多队列与单细胞多组学揭示类风湿关节炎滑膜中多细胞机械转导–免疫重塑

《Frontiers in Immunology》：Multi-cohort and single-cell multi-omic analyses reveal multicellular mechanotransduction–immune remodeling in rheumatoid arthritis synovium

背景：类风湿关节炎（RA）滑膜炎整合了免疫细胞募集、基质重塑与持续性炎症，但其与组织机械转导的关系尚不明确。研究人员探讨了RA是否涉及多细胞机械转导–免疫程序的协同重塑。方法：研究人员构建了一个包含327个基因的机械转导汇编（compendium），并利用来自健康对照（n = 28）、骨关节炎患者（n = 22）和RA患者（n = 152）的GSE89408滑膜转录组进行发现。通过RA对健康对照和RA对骨关节炎（OA）对比优先筛选的候选基因，在三个患者独立队列中采用仅验证的随机效应荟萃分析（meta-analysis）进行评估。共表达网络、共识聚类（consensus clustering）、锁定外部映射、单细胞RNA测序（scRNA-seq）、细胞–细胞通讯推断（cell–cell communication inference）、虚拟敲除（virtual knockout）和单细胞染色质可及性分析（11例RA供体和1例OA参考；无健康对照）解析了网络、细胞和调控背景。部分基因表达发现通过定量PCR在独立健康（n = 20）和RA（n = 25）滑膜组织中验证，并在滑膜成纤维细胞中通过过表达和siRNA介导的敲低进行评估。结果：在未调整的 bulk 组织谱中，RA滑膜显示整合素–细胞外基质（ECM）感知和核LINC程序的表达评分较高，但黏着斑力传递和Hippo–YAP/TAZ相关基因评分较低。细胞组成调整减弱了部分关联。九个候选基因符合预设荟萃分析标准，并映射到四个与适应性免疫和先天免疫程序、细胞周期和机械转导相关表达评分相关的共表达模块。组织qPCR再现了预测的表达方向。在两个分子状态中，在外部队列中恢复了具有不同炎症和机械转导相关表达特征的两个分子状态。在探索性分析中，TLN2和NRXN1表达与炎症介质和DAS28呈负相关。探索性单细胞分析将这些程序定位到成纤维细胞、髓系、淋巴系和增殖状态，并推断成纤维细胞–髓系通讯潜力存在差异。扰动TLN2或NRXN1改变了选定的ECM相关转录本和COL1A1蛋白，并在一个供体内引起Matrigel侵袭的相应变化，而转录因子扰动支持候选FOXP2–NRXN1、NFIX–NRXN1/TLN2和FOS–TLN2表达关系。结论：患者来源的多组学和实验证据支持与RA滑膜异质性相关的多细胞机械转导–免疫网络的协同转录重塑。

研究背景：类风湿关节炎（RA）是一种以持续性滑膜炎和进行性关节破坏为特征的慢性免疫介导疾病，其发病机制传统上归因于免疫耐受丧失、自身抗体、浸润的淋巴和髓系细胞以及以肿瘤坏死因子（TNF）、白细胞介素（IL）-6和IL-1为主的细胞因子网络。患者来源的单细胞研究通过识别疾病相关成纤维细胞、单核细胞、B细胞和T细胞状态扩展了这一框架。HBEGF阳性巨噬细胞可增强滑膜成纤维细胞侵袭性，而解剖学上不同的成纤维细胞亚群优先支持炎症或结构损伤。因此，RA滑膜炎是一种涉及免疫、基质、内皮和细胞外基质（ECM）区室的多细胞组织疾病。发炎滑膜也是一个机械动态环境：增生、基质扩张、血管改变和ECM重塑改变组织结构、硬度和力分布，而关节运动施加拉伸、压缩和剪切力。原子力显微镜显示实验性关节炎中滑膜硬化、肌动蛋白应力纤维形成和硬度相关基质成分积累。机械拉伸改变原代RA成纤维样滑膜细胞中的基质金属蛋白酶和细胞因子反应，机械应变通过涉及PAK2、lncRNA H19和cadherin-11的N-cadherin–ADAM15程序促进其侵袭行为。因此，物理线索可主动塑造滑膜细胞行为。机械转导将这些物理线索与细胞反应联系起来。整合素和黏附复合物通过诸如talin的力敏感衔接蛋白将ECM与肌动球蛋白偶联，而RHO依赖性张力、核骨架与细胞骨架连接复合物以及YAP/TAZ将机械信息传递至细胞核。在RA中，TNF相关DKK1和黏着斑激酶（FAK）信号促进成纤维细胞迁移，FAK抑制减少人RA成纤维细胞迁移和侵袭。然而，成纤维细胞FAK缺失在相应小鼠模型中并未显著减轻关节炎严重程度，提示RA机械病理分布于多个组分。YAP/TAZ进一步连接组织力学与滑膜炎症。硬基质和炎性细胞因子增加RA成纤维细胞和滑膜类器官中的YAP/TAZ活性，而YAP/TAZ抑制减少增殖、侵袭、炎症输出、滑膜增生和关节炎严重程度。IL-6–JAK–YAP–SNAIL信号也促进滑膜成纤维细胞侵袭性，mTOR–Hippo串扰与RA成纤维细胞代谢和迁移相关。这些观察支持相互的机械–免疫偶联而非单一线性通路。目前仍缺乏对这种偶联的系统性认识。RA滑膜在免疫和基质组成、分子病理型和治疗反应方面差异显著，单细胞染色质分析已识别细胞状态特异性可及区域和候选调控因子。尚不清楚哪些机械转导基因在RA中可重复改变、这些变化是否区分RA与骨关节炎（OA）、它们在共表达网络中如何定位、哪些细胞类型贡献这些变化、它们与调控可及性、免疫–基质通讯、疾病内异质性和临床结局变异的关系。