证据仍然很少。TPH1启动子的一个多态性（rs10488682）已被发现在两个中国人群中与青少年脊柱侧弯（AIS）和支具治疗效果差有关，但在日本、高加索北美或保加利亚的人群中没有这种关联。相反，许多TPH2启动子变异体与精神疾病有关，包括重度抑郁。在这些情况下，人们认为SNP会导致用于5-羟色胺生物合成的酶减少。有趣的是，脊柱侧弯与抑郁症的发病率较高有关，尽管这通常被认为是该疾病心理社会和生理负担的结果，而不是一个共同的机制。传统上，TPH1被认为是外周组织的同工型，而TPH2被认为是脑部的同工型，后者在背侧缝核中的表达最高。然而，TPH1也在脑部表达，而TPH2在外周组织中的表达水平较低。在鱼类中，tph2是唯一在脊髓中表达的同工型，而tph1a和tph2在不同的脑核中表达。与这种表达模式一致，我们发现tph2突变影响了脊髓和向脊髓投射的脑区，但不影响大脑本身。

**关于研究的限制**
环境因素，包括饮食、水温、溶解的金属以及微塑料和纳米塑料可能会导致鱼类的骨骼畸形。tph2ct817/ct817突变鱼的脊柱侧弯表型非常稳定：最初在另一个鱼类实验室中被报道，在纯合突变体中具有完全的渗透性，并且在我们实验室中经过多代繁殖后仍然可以再现。一个限制是20 dpf的幼鱼体厚度较大，在我们的实验条件下，这种厚度使得无法对吻部脊髓中的Reissner纤维进行活体成像。然而，在年轻的幼鱼中，Reissner纤维在体内处于张力状态，并沿着背腹轴波动；当被切断时，两端会迅速向中央管的吻端和尾端收缩。我们认为这些弹性特性在晚期幼鱼阶段仍然存在，因此由于20 dpf的tph2纯合突变鱼的尾部纤维是完整的，其吻部脊髓中的纤维也很可能是结构完整的。

**结论**
根据早期模型，AIS可能是由于向大脑中枢的体感反馈（包括本体感觉、内脏感觉和前庭系统）受损所致，从而导致无法发出适当的运动指令来恢复身体姿势。我们对tph2纯合突变鱼的分析表明，在胚胎发育后期，脊髓中的5-羟色胺调节显著增加。我们的结果显示，脊髓中的5-羟色胺系统有助于维持斑马鱼的脊柱直线。

**资源获取**
如需进一步的信息和资源，请联系首席联系人Giulia Messa（[e-mail]）。

**材料获取**
本研究未产生新的独特试剂。

**数据和代码获取**
• 本文报告的原始形态学图像、骨骼制备图像和显微镜数据将在需要时由首席联系人提供。
• 本文未报告原始代码。
• 如需重新分析本文中报告的数据，可向首席联系人索取额外信息。

**致谢**
我们感谢Wyart实验室的所有成员提供的建设性反馈和支持，感谢ICM的PHENO-Zfish设施（RRID: SCR_028198）对鱼类的照料，以及ICM.QUANT成像设施（RRID: SCR_026393）在成像实验中提供的持续帮助和建议。我们还要感谢Caltech的David Prober教授分享tph2ct817斑马鱼品系，以及法国索邦大学的Pierre-Luc Bardet博士分享elipsatp49d突变品系。本工作得到了欧盟Horizon 2020研究和创新计划下的Marie Sk?odowska-Curie资助协议（授予G.M.）。C.W.还得到了Richard Mille基金和欧洲研究委员会（ERC）在欧盟Horizon 2020研究和创新计划下的资助（协议编号101002870）的支持。

**作者贡献**
概念构思：G.M. 和 C.W.；数据管理：G.M.；资金筹集：G.M. 和 C.W.；研究方法：G.M.；项目管理：G.M. 和 C.W.；资源准备：G.M. 和 C.W.；监督：C.W.；验证：G.M. 和 C.W.；写作——初稿、审阅和编辑：G.M. 和 C.W.

