一步法四重纳米板RT–dPCR同时检测圈养大熊猫犬细小病毒、犬冠状病毒、犬瘟热病毒与大熊猫轮状病毒的建立与应用

《Frontiers in Veterinary Science》：Development and application of a quadruplex nanoplate-based RT–dPCR assay for the simultaneous detection of canine parvovirus, canine coronavirus, canine distemper virus, and giant panda rotavirus in captive giant pandas

犬冠状病毒（CCoV）、犬瘟热病毒（CDV）、犬细小病毒（CPV）与大熊猫轮状病毒（GPRV）感染对大熊猫保护构成重要威胁，尤其对幼年个体。鉴于上述病毒的混合感染在大熊猫种群中较为常见，早期准确的鉴别诊断至关重要。为同时检测这四种病毒，研究人员建立了一步法四重逆转录数字PCR（RT–dPCR）方法，并与逆转录实时荧光定量PCR（RT–qPCR）进行比较。研究人员利用重组质粒和非靶标核酸评价该方法的特异性、灵敏度、线性与重复性。按模板体积校正后，其分析灵敏度（1.82 copies/μL）与RT–qPCR的单反应灵敏度（7.28 copies）相当。随后该方法应用于475份临床样本，包括214份大熊猫粪便样本、134份犬直肠拭子样本和127份猫直肠拭子样本。RT–dPCR在阳性病例检出方面优于RT–qPCR，尤其在犬与猫的CPV检测中。此外，所有RT–dPCR阳性而qPCR阴性的不一致样本经浓缩后以RT–qPCR复检均确认为阳性，验证了对低病毒载量的检出能力。RT–dPCR还识别出4例RT–qPCR漏检的混合感染，证实其在多重检测中的优势。结果表明，该RT–dPCR方法具有更高的分析灵敏度，可在单反应中同时检测与定量四种病毒靶标并检出更多低载量阳性样本，或可支持大熊猫及其他易感动物的早期病毒监测。

研究背景与问题 大熊猫保护工作使野生与圈养种群得以恢复，但传染病仍是其健康威胁。圈养繁育、救护与转运、近距离接触式管理以及栖息地周边家养动物的存在，均可能促进病原体引入。犬细小病毒（CPV，单链DNA病毒，属细小病毒科细小病毒属）、犬冠状病毒（CCoV，正链单链RNA病毒，属冠状病毒科冠状病毒属）、犬瘟热病毒（CDV，负链单链RNA病毒，属副黏病毒科麻疹病毒属）与大熊猫轮状病毒（GPRV，双链RNA病毒，A群轮状病毒，具11节段基因组）均对大熊猫及部分同域动物构成显著威胁。CPV典型表现为急性胃肠炎，幼犬感染尤为致命；2010年三家圈养机构近半数未免疫大熊猫CPV抗体阳性，近期研究从死亡野生大熊猫幼崽中鉴定出CPV-2c。CCoV主要经粪口途径传播，通常致病较轻，但与CPV、CDV等共感染时可加重病情，已有从自然感染大熊猫中分离鉴定CCoV的报道，临床表现为呕吐、血性腹泻、呼吸困难及多器官出血性病变，病死率高。CDV宿主范围广，可致呼吸、消化、神经及全身性疾病，2014—2015年陕西珍稀野生动物救护繁育中心致死性疫情使其被视为大熊猫最大的病毒性威胁。GPRV于2009年首次从急性腹泻幼年大熊猫粪便中报道，与急性腹泻和脱水相关。上述病毒宿主范围广、共感染频见，且感染后临床表现重叠（腹泻、呕吐、脱水、厌食、发热），因此精准的早期诊断与传播防控具有重要实践意义。现有检测方法中，病毒分离耗时，血清学方法难以区分活动性感染与既往暴露，常规PCR多为定性，qPCR虽快速灵敏但需标准曲线绝对定量且受标准品质量与复杂样本背景中抑制剂影响。数字PCR（dPCR）将反应分配为数千至数百万纳升级液滴或微孔，经终点PCR扩增与泊松统计分析直接确定靶标核酸拷贝数，无需标准曲线，对PCR抑制剂耐受性更强，对低丰度靶标精密度与灵敏度更高，已广泛用于核酸定量、肿瘤液体活检、病原诊断等领域。一步法逆转录形式可进一步使DNA与RNA靶标在同一流程中分析。为此，研究人员建立了一步法四重纳米板RT–dPCR方法，用于同时检测CPV、CCoV、CDV与GPRV，并应用于大熊猫分布区相关的大熊猫、犬、猫临床样本。