因此，研究人员构建了预定义的机械转导汇编，并为RA对健康、RA对OA和OA对健康比较分配互补作用。信号在非重叠外部队列中使用随机效应荟萃分析、效应量、异质性和敏感性分析进行评估，然后通过WGCNA、分子状态和探索性临床结局分析、scRNA-seq、细胞通讯推断、虚拟扰动和scATAC-seq进行情境化。选定的表达预测通过临床滑膜组织qPCR和滑膜成纤维细胞靶向扰动后qPCR进行检查。研究人员开展了什么研究：本研究整合了患者来源的bulk和单细胞转录组学、共表达网络、细胞–细胞通讯推断、虚拟敲除、单细胞染色质可及性、探索性临床结局关联和靶向实验。GSE89408用于发现和RA限制性WGCNA；非重叠的GSE55235、GSE55457和GSE77298队列形成仅验证荟萃分析。GSE48780和GSE225731用于锁定分子状态映射，GSE200815和GSE246416用于scRNA-seq，GSE243917用于RA调控背景（11例RA供体，1例描述性OA参考；无健康对照）。GSE12021因31名受试者与GSE55457重叠而被排除。分析前审核样本身份、临床注释和研究来源。E-MTAB-8322独立评估四个预定义髓系靶标。研究人员构建了包含133个文献策展基因的机械转导基因汇编，分配到八个机械转导程序；GO扩展查询人类QuickGO对机械刺激的反应、细胞对机械刺激的反应和机械敏感性单原子离子通道活性，最终得到327个基因的并集。GSE89408包含28例健康、22例OA和152例RA滑膜谱；关节痛和未分化关节炎样本被排除。基因标识符映射到HGNC符号，重复行求和。基因使用edgeR::filterByExpr过滤，TMM归一化并用limma–voom变换。差异表达使用limma，采用无截距设计、稳健趋势经验贝叶斯估计和RA对健康、RA对OA和OA对健康对比；Benjamini–Hochberg（BH）校正在每个对比内应用。基于表达的机械转导程序评分使用样本内表达秩产生?1到1的评分，然后进行队列标准化评分。分别评分和z标准化的核心（133基因）和不重叠GO扩展仅（194基因）层等权平均并重新标准化用于主要整合评分。八个核心程序也单独评分。Kruskal–Wallis和随后的Wilcoxon秩和检验使用BH校正。Hedges’ g、Cliff’s delta和bootstrap 95%置信区间量化效应。评分是相对表达代理，对免疫激活和细胞组成敏感；它们既不建立RA中基因机械特异性，也不直接测量机械力或通路激活。细胞组成敏感性分析使用十个已发表的MCP-counter评分。双对比候选优先排序限制在汇编内。Tier A要求在RA对健康和RA对OA中方向一致且FDR <0.05，两个对比中|log2 fold change| ≥1。Tier B使用相同方向和FDR标准，但要求RA对健康|log2 fold change| ≥1，RA对OA ≥0.5。所有63个Tier A/B基因进入验证而无重新选择。独立bulk验证：GSE55235、GSE55457和GSE77298分别处理。数据在需要时log2变换、分位数归一化并映射到当前基因符号；对于多探针，保留样本间方差最大的探针。Limma使用稳健趋势经验贝叶斯估计产生队列特异性log2 fold change、标准误、P值、全转录组和固定候选FDR以及Hedges’ g及95%置信区间。仅验证随机效应荟萃分析按限制最大似然合并队列特异性Hedges’ g值，报告合并效应、95%置信区间、Cochran’s Q、τ2、I2和描述性预测区间。荟萃分析P值在可评估候选间BH校正。复制基因必须在所有队列中可测量；匹配发现方向而无显著相反效应；满足FDR <0.05、|合并g| ≥0.75和I2 <75%；并在每个留一队列分析中保留方向。RA限制性加权基因共表达网络分析使用152个GSE89408 RA样本中12,000个最变异合格基因，保留检测到的候选。参数为双权重中相关、软阈值功率12、动态树切割和合并切割高度0.25。每个固定模块的第一主成分定向到其RA特征基因；冻结的RA中心、尺度和载荷投影到所有202个谱。诊断双权重相关对比RA与健康或OA，每个对比19个模块BH校正。在152个RA谱中，双权重关联使用单独的171检验BH家族：19个模块×九个标记表达丰度代理或九个机械转导评分。RA分子状态的识别和锁定外部映射：152个GSE89408 RA样本使用九个复制基因的队列内逆正态秩变换表达进行聚类。ConsensusClusterPlus评估k=2–8，1,000次迭代、80%样本子采样、所有特征、围绕中心点分区和Pearson距离。选择考虑共识矩阵、CDF和delta面积、模糊聚类、轮廓宽度、簇大小和500次bootstrap重采样；保留k=2。基因顺序、变换、发现中心和状态方向在最近质心映射到GSE48780和GSE225731之前锁定。探索性临床结局分析：GSE225731每个患者有一个基线RNA谱，配对基线和三个月DAS28-CRP。改善为基线减三个月DAS28-CRP。双侧渐近Wilcoxon秩和检验使用BH校正。scRNA-seq数据集、质量控制和注释：scRNA-seq包括GSE200815的四例RA供体和GSE246416的五例健康供体；银屑病关节炎样本被排除。