**利益声明**
C.W. 是《Current Biology》杂志顾问委员会的现任成员。

**关键资源表**
**试剂或资源**
| 来源 | 标识符 |
|-----------------|---------------------------------------------------------|
| 抗体 | Anti-5HT多克隆抗体 | Sigma Aldrich | Cat# S5545; RRID: AB_477522 |
| 抗肌球蛋白轻链1慢速和3快速抗体 | DSHB | Cat# F310; RRID: AB_531863 |
| 山羊抗兔IgG（H+L）高交叉吸附二次抗体，Alexa Fluor Plus 568 | Invitrogen | Cat# A32733; RRID: AB_2633282 |
| 山羊抗鼠IgG2b二次抗体，Alexa Fluor 633 | Invitrogen | Cat# A21146; RRID: AB_253578 |
| 化学品、肽和重组蛋白 | 乙基3-氨基苯甲酸甲磺酸盐（三卡因） | Sigma Aldrich | Cat# E10521 |
| PBS | Gibco | Cat#18912-014 |
| Tween 20 | Sigma Aldrich | Cat# P1379 |
| Triton XS | Sigma Aldrich | Cat# T8787 |
| 正常山羊血清（NGS） | Sigma Aldrich | Cat# G9023 |
| 牛血清白蛋白（BSA） | Sigma Aldrich | Cat# A2153 |
| DAPI | Invitrogen | Cat# D3571 |
| 阿利зарин红SS | Sigma Aldrich | Cat# A5533 |
| 乙二醇 | Sigma Aldrich | Cat# 102466 |
| KOH | Sigma Aldrich | Cat# S5881 |
| 甘油 | Sigma Aldrich | Cat# G5516 |
| 32%甲醛溶液 | Electron Microscopy Sciences | Cat# 15714 |
| Ibidi mounting medium | Ibidi | Cat# 50001 |
| DMSO | Sigma Aldrich | Cat# D8418 |
| 中性缓冲10%甲醛溶液 | Gibco | Cat#14200-067 |
| SSC缓冲液浓缩液20X | Sigma Aldrich | Cat#93017 |
| HCR探针清洗液 | Molecular Instruments | Not provided |
| HCR探针杂交缓冲液 | Molecular Instruments | Not provided |
| HCR扩增缓冲液 | Molecular Instruments | Not provided |
| HCR扩增器（v3.0）B1-h1-647 | Molecular Instruments | Not provided |
| HCR扩增器（v3.0）B1-h2-647 | Molecular Instruments | Not provided |
| Tph2 HCR探针（v3.0）用于B1扩增器 | Molecular Instruments | Not provided |

**实验模型和研究参与者细节**
**动物饲养和伦理协议**
动物处理和程序得到了巴黎脑研究所（ICM）和法国国家伦理委员会（Comité National de Réflexion éthique sur l’Expérimentation Animale Charles Darwin；APAFIS编号#38209-2022080517223947和APAFIS编号#51743-2024102515029150）的验证，符合欧盟立法。成年斑马鱼在14/10光照周期、28.5°C的环境中以每升最多五只鱼的数量饲养。斑马鱼幼鱼在含有0.00005%亚甲蓝的培养基中饲养直至孵化，然后转移到E3培养基（5 mM NaCl、0.17 mM KCl、0.33 mM CaCl2、0.33 mM MgSO4）中饲养至6 dpf。幼鱼保持与成年鱼相同的温度和光照条件。为了避免色素沉着，对携带mitfa?/?突变的AB品系的幼鱼进行了Reissner纤维的活体成像。