主要关键技术方法 研究采用基于纳米板的数字PCR平台（QIAcuity One 5plex系统与26 k纳米板），建立一步法四重RT–dPCR，并与QuantStudio 5平台上的四重RT–qPCR平行比较；以重组质粒作为阳性对照与分析标准品，以狂犬病毒、犬圆环病毒、犬轮状病毒、巴贝斯虫、伪狂犬病毒、犬腺病毒2型与犬副流感病毒核酸作为特异性评价的非靶标对照；通过梯度稀释评价线性、分析灵敏度与检出限，通过日内与日间重复评价重复性与再现性，并以Kappa值与McNemar精确检验比较两种方法的一致性；样本队列为2024—2026年采集的475份临床样本，包括来自中国西南某授权保护机构圈养大熊猫常规健康监测的214份粪便样本（每份对应一只个体）、四川省大熊猫主要分布区8个地区的134份犬直肠拭子与127份猫直肠拭子。

研究结果 3.1 RT–qPCR与RT–dPCR方法的优化：通过系统优化退火温度与引物/探针浓度，RT–qPCR在56 °C获得最佳扩增表现，四靶标引物/探针浓度分别为CCoV 0.50/0.45 μM、CDV 0.50/0.40 μM、CPV 0.60/0.40 μM、GPRV 0.60/0.45 μM；RT–dPCR在59.6 °C获得最清晰的阳性与阴性分区分离，浓度分别为CCoV 0.80/0.35 μM、CDV 0.40/0.40 μM、CPV 0.70/0.35 μM、GPRV 0.80/0.20 μM，一维与二维荧光图显示四靶标分区群清晰分离、背景低且无明显通道间干扰，结论为四病毒可在单反应中同时区分。3.2 分析灵敏度与线性：RT–qPCR在3.64×10⁷至3.64×10² copies/μL范围线性良好，相关系数均大于0.999，扩增效率90.63%—97.24%，检出限为3.64 copies/μL（2 μL模板时每反应7.28 copies）；RT–dPCR在3.64×10⁵至3.64×10¹ copies/μL范围线性良好，相关系数均大于0.99，检出限为1.82 copies/μL（4 μL模板时每反应7.28 copies），结论为按每反应引入靶标拷贝数归一化后两方法分析灵敏度相当，且RT–dPCR无需外标曲线即可绝对定量。3.3 特异性：以四种靶质粒为阳性对照、七种非靶标核酸为模板，两方法仅对CPV、CCoV、CDV、GPRV产生特异性信号，非靶标与无模板对照均无扩增或阳性分区，结论为两方法分析特异性高。3.4 重复性与再现性：RT–qPCR日内变异系数小于1.27%、日间小于4.39%；RT–dPCR在包括最低浓度在内的所有测试浓度下日内与日间变异系数均小于5.78%，结论为两方法在评价浓度范围内稳定性高、重现性良好。3.5 临床样本检测：大熊猫粪便中两方法均仅检出CPV（1/214，0.47%）与GPRV（1/214，0.47%）各一例；犬直肠拭子中RT–qPCR检出CCoV 2份（1.49%）、CPV 15份（11.19%），RT–dPCR检出CCoV 5份（3.73%）、CDV 4份（2.99%）、CPV 33份（24.63%）；猫直肠拭子中RT–qPCR检出CPV 11份（8.66%），RT–dPCR检出28份（22.05%）。共39份样本RT–dPCR阳性而RT–qPCR阴性，经浓缩后复检全部转为阳性，证实差异源于病毒载量低于qPCR检出限而处于dPCR检测范围内。大熊猫与猫样本中未检出共感染；犬拭子中RT–dPCR识别出4例混合感染（2例CPV+CCoV、1例CPV+CDV、1例CPV+CCoV+CDV），均为仅RT–dPCR阳性，RT–qPCR漏检次优病原体。一致性分析显示，大熊猫样本阳性极少致多数靶标Kappa不可计算；犬与猫中两方法呈中等一致，CPV在犬（Kappa 0.557）与猫（Kappa 0.502）的McNemar精确检验均显示显著系统性差异（p<0.001），差异由RT–dPCR阳性而RT–qPCR阴性的不一致样本驱动，且无RT–qPCR阳性样本被RT–dPCR漏检；犬CCoV与CDV的McNemar检验不显著（p=0.250与p=0.125）。结论为RT–dPCR在犬猫样本中对低载量靶标检出能力更强，并可发现qPCR漏检的混合感染。