诊断–Series完全混杂和性别不平衡（RA，三女/一男；健康，五男）排除了独立于来源或性别的归因；分析为探索性。EmptyDrops调用液滴。细胞保留条件为200–7,500基因、500–60,000 UMIs和≤25%线粒体读取；scDblFinder按供体应用。所有64,744个通过的单细胞保留。Harmony仅用于可视化和注释。供体是独立单位。计数按供体和细胞状态聚合；伪bulk样本要求≥30细胞，比较每组≥3供体。合格对比使用edgeR TMM归一化和稳健准似然检验。外部供体水平巨噬细胞表达分析：四个髓系靶标（CXCL10、CASP1、TLR8和SPP1）在独立E-MTAB-8322滑膜巨噬细胞数据中评估。主要作者Discovery/Oxford FACS分选的CD11b+/CD64+、谱系阴性巨噬细胞富集队列包括四例健康和八例活动性RA供体。细胞–细胞通讯分析：CellChat在健康和RA中分别在 broad 和 fine 分辨率下运行，使用归一化表达和Secreted Signaling、ECM–Receptor和Cell–Cell Contact数据库。单细胞虚拟敲除：虚拟敲除在最强支持的RA来源群体中使用scTenifoldKnk。单细胞染色质可及性和调控分析：处理的GSE243917多组矩阵和注释包括31,547个细胞和132,520个峰（11例RA和1例OA供体；无健康对照）；推断在合格RA区室内进行，OA作为描述性参考。多域靶标优先排序和药物关联筛选：九个复制候选按验证荟萃分析、WGCNA、分子状态分离、scRNA-seq、scATAC-seq、CellChat、虚拟敲除和实验可处理性排序。人类滑膜组织队列：初始qPCR使用上海交通大学医学院附属新华医院骨科通过关节置换、关节镜或超声引导活检收集的RA滑膜，对照滑膜通过关节镜为半月板损伤、韧带损伤或创伤后评估收集。RA根据2010年美国风湿病学会/欧洲抗风湿病联盟分类标准诊断。对照参与者无炎症性关节炎、自身免疫疾病或临床明显滑膜炎病史。所有参与者在样本收集前提供书面知情同意。研究经新华医院伦理委员会批准（批准号XHEC-NSFC-2024-191），按照赫尔辛基宣言进行。初始qPCR队列包括20例健康对照和25例RA患者的滑膜组织，用于测量所有九个候选基因表达。随后的非重叠系列包括40例健康对照和50例RA患者，用于评估TLN2和NRXN1表达。细胞系和滑膜成纤维细胞：细胞系qPCR调查使用Jurkat、Raji、U266、NK-92、THP-1、MH7A、HUVEC和HMC-1各三个独立未刺激培养。健康和RA来源的成纤维样滑膜细胞（FLSs）从新鲜收集的滑膜组织分离。滑膜成纤维细胞的炎症刺激：原代RA来源FLSs（ passages 3–8）来自三个不同供体，用于三个独立细胞因子刺激实验。质粒和siRNA扰动：成纤维细胞在60–70%汇合时接受编码TLN2、NRXN1、FOXP2、NFIX或FOS的pLVX构建体或空载体对照。敲低使用每个靶标的两个非重叠siRNA和非靶向对照。RNA提取、逆转录和定量PCR：RNA用TRIzol分离并通过分光光度法定量。基因组DNA去除后，RNA用PrimeScript RT试剂盒逆转录。qPCR使用TB Green Premix Ex Taq II在QuantStudio 5实时PCR系统上。GAPDH为参考基因。相对表达使用2?ΔΔCt，而相关分析使用?ΔCt。内源性NRXN1的Western blot评估：在一个与细胞因子刺激qPCR分开的实验中，未转染的原代RA FLSs（ passages 3–8）来自两个独立患者，处理24小时。细胞因子测量和临床相关性：TNF-α、IL-6和IL-17A在来自40例RA患者的匹配滑膜组织匀浆中使用人Quantikine ELISA试剂盒测量。统计分析：所有检验为双侧。患者、供体、独立培养或实验为统计单位；技术qPCR孔平均。两组实验使用非配对t检验或Mann–Whitney检验。细胞因子刺激使用单因素ANOVA with Dunnett’s检验或Kruskal–Wallis with Dunn’s检验。过表达和siRNA实验分别针对空载体和非靶向对照分析，在每个干预家族内多重校正。除非另有说明，BH FDR <0.05定义显著性。分析使用R 4.5.1和Python 3.12.10，固定种子。研究结果：机械转导相关转录程序在RA滑膜中选择性重塑。为从机械转导角度表征RA滑膜病理，研究人员首先构建了假设驱动的机械转导基因汇编。汇编包括133个文献策展核心基因和194个由基因本体（GO）注释支持的非冗余扩展基因，涉及对机械刺激的反应和机械门控离子通道活性，总计327个基因。核心基因组织为八个功能程序：整合素–细胞外基质（ECM）感知、肌动球蛋白–RHO张力、黏着斑力传递、Hippo–YAP/TAZ信号、核LINC力学、机械敏感转录输出、机械敏感通道和细胞–细胞连接力学。该策略将后续分析限制在生物学定义的机械转导框架内。GSE89408用作发现队列，包括28例健康、22例OA和152例RA滑膜样本。TMM–voom归一化表达谱的主成分分析显示诊断组间分离以及组内显著异质性。