《RAPID COMMUNICATIONS IN MASS SPECTROMETRY》：Of Patients Like No Other: High-Resolution Paleoproteomic Analysis of Biological Residues on Garments Attributed to Marie-Antoinette and Louis XVII
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研究背景：对王后玛丽-安托瓦内特（Marie-Antoinette，1755—1793）与路易·夏尔·德·法兰西、诺曼底公爵及后来的路易十七（Louis XVII，1785—1795）服饰上存在的生物痕迹进行古蛋白质组学（paleoproteomic）分析，使
研究背景：对王后玛丽-安托瓦内特（Marie-Antoinette，1755—1793）与路易·夏尔·德·法兰西、诺曼底公爵及后来的路易十七（Louis XVII，1785—1795）服饰上存在的生物痕迹进行古蛋白质组学（paleoproteomic）分析，使研究人员能够精确鉴定这些残留物的组成，并更好地理解这两位"来自过去的患者"的健康状况。研究方法：从六件不同衣物采集的16份样本中提取蛋白质，经胰蛋白酶酶解，所得肽段使用Orbitrap Astral仪器进行串联质谱分析。在未对物种来源作任何预设的情况下进行的初步蛋白质分型（proteotyping）分析，明确证实这些蛋白质为人类来源。随后进行靶向数据库检索以完成蛋白质鉴定与无标记定量（label-free quantification）。研究结果：共获得76421个肽段-谱图匹配（peptide-to-spectrum matches），列出3457条蛋白质分型肽段，可在每个个体样本中鉴定出361种蛋白质（每种蛋白质至少含两条特异性肽段序列）。在归属于玛丽-安托瓦内特的残留物中检测到PAUF与STIP1肽段，而在归属于路易十七的残留物中检测到与男性泌尿生殖组织及炎症反应相关的蛋白质。这些发现分别与含血液或尿液的残留物以及非特异性肿瘤性或炎症性背景相符。结论：本研究证明古蛋白质组学在从古代材料上的生物痕迹重建古病理学特征方面具有潜力，为疾病史、古流行病学（paleoepidemiology）与回顾性诊断（retrospective diagnosis）研究开辟了新视角。
研究背景与问题提出：古蛋白质组学（paleoproteomics）是研究从骨骼、牙齿、木乃伊化组织或毛发等古代生物遗存中提取的蛋白质的科学学科。与DNA不同，蛋白质随时间推移更为稳定，即使遗传物质已高度降解，仍可对其实现鉴定与利用。借助高分辨率串联质谱等分析技术，古蛋白质组学能够鉴定已灭绝物种的遗存、通过追溯其与已表征物种的关系确定其在系统发育谱系中的位置、更好地理解过去的饮食与环境，并在本案例中还可对身份明确的历史个体进行古代疾病诊断。由于古代蛋白质通常仅以痕量形式保存，利用蛋白质生物档案重建过去事件的研究仍 largely 未被充分探索，在高分辨率质谱层面亟需更多关注。在此背景下，研究人员将古蛋白质组学分析应用于保存在巴黎时装博物馆（Palais Galliera，法国巴黎）及一处私人收藏中的18世纪服饰，以确定其上污渍的确切性质。在确认其人类生物学来源后，研究目标为进一步深入了解穿着这些衣物的两位"患者"的健康状况。