**使用的转基因和突变鱼**
本研究中使用的突变品系是(tph2)ct817。为了成像Reissner纤维，使用了Tg(sspo-sspo:GFP)ut24Tg品系。为了成像tph2+神经元及其投射，使用了Tg(tph2:GAL4)y228Tg和Tg(UAS:NTR-mCherry)rw0144Tg转基因品系。为了成像Mauthner细胞、CoLo中间神经元和脑脊液中枢（CSF-cNs），使用了Tg(Tol56:GFP)品系，其基因背景为(tph2)ct817。对于5-羟色胺免疫染色（IHC）和tph2 HCR操作，在(tspo)icm13和(ift54)tp49d（也称为elipsatp49d）突变品系中进行。

**方法细节**
**骨骼制备**
Tph2纯合、杂合突变体和野生型鱼在0.2%三卡因（乙基3-氨基苯甲酸甲磺酸盐）中于3、8和18 dpf时被安乐死，立即在固定液（5%甲醛、5% Triton X、1% KOH在PBS中）中固定两个晚上，温度为42°C并搅拌。随后取出内脏并去除鳞片。样品在增强液（20%乙二醇、5% Triton X、1% KOH在PBS中）中过夜孵育，然后转移到B染色液（20%乙二醇、1% KOH在PBS中）中15分钟，然后在旋转轮上在室温下孵育1小时，在B染色液（含有0.05%阿利зарин红S的B染色液）中孵育1小时。接着，样品在清洁液（20% Tween、1% KOH在PBS中）中旋转清洗最多两天，直至透明。样品经过甘油系列（25%、50%、75%、100%甘油在PBS中）处理，并在4°C下储存在甘油中直至成像。样品使用2X物镜在宏观显微镜（Nikon AZ100M，配备Nikon DS-Fi3相机和红色TRITC滤光片）下成像。为了覆盖每条鱼的纵向轴线，拍摄了三到四张图像，然后使用Fiji（imagej.net/software/fiji）软件将它们拼接在一起。图像分析在Fiji（https://imagej.net/software/fiji）中进行。

**活体成像**
**对于6、14和21 dpf的tph2纯合、杂合突变体和野生型鱼**，在0.02%三卡因中麻醉后，将它们背部固定在1.5%琼脂糖中。样品使用5X物镜在宏观显微镜（Nikon AZ100M，配备Nikon DS-Fi3相机）下成像，然后再次侧面固定以获取矢状面的图像。图像拍摄时不考虑基因型，在成像后对样品进行基因分型。鱼体的图像在Fiji（imagej.net/software/fiji）中对齐，并在脊髓上绘出痕迹以进行分析。

**对于到达SCO和底板细胞的tph2+神经元的活体成像**，将Tg(tph2:GAL4;UAS:NTR-mCherry)鱼与Tg(sspo)ut24Tg鱼杂交。得到的Tg(tph2:GAL4;UAS:NTR-mCherry;sspo)三倍体幼鱼在6 dpf时，在0.02%三卡因中固定，固定在1.5%琼脂糖中，并使用20X水浸物镜（NA = 1）在旋转盘共聚焦显微镜（3i Yokogawa CSU-W1，配备Hamamatsu Orca Flash 4.0 sCMOS相机）下成像。幼鱼首先以背部位置固定以成像tph2+向SCO的投射，然后以侧面位置固定以成像tph2+向底板细胞的投射。图像文件在SlideBook（https://www.intelligent-imaging.com/slidebook）中获取并分析。

**对于6和21 dpf的Reissner纤维的活体成像**，使用Tg(sspoout24Tg; tph2ct817/)成年鱼的杂交后代幼鱼，在0.02%三卡因中麻醉后，将它们侧面固定在1.5%琼脂糖中。Reissner纤维的活体图像使用20X水浸物镜（NA=1）在旋转盘共聚焦显微镜（3i Yokogawa CSU-W1，配备Hamamatsu Orca Flash 4.0 sCMOS相机）下获取。成像会话不考虑鱼的基因型，基因分型在之后进行。在6 dpf的幼虫中，整个脊髓都被成像；而在20 dpf的鱼中，由于身体前部的组织较厚，只对尾部的身体（从尾部到臀鳍的水平）进行了成像。为了成像Tg(Tol-056:GFP)幼虫中的Mauthner神经元，这些幼虫具有tph2ct817基因，它们被背部固定在1.5%的琼脂糖中，并使用20倍水浸物镜（NA = 1）在旋转盘共聚焦显微镜（3i，美国丹佛；Yokogawa CSU-W1，配备Hamamatsu Orca Flash 4.0 sCMOS相机，日本滨松市）下进行成像。