整合表达机械转导评分在三组间不同（Kruskal–Wallis FDR = 0.037），但组成程序并未以一致方向变化。与健康滑膜相比，RA滑膜显示较高的整合素–ECM感知和核LINC力学评分，但较低的黏着斑力传递和Hippo–YAP/TAZ评分。细胞–细胞连接力学和肌动球蛋白–RHO张力的表达评分也在诊断组间不同，尽管其效应方向和幅度因比较组而异。这些未调整表达评分差异不建立机械力或YAP/TAZ激活的变化。聚合差异取决于基因集定义。仅核心评分差异在RA对健康（Hedges’ g = 0.060，q = 0.656）或OA（g = 0.416，q = 0.105）中不显著。并集效应分别为g = 0.335（q = 0.159）和0.609（q = 0.031）；仅扩展效应更大（g = 0.604和0.747）。因此，仅核心聚合未再现所有整合评分差异。组成调整将整合RA对OA差异从β = 0.620 z评分单位（q = 0.040）减弱到0.058（M1，q = 0.788）和?0.031（M2，q = 0.930）。两个调整模型均未保留RA对OA中十一个评分中任何一个的q < 0.05，也未保留RA对健康中整合、仅核心、仅扩展、整合素–ECM、核LINC或Hippo–YAP/TAZ评分的q < 0.05。黏着斑评分在RA对健康中保持较低（M1，β = ?0.913，q = 0.010；M2，β = ?0.996，q = 0.017）；其他保留关联取决于标记定义。在183个完整病例中，整合RA对OA差异在调整前较小（C0，β = 0.205，q = 0.527），并在年龄、性别和重叠排除协变量调整后逆转（C3，β = ?0.606，95% CI，?1.081至?0.131，q = 0.035）。几乎分离的拟合概率和一些非收敛重叠诊断表明协变量重叠差，限制了模型依赖估计的解释。三个诊断对比服务于不同分析目的。RA对健康识别疾病相关变化，而RA对OA评估这些变化是否超出一般关节病理并提供RA特异性证据。OA对健康提供非RA关节疾病背景。联合考虑RA对健康和RA对OA比较中的效应方向、FDR和效应幅度，识别出30个Tier A和33个Tier B候选。因此，程序水平机械转导重塑被缩减为一组由两个互补对比支持的候选，为独立队列验证和效应量整合提供基础。独立队列确认RA滑膜中可重复的机械转导相关变化。GSE89408中识别的所有63个Tier A/B候选进入外部验证，在发现队列中无进一步特征缩减。样本重叠审核后，保留三个患者独立滑膜队列GSE55235、GSE55457和GSE77298并分别处理以保留队列和平台特异性方差。GSE12021因已知与GSE55457患者重叠而未作为额外验证队列纳入。三个外部队列显示机械转导程序的反复变化，尽管幅度跨队列变化。这些发现支持机械转导重塑的跨队列一致性，同时允许组织组成、队列特征和测量平台的贡献。63个候选中的57个在所有三个验证队列中可测量，20个在每个队列中保留发现方向。研究人员然后进行仅验证随机效应荟萃分析。GSE89408显示用于比较但排除在主要合并效应估计之外。九个基因满足所有预设标准：荟萃分析FDR < 0.05、绝对合并Hedges’ g ≥ 0.75、I2 < 75%、所有三个验证队列方向一致以及每个留一队列分析中方向保留。CXCL10显示最大正合并效应（Hedges’ g = 2.26，FDR = 5.09 × 10?6，I2 = 36.7%），其次是ITGA4（g = 1.96，FDR = 1.21 × 10?5，I2 = 32.0%）。CCNB1、ITGB7、TLR8、SPP1和CASP1也显示正合并效应，Hedges’ g值范围为1.28至1.49。相反，TLN2（g = ?0.94，FDR = 0.0054，I2 = 0%）和NRXN1（g = ?0.76，FDR = 0.028，I2 = 0%）在RA中一致较低。队列间异质性范围从I2 = 0%（TLR8、TLN2和NRXN1）到60.7%（ITGB7；CASP1，59.8%；SPP1，52.2%）。所有九个方向在留一队列分析中持续，但其描述性95%预测区间包括零。异质性估计在三个队列中仍不精确；I2 = 0%不建立无异质性。九个基因代表所提出机械转导–免疫网络内的互补位置。CXCL10标记炎症趋化输出；ITGA4和ITGB7代表免疫细胞黏附和迁移；SPP1代表髓系相关基质重塑；TLR8和CASP1代表先天免疫感知和炎症小体相关反应；CCNB1代表滑膜细胞增殖和细胞周期活动；TLN2代表整合素–黏着斑–细胞骨架偶联。NRXN1作为较少表征的候选保留，可能与细胞黏附或细胞间相互作用相关。初始独立qPCR队列包括20例健康对照和25例RA患者，与随后的40例健康对照和50例RA患者系列无重叠。CXCL10、CCNB1、ITGB7、ITGA4、TLR8、SPP1和CASP1在RA中较高，而TLN2和NRXN1较低。这些组织水平发现与多队列转录组分析识别的方向一致，支持九基因表达模式。RA特异性共表达网络连接免疫和结构–机械转录程序。研究人员分析GSE89408的152个RA样本中12,000个最变异合格基因。分析识别19个正式模块。模块特征基因显示与诊断对比、机械转导评分和相对细胞丰度代理评分的不同关联，显示RA滑膜样本间 divergent 转录模式。