讨论与结论 讨论指出，四病毒分属细小病毒科、冠状病毒科、副黏病毒科与呼肠孤病毒科，均为野生动物重要临床病毒，不仅威胁宠物医疗行业，还可能经跨物种传播危及野生动物保护；CDV宿主范围广、跨物种传播能力强，CPV可感染多种家养与野生食肉动物且快速进化可能促进种群间传播，CCoV跨物种传播潜力不可忽视，GPRV CH-1株与猪轮状病毒高度同源，提示跨物种传播后可能发生变异。已有检测方法各有局限，dPCR则可无需标准曲线绝对定量、耐抑制剂且对低丰度靶标更灵敏，数据变异更小。已有研究建立针对CDV的单重微滴dPCR（检出限3 copies/μL），但CPV、CCoV、GPRV的dPCR方法尚待建立，也缺乏同时绝对定量四病原的多重dPCR方法；现有多重PCR与RT–qPCR或靶标较少，或需对DNA与RNA病毒分别反应。本研究采用纳米板dPCR平台，其流程与qPCR高度相似，可直接沿用RT–qPCR条件，避免微滴平台液滴大小不均、融合及多次仪器转移等局限。研究局限性包括：无法获得大熊猫来源的CDV、CCoV、GPRV高滴度RNA材料或疫苗，临床阳性样本病毒载量普遍偏低，所报检出限主要反映cDNA扩增效率，不代表绝对RNA拷贝数且未计入逆转录效率，检出限定义为三个重复均阳性的最低浓度而非严格的95%检出概率阈值；大熊猫自然阳性样本数少，无法充分评价目标宿主中的诊断性能，且所有大熊猫样本来自单一机构，结果不能外推至其他圈养或野生种群；未采用正交方法或测序确认，额外RT–dPCR阳性只能视为方法阳性而非确诊感染，粪便CCoV或CDV阴性不能排除感染，未来监测应考虑连续采样与补充样本类型；同域动物监测中地理邻近本身不能证明直接接触、储存宿主地位或跨物种传播。研究认为，RT–qPCR仍适合宽浓度范围的常规高通量筛查，RT–dPCR尤适用于低水平或疑难样本的绝对定量，两者可在监测中互补。

结论译文：研究人员建立了一步法四重RT–dPCR方法，用于同时检测CPV、CCoV、CDV与GPRV。该方法特异性高、稳定性好，基于质粒的分析灵敏度与RT–qPCR相当。在犬与猫临床样本中，RT–dPCR检出的阳性病例多于RT–qPCR，尤其对CPV；并识别出4例RT–qPCR漏检的混合感染，证实该四重方法在筛查复杂共感染与低载量病原体方面的实用价值。然而，由于未进行正交确认，这些额外的RT–dPCR阳性被报告为方法阳性而非确诊感染；且大熊猫阳性样本极少，该方法在大熊猫中的诊断灵敏度与特异性仍未充分评价。尽管存在上述局限，该方法为大熊猫及同域动物中这些病毒的早期检测与监测提供了有前景的工具。