研究内容与总体结论：研究共从六件不同衣物（表1）采集16份样本。其一为据信由王后玛丽-安托瓦内特穿着的束身衣，具有"grand corps"特征，即一种特定、带支撑骨的形制，属于"grand habit"（正式宫廷服装）的组成部分，与大型"panier"（裙撑）及拖裾一同穿着。该束身衣据与斯德哥尔摩Livrustkammaren所藏、霍尔斯坦-戈托普的埃德维格·伊丽莎白·夏洛特（Edwige élisabeth Charlotte of Holstein-Gottorp，1759—1818）婚礼"grand habit"宫廷束身衣（inv. 3523）比较，定年为1775—1780年。另三件衣物归属于未来的路易十七，包括两条长裤并分别与一件外套（长裤inv.1987.2.47与外套inv.1992.478.1）及一件马甲与外套（inv.2003.64.2abc）相配。18世纪男性穿着及膝短裤而非长裤，仅水手与匈牙利军服为例外；1780年代，将贵族男孩打扮成受这两类社会衣橱启发的装束成为时尚。根据尺寸，王太子（Dauphin）的这些衣物最可能制作于王室居于杜伊勒里宫（Tuileries）期间、即1792年8月9日之前（国王于1793年1月21日去世后不可能再制作）。最后一件衣物为衬衫，就其尺寸而言可能制作更早（1790年代），但就其来源而言不可能在国王去世后由王太子穿着（该衬衫inv.2003.64.1与套装inv.2003.64.2abc经由路易十六的贴身侍从Jean-Baptiste Cléry（1759—1809）传至后世，此人于路易十六去世后离开圣殿塔）。因此这些衣物是典型的贵族男孩装束。所有样本均以无菌湿润棉签用力涂抹采集。古蛋白质组学分析在CEA下属Li2D的ProGénoMix平台进行，遵循严格的污染控制方案，包括在专用于古代遗存的层流罩内处理样本。为保护样本免受人与环境污染，初始处理与提取在配备HEPA过滤的PCR工作站（VWR，Avantor）内完成；在样本引入前，罩内表面以纯乙醇去污；该工作站置于需全套个人防护装备（实验室外套与丁腈手套）方可进入的专用实验室内，以防来自皮肤或衣物纤维的房间级污染。每支棉签上的生物材料溶于1× LDS缓冲液（Thermo），随后按先前所述方案使用Precellys仪器（Bertin technologies）进行珠磨法蛋白质提取。经99°C处理5 min后，蛋白质通过变性凝胶电泳纯化，经充分洗涤后在胶内用胰蛋白酶酶解。所得肽段在Vanquish Neo UHPLC（Thermo）与Orbitrap Astral质谱仪（Thermo）联用系统上分析。溶剂系统为水中的0.1%甲酸（FA，溶剂A）与乙腈中的0.1% FA（溶剂B）。肽段（约50 ng）加载于PepMap Neo Trap（Thermo）预柱（C18，5 μm，0.3 × 5 mm），随后在Aurora Ultimate（IonOpticks）纳升级色谱柱（C18，1.7 μm，25 cm × 75 μm）上以400 nL min?1流速、30 min梯度分离。色谱分离采用溶剂B梯度：25 min内由3%升至25%，5 min内由25%升至36%，1 min内由36%升至80%，随后在80%保持9 min。样本间系统性进行空白纳升级液相色谱-串联质谱（nanoLC-MS/MS）以避免前次分析残留。Orbitrap Astral配备EASY spray源，正离子模式运行，源温280°C，喷雾电压1600 V。仪器以数据依赖采集模式运行，循环时间1 s。全扫描MS1在m/z 350—1500范围内采集，母离子在Orbitrap分析器中以120000分辨率采集，归一化自动增益控制（AGC）设为300%，最大注入时间50 ms。前体离子依据最低强度阈值5000选择进行MS/MS碎裂；应用电荷态过滤仅选择+2与+3，并启用同位素排除。在肽段模式下应用单同位素前体选择（MIPS），结合平均与非标准算法进行峰判定。动态排除设为10 s。肽段以m/z 2的隔离宽度分离，并以30%碰撞能量的高能碰撞解离碎裂。Astral分析器以最高100 Hz的扫描速度在m/z 110—2000范围内记录碎片离子扫描，每个循环的MS/MS扫描数不设固定Top-N上限，归一化AGC目标为100%，最大注入时间5 ms。