对于Mauthner神经元、CoLo中间神经元和CSF-CNs的成像，将Tg(Tol56:GFP)品系与tph2ct817/+基因型的成年鱼进行杂交，以获得Tg(Tol-056:GFP)；tph2ct817野生型、杂合子和纯合子突变体同胞。这些幼虫在21 dpf时用0.2%的tricaine（乙基3-氨基苯甲酸盐甲磺酸盐，Sigma Aldrich，美国密苏里州圣路易斯）进行安乐死，并在4°C下的4% PFA和3%蔗糖的PBS中固定过夜。然后幼虫被短暂地用PBS冲洗并去头，再进行组装。样品被固定在玻璃载玻片上，头部朝上，躯干朝下。使用25倍油浸物镜（NA = 0.8）在旋转盘共聚焦显微镜（3i Yokogawa CSU-W1，配备Hamamatsu Orca Flash 4.0 sCMOS相机）下获取大脑和躯干的图像。

为了染色5HT能神经元，在6、10、14和21 dpf的幼虫中，这些幼虫来自tph2ct817/+成年鱼的杂交，它们用0.2%的tricaine（乙基3-氨基苯甲酸盐甲磺酸盐，Sigma Aldrich，美国密苏里州圣路易斯）进行安乐死，并在4°C下的4% PFA和3%蔗糖的PBS中固定2.5小时。对于14和21 dpf的幼虫，固定时间增加到4小时。然后样品被短暂地用PBS冲洗，并用细镊子去除表皮。对于6 dpf的幼虫，还去除了卵黄；对于10、14和21 dpf的幼虫，去除了肠道。样品随后在4°C下的封闭缓冲液（0.7% Triton X、1% DMSO、10% NGS、0.2% BSA在PBS中）中封闭过夜。样品在4°C下的封闭缓冲液中与抗5HT多克隆抗体（S5545，Sigma Aldrich）以1:1000的比例孵育过夜，然后洗掉缓冲液，并在含有DAPI（1:1000，Invitrogen，商品编号D3571）的封闭缓冲液中与二次抗体（山羊抗兔Alexa Fluo Plus 568，Invitrogen，A32733）以1:500的比例孵育过夜。样品在清洗缓冲液中洗2到3小时后，侧置于Ibidi mounting medium（Ibidi）的玻璃载玻片上用于脊髓成像。对于大脑中5HT+神经元的成像，使用相同的免疫组化协议，但幼虫被背部固定在1.5%的琼脂糖中。脊髓图像使用25倍油浸物镜（NA = 0.8）获取，而大脑图像使用20倍水浸物镜（NA = 1）获取。在这两种情况下，都使用了旋转盘共聚焦显微镜（3i Yokawa CSU-W1，配备Hamamatsu Orca Flash 4.0 sCMOS相机）。

