《Frontiers in Pharmacology》：Modulation of the TGF-β1-related response of human dental pulp stem cells by PRF membranes with and without bone allograft
编辑推荐：
目的：评估暴露于不同PRF制备物（单独使用或与骨同种异体移植物联合使用）的条件培养基后，人牙髓干细胞（hDPSCs）的TGF-β1相关细胞反应。
材料与方法：研究了四种PRF制备物（A-PRF+、H-PRF、Gel A-PRF+和e-PRF），分别在有或无骨同
目的：评估暴露于不同PRF制备物（单独使用或与骨同种异体移植物联合使用）的条件培养基后，人牙髓干细胞（hDPSCs）的TGF-β1相关细胞反应。
材料与方法：研究了四种PRF制备物（A-PRF+、H-PRF、Gel A-PRF+和e-PRF），分别在有或无骨同种异体移植物的条件下进行。每组包含10个独立生物学样本（n=10）。分别在24小时和第14天收集条件培养基。未经处理的培养基培养的hDPSCs作为对照组。处理48小时后，采用细胞ELISA评估TGF-β1相关细胞免疫反应性，并以甘油醛-3-磷酸脱氢酶（GAPDH）进行标准化。统计分析采用Kruskal-Wallis检验结合Dunn事后检验及Bonferroni校正。直接配对比较采用Wilcoxon符号秩检验及Bonferroni校正。
结果：不含同种异体移植物的PRF制备物与对照组相比，未显示标准化TGF-β1/GAPDH信号的显著增加。在24小时条件培养后，与对照组相比，H-PRF、Gel A-PRF+和e-PRF联合同种异体移植物组观察到显著增加。在第14天，Gel A-PRF+和e-PRF联合同种异体移植物组仍观察到显著增加。直接配对比较显示，在第14天，Gel A-PRF+和e-PRF联合同种异体移植物组的信号显著高于相应的不含同种异体移植物的制备物，而在24小时未检测到显著差异。
结论：hDPSCs的TGF-β1相关反应因PRF制备物、同种异体移植物补充及条件培养周期的不同而异。Gel A-PRF+和e-PRF联合同种异体移植物所观察到的显著效应支持将这些复合物作为潜在的生物活性材料用于活髓治疗的进一步研究。
研究背景与科学问题
牙髓活力的保存是临床挑战，尤其在牙髓暴露和炎症情况下。活髓治疗的目标包括控制微生物影响、抑制炎症反应并刺激修复性牙本质形成的细胞机制。传统材料如硅酸钙水门汀虽具备良好生物相容性和矿化支持能力，并能刺激牙本质基质释放转化生长因子β1（TGF-β1），但仍存在操作困难、凝固时间长、抗菌效果有限以及可能引起过度矿化和牙髓腔狭窄等问题。因此，有必要探索可作为硅酸钙材料辅助手段的生物活性剂。
自体血小板浓缩物，特别是富血小板纤维蛋白（PRF），因其无需抗凝剂、形成富含血小板、白细胞和生长因子的纤维蛋白网络而被优先选用。不同PRF变体在纤维蛋白基质结构、血小板和白细胞数量分布以及生长因子释放动力学方面存在差异。例如，A-PRF+、Gel A-PRF+和H-PRF主要在愈合早期（约10-14天）释放生长因子，而e-PRF可释放长达2-3个月。TGF-β1在细胞分化、矿化和修复性牙本质形成中发挥关键作用，是研究牙髓细胞再生反应的合适标志物。
将骨同种异体移植物加入PRF膜可能进一步丰富局部微环境，因为同种异体骨移植物含有骨形态发生蛋白、TGF-β1和成纤维细胞生长因子等基质结合生物活性信号。由于牙髓干细胞也来源于间充质且可分化为成牙本质样细胞，骨同种异体移植物的掺入可能影响局部再生微环境。
目前文献中缺乏对A-PRF+、H-PRF、Gel A-PRF+和e-PRF在有或无骨同种异体移植物条件下，其条件培养基处理后hDPSCs的TGF-β1相关反应进行比较评价的研究。本研究旨在评估不同PRF膜（单独或联合骨同种异体移植物）的条件培养基对hDPSCs的TGF-β1相关细胞反应的影响。
关键技术方法