记录数据首先通过无先验的蛋白质分型解读，以鉴定样本中蛋白质的产生生物，如最初所述；简言之，使用Mascot软件（Matrix Science）进行三次迭代检索，基于分类群信息性肽段将蛋白质序列数据库缩小至各样本最具价值的已注释基因组代表。蛋白质分型参数为：半胱氨酸残基氨甲酰甲基化（固定修饰），甲硫氨酸氧化、天冬酰胺与谷氨酰胺脱酰胺、蛋白质N端乙酰化（可变修饰）。分类群-谱图匹配按先前定义分配，以获得各分类群数量的替代指标；在所有可能的分类学层级上统计所鉴定全部分类群的分类群特异性肽段序列数；当未鉴定出其他主要贡献分类群时，分析集中于人类蛋白质的检测与定量。另使用Mascot（v2.6.0，Matrix Science）以人类UniProt审阅数据库（2025_03版，2025年7月4日下载，20433条条目）于2025年7月4日与7日进行补充解读；该检索中半胱氨酸残基氨甲酰甲基化设为固定修饰，甲硫氨酸氧化、天冬酰胺与谷氨酰胺脱酰胺及蛋白质N端乙酰化设为可变修饰；允许最多两个漏切位点；肽段前体质量容差设为5 ppm，MS/MS离子碎片质量容差设为0.02 Da。假发现率（FDR）通过Mascot自动靶-诱饵检索策略控制，肽段水平显著性阈值p < 0.01，期望值截止为0.01，以确保高置信度蛋白质鉴定。满足每种蛋白质至少两条唯一肽段最低要求的蛋白质鉴定FDR低于1%。由单一唯一肽段鉴定的蛋白质，在相应肽段-谱图匹配经人工验证、确认实验与理论质量精确对应（±5 ppm以内）且具有完整系列b-与y-碎片离子（占b-或y-离子系列至少70%）时亦予以评述。质谱蛋白质组学数据已通过PRIDE合作存储库存入ProteomeXchange联盟数据库，数据集标识符为PXD073344，项目DOI为10.6019/PXD073344。
研究方法关键技术概括：样本队列来源为巴黎时装博物馆（Palais Galliera）藏品及一处私人收藏，共六件衣物（玛丽-安托瓦内特束身衣、睡衣，路易十七长裤、衬衫、套装等），采集16份拭子样本；关键技术包括严格防污染的古样本处理与珠磨法蛋白质提取、变性凝胶电泳纯化与胶内胰蛋白酶酶解、Vanquish Neo UHPLC与Orbitrap Astral高分辨率串联质谱数据依赖采集、无先验蛋白质分型（Mascot迭代检索）与靶向人类UniProt数据库检索、无标记定量及基于靶-诱饵策略的FDR控制与人工谱图验证。
研究结果：（1）玛丽-安托瓦内特相关样本的蛋白质鉴定：在其绿色束身衣（衣物GAL1997.76.1）的五个污渍区域，通过鉴定人血红蛋白与免疫球蛋白的多种特异性肽段，确认存在人血液来源残留物（尽管应考虑潜在污染与组织-体液重叠）。一种癌症相关蛋白标志物，即胰腺腺癌上调因子（pancreatic adenocarcinoma up-regulated factor，PAUF），在四个位点（样本2、3、4、5）被鉴定；其存在与胰腺癌尤为相关，也与某些胃肠道及妇科癌症形式相关。然而，该肿瘤微环境调节因子的存在不足以特异性区分胰腺、胃肠道、结直肠或妇科恶性肿瘤或非恶性状况。该标志物此前已在血液中通过质谱检测到。此处样本3中该蛋白鉴定出两条唯一肽段：VSVGLLLVK [43—51]与VFVAFQAFLR [86—95]。另一标志物应激诱导磷蛋白1（stress-induced-phosphoprotein 1，STIP1），与结直肠癌及妇科（主要为卵巢）癌相关，在样本1中被鉴定，同样由多条肽段支持：LDPHNHVLYSNR [33—44]、RTYEEGLK [93—100]与HEANNPQLK [101—109]。因此，对于曾与该束身衣直接接触的个体（其中极可能包括王后），结直肠和/或妇科癌症（可能累及邻近器官）的假设具有显著可能性。