为了染色6 dpf Tg(Tol-056:GFP)；tph2ct817野生型、杂合子和纯合子突变体同胞中的肌肉纤维，遵循上述6 dpf幼虫5HT IHC的相同协议。作为一次抗体的抗肌球蛋白轻链1慢速和3快速抗体（F310，DHSB）在封闭缓冲液中以1:50的比例使用，并在4°C下孵育过夜，然后按照之前的步骤进行冲洗。随后样品在含有山羊抗小鼠IgG2b二次抗体（Alexa Fluor 633，A21146，Invitrogen）的封闭缓冲液中以1:500的比例在4°C下孵育过夜。样品随后在清洗缓冲液中冲洗，并侧置于Ibidi（Ibidi）的玻璃载玻片上。使用25倍油浸物镜（NA = 0.8）在旋转盘共聚焦显微镜（3i，美国丹佛；Yokogawa CSU-W1，配备Hamamatsu Orca Flash 4.0 sCMOS相机，日本）下获取图像。当样品在组装后没有立即成像时，它们被保存在4°C的黑暗环境中长达三周。

**原位杂交链反应（HCR）**
为了标记tph2ct817、spoicm13和elipsatp49d中的tph2转录本，来自相应杂合子父母的6 dpf幼虫被用0.2%的tricaine安乐死，并在4°C下的4% PFA中固定过夜。幼虫在室温下的DPBST中冲洗三次，每次5分钟，然后在冷（保持在-20°C）的100%甲醇中渗透10分钟。然后在室温下进行复水系列处理：在50%甲醇、50% DPBS中浸泡5分钟；在25%甲醇、75% DPBS中浸泡5分钟；在DPBS中浸泡5分钟。随后幼虫在37°C下的探针杂交缓冲液（HCR Probe Hybridization Buffer，Molecular Instruments）中预杂交30分钟。tph2探针（HCR Probe (v3.0)用于B1扩增器，Molecular Instruments）在杂交缓冲液中稀释至16 nM浓度，并在37°C下孵育过夜。杂交后，幼虫在37°C下的探针清洗缓冲液（HCR Probe Wash Buffer，Molecular Instruments，美国加利福尼亚州洛杉矶）中冲洗四次，每次15分钟，不进行搅拌。然后幼虫在室温下的5X SSCT（93017，Sigma Aldrich）中冲洗，并在室温下的扩增缓冲液（HCR Amplification Buffer，Molecular Instruments）中孵育30分钟。5 μL的hairpins（HCR Amplifier (v3.0) B1-h1-488，HCR Amplifier (v3.0) B1-h2-488，Molecular Instruments）在95°C下孵育1小时30分钟，然后在24°C下的热循环仪（SimpliAmp Thermal Cycler，A24811，美国马萨诸塞州沃尔瑟姆）中孵育30分钟。然后将hairpins和DAPI（1:1000，Invitrogen，加利福尼亚州卡尔斯巴德）加入250 μL的扩增缓冲液（HCR Amplification Buffer Molecular Instruments）中，幼虫在室温下的黑暗环境中孵育过夜。随后样品在室温下的5X SSCT（Sigma Aldrich）中冲洗三次，每次30分钟，进行搅拌。

为了成像pkd2l1a、urp1、urp2转录本，遵循与上述6 dpf幼虫相同的HCR协议，但使用不同的扩增器浓度：pkd2l1a探针（HCR Probe (v3.0)用于B1扩增器，Molecular Instruments），浓度为16nM；urp1探针（HCR Probe (v3.0)用于B1扩增器，Molecular Instruments），浓度为16nM；urp2探针（HCR Probe (v3.0)用于B1扩增器，Molecular Instruments），浓度为16nM。为了标记14和21 dpf的tph2ct817野生型、杂合子和纯合子突变体同胞中的tph2转录本，使用与6 dpf幼虫相同的HCR协议。tph2ct817是一个导致提前终止密码子的移码突变。然而，突变转录本仍然足够稳定，可以通过HCR在tph2ct817纯合子突变体的神经元中检测到。

对于脊髓成像，样品侧置于Ibidi mounting medium（Ibidi GmbH，德国格雷费尔芬）的玻璃载玻片上。使用25倍油浸物镜（NA = 0.8）在旋转盘共聚焦显微镜（3i，Yokogawa CSU-W1，配备Hamamatsu Orca Flash 4.0 sCMOS相机）下获取躯干的图像。当样品在组装后没有立即成像时，它们被保存在4°C的黑暗环境中长达一个月。