候选模块为RA-M03（CXCL10、TLR8、CASP1）、RA-M14（CCNB1、SPP1）、RA-M01（ITGA4、ITGB7）和RA-M04（TLN2、NRXN1）。RA-M01、RA-M03和RA-M14分别显示适应性免疫、先天免疫和细胞周期富集。RA-M04显示与黏着斑（ρ=0.32）、Hippo–YAP/TAZ（ρ=0.46）和核LINC（ρ=?0.54）表达评分的Spearman相关；RA-M01和RA-M03与T细胞和巨噬细胞表达代理相关（ρ=0.93和0.94；所有BH q<0.001）。GSE55235、GSE55457和GSE77298中的模块保留分析为四个候选包含模块提供不同程度外部支持：GSE55235中保留弱至中等（Zsummary=2.24–7.60），GSE55457和GSE77298中强（11.46–33.83）。TLN2和NRXN1 mRNA表达在八个未刺激细胞系中变化，在滑膜成纤维细胞相关细胞中相对突出。在单独的随后90个滑膜组织系列中，TLN2和NRXN1表达在完整样本集中强相关（Spearman ρ = 0.89，P < 0.001）。这种关系在健康组织（n = 40；ρ = 0.79，P < 0.001）和RA组织（n = 50；ρ = 0.73，P < 0.001）中均保留。两个转录本在RA中低于健康原代FLSs（每组六供体），并在24小时TNF-α、IL-1β或IL-17A暴露后降低（三例RA供体）。这些发现涉及mRNA反应。九个基因在不同共表达模块中的分布，连同TLN2和NRXN1的协调变化，提出个体患者在炎症和结构–机械程序相对优势上存在差异的可能性。因此，研究人员检查九个基因是否捕获RA内分子异质性。在未转染RA FLSs中，使用制造商指定的NRXN1α抗体进行Western blot显示约150–250 kDa的免疫反应性，与α类NRXN1信号兼容，并在90–100和40–50 kDa处有更强条带。条带身份，包括任何β/γ分配，仍未解决。这种描述性测定支持内源性NRXN1相关免疫反应性，而未建立细胞因子诱导或RA对健康的蛋白质差异。RA滑膜显示不同的机械转导–免疫分子状态。共识聚类限制在GSE89408的152个RA样本。候选解决方案k = 2至k = 8使用最小簇大小、共识累积分布函数、CDF面积变化、模糊聚类比例、轮廓宽度、共识分离和bootstrap ARI及Jaccard稳定性评估。k = 2解决方案提供簇稳定性和足够簇大小之间最一致的平衡，产生PT1（n = 72）和PT2（n = 80）。PCA和UMAP进一步可视化两组在九基因表达空间中的相对分离。PT1显示相对较高的TLN2和NRXN1表达，而PT2显示较高的CXCL10、ITGA4、ITGB7、TLR8、CASP1、CCNB1和SPP1表达。独立生物学表征将PT2与炎症、淋巴、髓系、增殖、黏附和ECM重塑特征相关联。PT1显示更强的结构–机械和选定黏着斑及Hippo相关表达特征。这些发现支持RA滑膜中沿机械转导–免疫轴定位的两个探索性分子状态。锁定映射在GSE48780和GSE225731中恢复两个分子状态，分别有7/83和1/74低置信度谱。在组织学注释的GSE48780样本中，炎症发生在22/27 PT2对5/16 PT1样本（Fisher’s exact P = 0.00255）；低置信度排除后关联持续（P = 6.57×10?5）。在GSE225731中，PT2有较高基线DAS28-CRP（BH q=0.00240）和较大未调整三个月改善（q=0.0459），但未检测到三个月DAS28-CRP差异（q=0.705）。低置信度排除后结果一致。基线不平衡和异质治疗限制这些探索性关联作为治疗特异性疗效或反应预测的解释。在单独的随后组织系列的50个RA标本中的40个中，TLN2和NRXN1表达与炎症和疾病活动呈负相关。NRXN1表达与TNF-α（ρ = ?0.70）、IL-6（ρ = ?0.78）、IL-17A（ρ = ?0.61）和DAS28（ρ = ?0.83）负相关。TLN2表达类似地与TNF-α（ρ = ?0.78）、IL-6（ρ = ?0.74）、IL-17A（ρ = ?0.58）和DAS28（ρ = ?0.82）相关。所有八个相关性在联合BH校正后q<0.001；分析未调整临床协变量。研究人员然后使用单细胞转录组分析确定哪些细胞区室贡献相应bulk组织信号。单细胞分析揭示机械转导–免疫重塑的多细胞组织。单细胞RNA测序数据集包括来自九个供体的64,744个细胞，包括五例健康供体和四例RA患者。细胞分配到T细胞、自然杀伤（NK）细胞、髓系、混合B/浆细胞、壁、内皮、成纤维细胞和周期成纤维细胞区室。九个候选基因在这些群体中显示不同的主要分布，表明整体程序接受多细胞区室贡献。研究人员结合供体水平细胞组成分析与细胞类型特异性伪bulk比较，分别描述丰度和细胞类型内表达。CXCL10主要定位到炎症成纤维细胞和髓系状态；ITGA4和ITGB7在淋巴和选定髓系群体中突出；TLR8和CASP1集中在单核/巨噬细胞区室；SPP1标记重塑巨噬细胞状态；CCNB1标记周期细胞；TLN2在成纤维细胞和结构细胞区室表达。NRXN1表达低且稀疏，表明定位到受限细胞状态。