此外，将该衣物的蛋白质谱与孔西埃热里监狱（Conciergerie）睡衣污渍所获蛋白质谱比较，结果一致并存在重叠，因而指向同一身份（玛丽-安托瓦内特）：在该睡衣上，PAUF亦在三个位点（样本8—10）被鉴定。（2）路易十七相关样本的蛋白质鉴定：在归属于王太子的样本中，从两条长裤与会阴解剖接触的组织拭子上确认存在人尿液（男性泌尿学肽段标志物：主要为睾丸特异性甘油醛-3-磷酸脱氢酶，另有附睾特异性α-甘露糖苷酶与精胺合酶）。此外，在这些样本以及其他可能对应汗液与出血性渗出的样本中，突出显示大量在炎症背景下产生的蛋白质标志物：血清淀粉样蛋白A-1（SAA1），急性期标志物；α-1-酸性糖蛋白1/2（ORM1/ORM2），炎症标志物；髓过氧化物酶（MPO），与氧化应激相关；补体C4-A；多萜基-二磷酸-寡糖-蛋白质糖基转移酶亚基DAD1；HSP90-alpha（HSP90AA1），应激蛋白；HSP70（线粒体应激-70）与HSPA9，参与应激反应的分子伴侣；HSP beta-1（HSPB1），调节炎症与氧化应激的蛋白；溶菌酶C（LYZ），靶向细菌细胞壁的抗菌酶。（3）历史背景与年代学印证：结合王太子1795年6月8日去世后的历史尸检，Pelletan医生的检查将肺源性广泛结核（多发性淋巴结病、Pott病等）列为死因（"phtisia"）。该由18世纪直接尸体检查作出的诊断，在本次分析中未通过任何Mycobacterium tuberculosis特异性肽段的检测得到确认。该衣物在1793年2月之前由男孩穿着，其尿液痕迹可能反映应激性遗尿（该儿童在戏剧性境况下被关押近2年后于10岁死亡）和/或Pelletan医生所观察到的感染累及泌尿生殖系统的功能性后果。最后，本研究通过生物学数据补充了玛丽-安托瓦内特与路易十七（王太子）使用这些纺织品的年代学。王后束身衣依据与其他类似藏品的比较研究定年为1775至1780年间：大量生物痕迹的存在及其与睡衣上所发现痕迹的相似性，似乎确认了穿着者同一身份（玛丽-安托瓦内特）。王太子整套衣物同样如此，其制作时间可定为其离开杜伊勒里宫（1792年8月13日）之前或其在圣殿塔逗留的最初阶段（1793年1月最初几周），即他已受结核侵袭、临近其在圣殿塔监狱的痛苦与死亡之前的时期。
讨论与结论：这些结果凸显了对古代纺织品进行古蛋白质组学分析的医学价值，此类纺织品通过生物流体的浸润转移有机标志物而保存了丰富信息。将古病理学中已成熟的方案应用于可称为"组织复制孪生"（即通过吸附固定于织物上的生物流体样本）的对象，不仅能够鉴定古代纺织品上污渍的性质，还能更好地记录穿着者（即"患者"）的健康与疾病状况。然而必须注意，纺织品在储存与保存过程中也可能受到污染，因此任何结论均应谨慎解读，并与文化遗产专家的相关信息相互印证。就玛丽-安托瓦内特而言，这些蛋白质的检测与累及妇科器官的胃肠道癌症相符；就路易十七而言，蛋白质检测确认了尿液来源，并与全身性炎症背景相符。必须指出，此类结果并不能百分之百确定恶性或严重炎症状况。由于子宫出血（metrorrhagia）的历史文献作为背景证据尚可讨论，不应被用来将非特异性的蛋白质组学观察转变为确定性诊断。本研究结论为：这些结果凸显了对古代纺织品进行古蛋白质组学分析的医学价值，纺织品通过生物流体浸润转移有机标志物而保存了丰富信息；通过将古病理学中已确立的方案应用于"组织复制孪生"，不仅可鉴定古代纺织品污渍的性质，还可更好地记录穿着者（"患者"）的健康与疾病；但纺织品在储存与保存中可能受污染，故结论应谨慎解读并与文化遗产专家信息相互印证；就玛丽-安托瓦内特而言，所检测蛋白质与累及妇科器官的胃肠道癌症相符，就路易十七而言，检测确认尿液来源且与全身性炎症背景相符；此类结果不能百分之百确定恶性或严重炎症状况，历史文献中的子宫出血记载不应被用于将非特异性蛋白质组学观察转化为确定性诊断。