研究人员从单颗第三磨牙牙髓组织中分离hDPSCs，使用第四代细胞。PRF膜由10名健康男性志愿者（25-35岁）静脉血制备，每种PRF类型各10份样本。四种PRF制备方法包括：A-PRF+（固定角离心，1300 rpm，14分钟）、Gel A-PRF+（固定角离心后取上层液体成分使其自发凝胶化）、H-PRF（水平离心，700 rpm，8分钟）和e-PRF（热处理的贫血小板血浆与液态PRF组分混合）。条件培养基制备：将完整PRF膜置于3 mL无血清DMEM中，有或无0.11 g颗粒状皮质-松质骨同种异体移植物（Allodyn? Dental CS Fine），分别在24小时和第14天收集条件培养基。hDPSCs处理48小时后，采用细胞ELISA试剂盒检测TGF-β1和GAPDH，计算标准化TGF-β1/GAPDH比值。
研究结果
3.1 不含骨同种异体移植物的PRF膜条件培养基的结果
在无骨同种异体移植物的PRF膜条件培养基处理组中，无论是24小时还是第14天的条件培养，均未观察到标准化TGF-β1/GAPDH信号相对于未处理hDPSC对照组的统计学显著增加。24小时后，e-PRF组均值最高，其次为A-PRF+和H-PRF，但均未达统计显著性。第14天，各组均值接近对照组，无显著差异。表明在本实验模型条件下，无骨同种异体移植物的PRF膜条件培养基未能诱导hDPSCs的TGF-β1相关细胞反应显著增加。
3.2 含骨同种异体移植物的PRF膜条件培养基的结果
在PRF膜联合骨同种异体移植物的组别中，观察到标准化TGF-β1/GAPDH信号的差异。24小时条件培养后，H-PRF+骨同种异体移植物、Gel A-PRF++骨同种异体移植物和e-PRF+骨同种异体移植物组相对于未处理对照组显示出统计学显著增加，其中Gel A-PRF++骨同种异体移植物组均值最高。A-PRF++骨同种异体移植物组与对照组无显著差异。第14天，Gel A-PRF++骨同种异体移植物和e-PRF+骨同种异体移植物组仍保持统计学显著增加，e-PRF+骨同种异体移植物组均值最高。H-PRF+骨同种异体移植物组均值高于对照组，但多重比较校正后未达统计显著性。结果表明，PRF膜联合骨同种异体移植物时，hDPSCs的TGF-β1相关细胞反应取决于PRF膜类型和条件培养周期。
3.3 PRF膜有和无骨同种异体移植物的直接比较
直接配对比较显示，24小时条件培养后，所有PRF类型在有和无骨同种异体移植物之间均无统计学显著差异。第14天，Gel A-PRF+（p=0.0078）和e-PRF（p=0.0234）在有骨同种异体移植物条件下的标准化TGF-β1/GAPDH信号显著高于无骨同种异体移植物条件，效应量（Cohen's d）分别为1.53和1.88，证实了差异的实质性程度。A-PRF+和H-PRF则无显著差异。
讨论与结论
讨论部分指出，TGF-β1是牙髓再生反应的关键调节因子，参与细胞增殖、分化、趋化、凋亡和细胞外基质重塑。血小板是体内TGF-β1的主要来源之一，以潜伏形式储存于α颗粒中。本研究中，TGF-β1/GAPDH比值代表标准化的相对细胞信号，而非条件培养基中的绝对浓度。研究发现，骨同种异体移植物加入Gel A-PRF+和e-PRF膜后，显著增加了hDPSCs的标准化TGF-β1/GAPDH信号。然而，细胞ELISA方法无法区分潜伏和生物活性形式的TGF-β1，也无法证明SMAD依赖或非依赖性信号通路的激活，因此增加的TGF-β1/GAPDH比值应仅解释为TGF-β1相关细胞免疫反应性的增强。
研究结论：本研究提供了关于hDPSCs对不同PRF膜（单独或联合骨同种异体移植物）的TGF-β1相关细胞反应的新实验数据。直接比较有和无骨同种异体移植物的PRF制备物发现，在14天条件培养后，Gel A-PRF+和e-PRF的标准化TGF-β1/GAPDH信号显著增加，效应量分析进一步证实了差异的实质性程度。这些发现表明，骨同种异体移植物对TGF-β1相关细胞反应的影响取决于PRF膜类型和条件培养周期。这些结果为进一步研究PRF-骨同种异体移植物复合物作为活髓治疗的潜在生物活性材料提供了实验基础，但仍需更多的实验室和临床研究。