供体水平效应对髓系CXCL10（g = 2.235，候选q = 0.006）和NK细胞ITGA4（g = 2.745，q = 0.012）为正，对成纤维细胞TLN2（g = ?1.725，q = 0.077）和NRXN1（g = ?1.417，q = 0.409）为负。这些探索性对比仍受研究来源混杂。亚聚类进一步解析炎症、衬里、基质重塑、血管周围和衬里下成纤维细胞状态，以及不同髓系和NK细胞状态。CXCL10、ITGA4和TLN2在这些状态中的分布分别对应炎症趋化、免疫细胞迁移和基质–机械相关基因表达。因此，单细胞结果将组织水平信号定位到不同成纤维细胞、髓系、淋巴和增殖区室，并支持RA滑膜中机械转导–免疫重塑的多细胞组织。NRXN1检测稀疏：健康细胞的1.57%和RA细胞的0.52%，以及注释成纤维细胞的7.18%对1.40%。RA成纤维细胞检测主要在衬里PRG4和炎症CXCL10状态；一个供体RA884贡献了165个检测到的RA成纤维细胞中的158个，显示显著供体异质性。八个候选满足主要虚拟敲除门；NRXN1作为较低置信度成纤维细胞敏感性纳入（28/2,000检测细胞）。预测反应涉及ECM、黏附、免疫和应激反应基因。RA CellChat网络包含更多推断链接和更高聚合评分，包括健康 broad 网络中不存在的髓系到成纤维细胞SPP1–CD44和SPP1–(ITGAV+ITGB1)链接。另外，所有十个供体表达共可用性轴有正RA对健康差异；四个有名义P = 0.024和BH q = 0.060，无一个达到q < 0.05。SPP1–CD44差异为0.494（未调整95% CI 0.121–0.931），八个轴在每个供体省略分析中保持正。CXCL10–CXCR3无正 broad 网络概率，VCAM1–(ITGA4+ITGB1)在存档数据库中缺失；其共可用性评分为表达摘要。这些探索性预测不是活性信号测量。COL1A1和FN1在59个健康和51个RA broad 细胞通路中具有最大总通路流量。髓系到成纤维细胞FN1概率分别为0.217和0.475。SPP1–CD44和SPP1–(ITGAV+ITGB1)贡献RA broad SPP1概率（0.0610）的44.2%和30.8%。Fine细胞SPP1预测在两种条件下均发生，显示分辨率依赖性保留。研究人员随后在滑膜成纤维细胞中进行靶向扰动实验以测试选定虚拟敲除预测。qPCR确认过表达和siRNA处理后NRXN1和TLN2转录本的相互变化。NRXN1过表达降低COL1A1、PHLDA1、THBS1和TMEM176A表达，而两个独立NRXN1靶向siRNA增加这些转录本。TLN2过表达降低COL1A1、FN1、THBS1和PLOD2表达，而两个TLN2靶向siRNA产生相反变化。在来自一个供体的FLSs中，敲低增加COL1A1蛋白和Matrigel侵袭，而过表达降低两者（三个独立实验；蛋白质Holm调整P ≤ 0.0143，侵袭P ≤ 0.00171）。甲苯胺蓝染色暗度在一个实验中三个位置匹配技术孔中一致变化。染色质可及性在RA滑膜中提名细胞类型相关调控假设。GSE243917分析11例RA供体和1例描述性OA参考以检查RA内染色质背景。供体和细胞类型覆盖差异显著，每个证据水平的分析限制在满足预设覆盖要求的层。候选基因RNA定位和启动子可及性显示部分一致但细胞类型特异性模式，表明不同染色质状态伴随跨细胞区室的候选基因表达。候选中心染色质可及性景观识别具有不同程度细胞类型特异性的启动子近端和远端可及区域。远端可及性在供体调整分析中与候选基因表达共变。研究人员然后整合基序出现、转录因子表达和染色质可及性以优先排序候选调控因子，并在免疫和基质群体中提名转录因子–元件–基因假设。提名的关系在RA内评估。在11例RA供体中，成纤维细胞TLN2 E1–E3相关性范围为?0.418至0.073，而NRXN1相关性范围为0.345至0.645。24个选定峰–基因对中无一个达到q < 0.05；NRXN1 E3在这六个相关性中最强（ρ = 0.645，名义P = 0.0375，q = 0.225）。转录因子扰动产生基因选择性mRNA反应。FOXP2过表达增加NRXN1表达，而两个独立FOXP2靶向siRNA降低NRXN1；TLN2未显示可比反应。NFIX过表达增加NRXN1和TLN2，而NFIX敲低降低两个转录本。FOS过表达增加TLN2，而FOS敲低降低TLN2；NRXN1在FOS扰动后相对稳定。对过表达和敲低的双向反应支持FOXP2–NRXN1、NFIX–NRXN1/TLN2和FOS–TLN2表达关系。这些发现定义了RA中机械转导–免疫基因表达网络内的候选表达关系。与多队列、网络、单细胞和临床组织发现整合，九个基因代表捕获该网络不同功能维度的互补候选节点。讨论部分总结：本研究提供以机械转导为中心的框架解释RA滑膜病理。通过整合预定义机械转导基因汇编与患者来源bulk转录组学、独立队列荟萃分析、共表达网络、单细胞转录组学、染色质可及性和靶向实验，研究人员发现RA滑膜炎与机械转导相关和免疫程序的转录重塑相关。这种重塑并非均匀增加或减少。相反，RA滑膜显示较高的整合素–ECM感知和核LINC相关表达评分，同时较低黏着斑力传递和Hippo–YAP/TAZ相关评分。