**脊柱对齐的 quantification 和统计分析**
通过测量一个椎骨到其正前方的椎骨的局部位移，相对于鱼体的纵轴，在矢状面和冠状面评估脊柱对齐情况。对于矢状面的测量，骨骼制备的图像被对齐到连接颌下骨和最后一节椎骨尾端的线条。对于冠状面的测量，骨骼制备的图像被对齐到从头骨中线骨连接处开始并沿着形成韦伯器的三块骨头的中线。在这两个平面中，从一个椎骨中心到纵轴的距离减去从前方椎骨到轴的距离。将韦伯器最尾端的椎骨作为起点，因此局部位移值是从第四个前方椎骨开始计算的。如果椎骨的中心位于中线轴的背面，则矢状面局部位移值为正；如果椎骨的中心位于中线轴的腹侧，则为负。冠状面局部位移值如果椎骨的中心位于中线轴的右侧则为正，如果位于左侧则为负。图2A和2B提供了局部位移测量的示意图。脊柱对齐的 quantification 在Fiji（https://imagej.net/software/fiji）中进行。图表和椎骨位移差异的统计分析在Python中完成。

在6、10、14和21 dpf的幼虫中，手动在Fiji中量化脊髓中5HT神经元的损失。从第1节（前方）到第30节（后方）的脊髓连续图像中计数5HT+细胞体；图表和统计分析在Python中完成。

为了分析CSF-cNs中的urp1和urp2转录本信号，使用用Python编写的两步流程分析图像。首先，在pkd2l1a通道上进行CSF-cNs的分割。对于每个z-stack图像，生成一个二维最大强度投影并用作分割的输入。使用Cellpose深度学习算法（Cellpose v3；cyto3模型）将细胞分割，细胞直径为10像素。通过将分割掩模与每个图像的最大强度投影叠加来评估分割掩模的质量。在下游分析之前，对手动分割的对象进行视觉检查以确认分割的准确性。从标记的掩模中确定每个图像中pkd2l1a+分割细胞的总数并记录下来。其次，使用之前生成的分割掩模来量化单个pkd2l1+细胞中的urp1或urp2荧光强度。在urp1分析中，计算每个分割细胞的urp1荧光强度的95百分位数来表示细胞内的信号。该值被标准化为同一细胞内外周环测量的平均荧光强度。通过将分割掩模侵蚀四像素并从原始掩模中减去侵蚀后的掩模来生成外周环，从而仅保留边界像素。通过比较自动分类和代表性图像的手动视觉检查来确定分类为urp1+的阈值。使用与每个图像的标准化强度分布的35百分位数相对应的阈值，因为这个阈值提供了最佳的一致性。标准化强度高于此阈值的细胞被分类为urp1+，而低于阈值的细胞被分类为urp1-。由于urp2荧光通常集中在细胞膜上而不是均匀分布在细胞质中，因此分类基于结合了整体荧光强度和膜富集的复合评分。对于每个分割的细胞，通过计算细胞掩模向外围区域侵蚀四像素来分离细胞的外围区域和中心区域。独立测量两个区域的平均urp2荧光强度。使用所有分割细胞的评分分布的60百分位数来确定分类阈值。在方法优化过程中，通过与手动注释的比较评估了不同的基于百分位数的阈值，选择与视觉评估最佳一致的60百分位数阈值。标准化强度高于此阈值的细胞被分类为urp1+，而低于阈值的细胞被分类为urp1-。在自动化分类之后，通过查看相应的荧光图像来手动验证每个细胞的urp1或urp2状态。

对于骨骼制备实验，实验者在成像之前就知道样本的基因型。对于幼虫身体形态和大脑及脊髓中的5HT染色，实验者对样本的基因型是不知情的。在这种情况下，样本在成像后进行基因分型。

**补充信息（2）**
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