候选基因分布在免疫、髓系、成纤维细胞和增殖细胞状态中，并占据不同共表达模块。组成调整减弱了几个bulk关联；保留信号取决于程序和协变量定义。本研究主要优势在于候选发现限制在生物学定义的机械转导汇编而非无约束全基因组搜索。三个诊断对比服务于互补目的。RA对健康识别疾病相关变化，RA对OA评估这些变化是否超出非自身免疫关节病理，OA对健康提供与退行性或机械应激滑膜共享改变的背景。候选选择因此不要求OA代表生物学正常参考。此外，重叠样本从验证中排除，保留的患者独立队列使用仅验证随机效应荟萃分析合成。方向一致性、标准化效应量、错误发现率、队列间异质性和留一队列敏感性共同表明观察信号不能归因于单一数据集。该设计尤其与RA相关，其中疾病持续时间、治疗暴露、活检部位和组织细胞组成差异可产生显著转录异质性。程序评分描述转录重组而非机械激活。机械力已显示通过N-cadherin/ADAM15依赖信号程序诱导RA滑膜成纤维细胞侵袭表型，而循环拉伸可在不同加载条件下抑制IL-1β诱导的炎症介质产生。类似地，黏着斑激酶抑制减少RA成纤维细胞迁移和侵袭，尽管成纤维细胞特异性FAK缺失在鼠TNF驱动模型中未显著改变关节炎严重程度。这些发现表明机械刺激后果取决于力量大小、持续时间、空间背景和细胞状态。 divergent 表达评分提示细胞外感知和细胞内力传播之间偶联改变，这是机械测试的假设。较低的Hippo–YAP/TAZ相关表达评分需要在异质细胞状态中解释。实验研究已识别致病RA成纤维细胞中增加的YAP/TAZ活性，并将YAP信号与纤维炎症行为和关节炎严重程度相关联。IL-6–JAK信号可激活YAP并促进YAP–SNAIL依赖滑膜成纤维细胞侵袭，而成纤维细胞选择性Yap缺失改善实验性炎症关节炎。研究人员的结果不一定与这些观察不一致，因为bulk组织基因集评分测量异质滑膜细胞的聚合转录状态，而非特定成纤维细胞亚群中YAP/TAZ核定位、磷酸化或TEAD活性。增生衬里成纤维细胞中局部YAP激活可与其他细胞群体、反馈调控因子或成纤维细胞状态显示相反模式时较低的队列范围转录评分共存。这种解释得到RA成纤维细胞已建立功能多样性的支持：不同成纤维细胞群体与炎症、免疫相互作用或组织损伤相关而非统一致病表型。优先排序基因进一步将这种重塑解析为互补功能节点。CXCL10代表炎症趋化输出，与RA滑膜组织和液体中先前检测到的升高CXCL10–CXCR3轴一致。ITGA4和ITGB7将白细胞黏附和迁移定位在机械–免疫框架内，而SPP1连接髓系激活与基质重塑。SPP1定位到髓系状态与患者来源单细胞证据识别RA滑膜中SPP1表达巨噬细胞一致。最近空间和功能数据进一步提示SPP1高巨噬细胞可占据邻近增殖成纤维细胞的纤维蛋白富集 niche 并促进增生组织重塑。TLR8和CASP1连接内源性先天免疫感知与炎症细胞因子处理：TLR7/8表达主要定位到RA滑膜巨噬细胞，而caspase-1和炎症小体组分主要在类风湿滑膜髓系和内皮区室中检测到。CCNB1反映滑膜增生增殖组分。这些节点共同连接免疫募集、先天激活、髓系–基质重塑和组织扩张，而不要求它们作为单一顺序通路运作。TLN2和NRXN1识别不同结构和细胞相互作用维度。Talin蛋白连接整合素到肌动蛋白细胞骨架并在黏着斑传递张力；分子张力传感器研究直接证明talin依赖力传递和基质硬度感知。降低的TLN2表达提名整合素–细胞骨架偶联用于功能研究。NRXN1最好表征为神经元系统中细胞表面黏附组织者，形成调节膜纳米簇并与多个细胞外伙伴相互作用。其在RA组织和滑膜成纤维细胞中可重复降低提名滑膜中先前未充分探索的细胞相互作用节点。相互过表达和敲低实验进一步显示操纵TLN2或NRXN1改变选定ECM相关转录本方向相反，支持选定虚拟敲除转录预测。来自一个RA供体的成纤维细胞中COL1A1蛋白和Matrigel侵袭反应扩展这些发现，伴随一个实验中一致染色暗度变化。WGCNA将九个候选置于免疫、增殖和TLN2/NRXN1连接结构表达模块。因为模块在RA样本内构建，它们描述疾病组织中协调转录邻域而非仅由诊断组驱动的差异。这种网络结构也与RA患者中识别的两个分子状态一致：一个相对富集炎症和免疫程序，另一个偏好结构和机械表达程序。这些状态应被视为可重复分子模式而非固定临床亚型。然而，它们通过锁定映射在外部队列中的恢复表明炎症–结构 continuum 不限于发现数据集。这种疾病内变异在已建立滑膜异质性背景下生物学合理。单细胞研究已识别RA滑膜中扩增的HLA-DRA高成纤维细胞、IL1B阳性单核细胞、自身免疫相关B细胞和外周辅助T细胞，而更大 multimodal atlases 已解析众多细胞状态和跨患者炎症组织模式。滑膜巨噬细胞组成在活动性疾病、难治性疾病和缓解之间也不同。研究人员的单细胞分析通过将机械转导相关候选映射到成纤维细胞、髓系、淋巴、内皮和增殖区室补充这些研究。推断的成纤维细胞–髓系通讯提示基质重塑和炎症程序之间联系。HBEGF阳性巨噬细胞对成纤维细胞侵袭性的影响提供生物学背景。CellChat预测相互作用；供体表达共可用性和细胞内qPCR反应不验证这些配对。GSE225731中映射分子状态与DAS28-CRP改善之间的关联仍为探索性和未调整。先前活检研究已识别与疾病严重程度和治疗结果相关的淋巴–髓系、弥漫–髓系和少免疫滑膜病理型。在R4RA试验中，滑膜分子特征区分利妥昔单抗和托珠单抗反应，并在多药难治性疾病患者中识别基质/成纤维细胞特征。Xia等人在六名患者配对滑液 before and one month after adalimumab or tofacitinib 中观察到免疫细胞和推断通讯变化。这些纵向发现补充研究人员的组织关联。炎症和结构–机械状态可能代表RA滑膜差异的额外轴。基线活动差异和异质治疗限制这些未调整关联；在治疗分层前需要前瞻性、调整验证。实验分析为主要计算预测提供直接支持。独立滑膜组织qPCR在健康对照（n = 20）和RA患者（n = 25）中再现CXCL10、CCNB1、ITGB7、ITGA4、TLR8、SPP1和CASP1较高表达以及TLN2和NRXN1较低表达。单独随后的组织系列包括40例健康和50例RA样本进一步确认TLN2和NRXN1降低。在40个RA组织中，两个转录本与TNF-α、IL-6、IL-17A和DAS28负相关。它们在RA来源原代滑膜成纤维细胞中和24小时细胞因子处理后改变的mRNA表达支持炎症相关基质反应。此外，TLN2或NRXN1的相互过表达和siRNA介导敲低改变选定ECM相关转录本，支持虚拟敲除预测的选定转录本反应。这些未调整临床关联需要验证考虑年龄、疾病持续时间、血清状态和药物暴露，然后解释为独立标志物。最后，scATAC-seq在采样RA细胞背景中提名细胞类型相关可及区域、基序和峰–基因链接。这些结果优先排序FOXP2和NFIX与NRXN1相关以及NFIX和FOS与TLN2相关。这些转录因子的靶向过表达和敲低产生NRXN1或TLN2 mRNA相应变化，支持候选TF–基因表达关系。可及性、基序出现和TF表达提供互补证据用于优先排序；占据和功能增强子活性仍未解决。NRXN1/TLN2的直接结合和顺式调控控制是机制假设。GSE243917包括11例RA供体、1例OA参考和无健康对照。单个OA供体不能代表OA变异。这些发现支持RA内调控假设；建立RA特异性染色质变化需要可比较多组队列，具有多个RA、健康和OA供体。几个考虑定义这些发现的范围。Bulk表达反映细胞组成、治疗和活检位置。评分取决于基因集定义；电子推断GO扩展注释仍为假设生成。单细胞比较涉及五例健康和四例RA供体，诊断–研究完全混杂和性别不平衡（RA，三女/一男；健康，五男）。Harmony不解决这种混杂，更多细胞不增加独立供体。某些状态中较少合格供体限制精度和普遍性；非显著跨研究对比不建立无差异。外部巨噬细胞支持CXCL10（四健康/八RA供体）仍受招募 site、年龄和性别混杂，不验证成纤维细胞或NK细胞发现。巨噬细胞状态组成也可能贡献。NRXN1检测强烈供体依赖；零计数不建立缺失。机械转导和Hippo–YAP/TAZ评分描述表达关联，而非直接机械测量或证明通路激活。这些点定义清晰实验优先事项，包括供体复制、细胞类型特异性扰动和候选机械节点体内评估。NRXN1/TLN2扰动支持选定转录本反应；靶标调节通过qPCR确认。COL1A1蛋白和Matrigel侵袭提供来自一个RA供体三个独立实验的初步终点证据；甲苯胺蓝染色代表一个实验中三个技术孔。内源性NRXN1蛋白发现为描述性：α定向blot使用两例RA供体在一个实验中，每个细胞因子比较一个，无健康对照。较低分子量条带身份仍未解决。抗体α指定和α4参考引物不建立内源性剪接身份、同种型优势或β/γ表达。MCP-counter估计标记衍生相对丰度，可能受激活和不完全覆盖影响；重叠排除成纤维细胞估计有三个标记。标记排除不确保独立于表达结果。诊断间差协变量重叠使调整系数取决于模型假设和外推，排除完全组成控制或细胞内在机械效应声明。总之，联合证据支持RA滑膜炎涉及异质机械转导–免疫转录网络的模型。该网络连接免疫和基质程序。通过结合可重复患者来源关联与组织qPCR和扰动实验，本研究提供框架研究物理和炎症信号如何共同塑造RA滑膜异质性并优先排序候选关系功能研究。研究结论部分翻译：本研究表明RA滑膜炎伴随多细胞机械转导–免疫网络的协同转录重塑。预定义机械转导基因汇编、独立队列验证和随机效应荟萃分析识别与免疫细胞黏附和迁移、髓系炎症活动、基质重塑、细胞增殖和细胞内力量传递相关程序的可重复表达改变。WGCNA和探索性单细胞RNA测序进一步将这些变化定位到互补免疫、髓系、成纤维细胞、内皮和增殖细胞状态，而单细胞染色质可及性和细胞通讯分析提名细胞类型特异性调控程序和配体–受体表达关联代表推断通讯潜力。初始独立临床组织qPCR再现主要表达模式。在单独随后组织系列中观察到与炎症介质和疾病活动的探索性未调整关联。滑膜成纤维细胞扰动实验显示TLN2或NRXN1操纵后选定ECM相关转录本变化以及转录因子扰动后TLN2/NRXN1 mRNA变化。总之，这些患者来源多组学和实验发现提供整合转录框架连接RA滑膜病理中免疫募集、炎症输出、基质重塑和机械转导相关基因表达。该框架为研究RA异质性 underlying 细胞和调控机制以及优先排序实验可处理机械转导相关关系提供基础。Bulk评分关联仍对细胞组成和模型规范敏感，需要在解释为细胞内在变化前进行细胞分辨验证。染色质衍生调控关系仍为采样RA背景内假设，因为多组数据集缺乏健康对照且仅包括一个描述性OA参考供体。NRXN1/TLN2的直接TF占据和顺式调控控制也仍有待建立。