高负担ASXL1G646Wfs*12变异与基因表达谱分型揭示第三代酪氨酸激酶抑制剂治疗慢性髓性白血病的基因组及转录组预后特征

《Leukemia》：Genomic and transcriptomic features associated with responses and outcomes of third-generation tyrosine kinase-inhibitor therapy in chronic myeloid leukemia

第三代酪氨酸激酶抑制剂（3G-TKIs），包括奥雷巴替尼（olverembatinib）和帕纳替尼（ponatinib），对既往TKIs治疗失败的慢性髓性白血病（CML）患者有效，但仍有较多受试者应答和结局不佳。与3G-TKI预后相关的更广泛的基因组和转录组特征仍未被完全阐明。研究人员对202例接受奥雷巴替尼或帕纳替尼治疗的受试者在基线和治疗期间的基因组和转录组数据进行了分析。在惩罚多变量分析中，高负荷ASXL1 p.G646Wfs*12（ASXL1^G646Wfs*12）变异成为与较差应答和结局相关的最一致的基因组特征；其他低频变异，包括RUNX1、IKZF1、PHF6、SETBP1和GATA2变异，也与应答和/或结局相关。纵向基因组分析显示，ABL1变异在3G-TKI治疗期间频繁减少，而持续存在、新出现或扩增的非ABL1变异克隆在耐药受试者中富集，提示在后线耐药中向BCR::ABL1非依赖性克隆演化转变。转录组分析识别出三个具有不同预后的基于基因表达谱（GEPs）的聚类。良好预后与较低的白血病干性和更强的免疫活性转录特征相关，而不良预后以干性和增殖主导、免疫抑制状态为特征。这些发现识别了与3G-TKI预后相关的基因组和转录组特征，并为后线CML的分子风险分层提供了潜在框架，尚需独立验证。

慢性髓性白血病（CML）是一种以BCR::ABL1融合基因为分子标志的骨髓增殖性肿瘤。第一代酪氨酸激酶抑制剂（TKI）伊马替尼及第二代TKI（2G-TKI）的应用显著改善了患者预后，但仍有部分患者因耐药或疾病进展而治疗失败。第三代TKI（3G-TKI），包括奥雷巴替尼（olverembatinib）和帕纳替尼（ponatinib），对既往TKI治疗失败的患者有效，包括携带BCR::ABL1^T315I变异的患者。然而，近半数接受3G-TKI治疗的患者仍存在耐药，且预后异质性的分子基础尚不明确，预后生物标志物有限。既往研究表明，除ABL1变异外，ASXL1、RUNX1和TET2等体细胞变异与接受伊马替尼和/或2G-TKI治疗患者的治疗失败和/或疾病进展相关；不同的基因表达谱（GEPs）也与分子学应答和无治疗缓解相关，提示基因组和转录组数据具有风险分层的潜在价值。然而，这些方法尚未在3G-TKI治疗人群中得到系统研究。因此，研究人员整合基因组和转录组数据，以识别与重度治疗CML患者3G-TKI治疗应答和结局相关的分子特征，为改善风险分层及探索耐药机制和治疗策略提供依据。

研究人员开展了一项回顾性研究，纳入2016年10月至2025年1月在北京大学人民医院接受奥雷巴替尼（n=166）或帕纳替尼（n=36）治疗的202例成人CML患者（慢性期n=125，加速期n=77），这些患者均在伊马替尼和/或2G-TKI治疗失败后接受3G-TKI治疗。186例（92%）受试者入组临床试验（奥雷巴替尼相关注册号：ChiCTR1900027568、NCT03883087、NCT03883100、NCT04126681；帕纳替尼相关注册号：NCT04233346），其余16例（8%）接受奥雷巴替尼治疗者来自上市后临床实践。末次随访时间为2025年10月31日。研究经北京大学人民医院伦理委员会批准（编号2023PHB158），所有受试者均签署知情同意书。诊断和应答评估遵循ELN推荐意见。主要耐药定义包括：≥12个月未达到部分细胞遗传学应答（PCyR）或完全细胞遗传学应答（CCyR）、出现新的耐药ABL1变异和/或高风险附加细胞遗传学异常（ACAs）、或转化为进展期。研究人员在3G-TKI治疗前采集基线样本，以配对颊黏膜样本作为胚系变异对照，在达到稳定PCyR或CCyR时及耐药事件发生时采集纵向随访样本。研究得出以下主要结论：高负荷ASXL1^G646Wfs*12变异是与较差应答和结局相关的最一致基因组特征；ABL1变异在3G-TKI治疗期间频繁减少，而持续存在、新出现或扩增的非ABL1变异克隆在耐药受试者中富集，提示后线耐药向BCR::ABL1非依赖性克隆演化转变；基于GEPs的聚类可独立预测应答和结局，良好预后与低白血病干性和免疫活性特征相关，不良预后以干性和增殖主导、免疫抑制状态为特征。该研究为后线CML的分子风险分层提供了潜在框架，具有重要意义。作者指出，这些发现尚需独立验证后方可应用于临床。

在技术方法方面，研究人员采用定制化杂交捕获 panel 对475个血液系统恶性肿瘤相关基因进行靶向DNA测序，检测ABL1和非ABL1体细胞变异，平均覆盖深度为1200×至2000×，并采用Sanger测序对变异等位基因频率（VAF）<10%的ASXL1^G646Wfs*12变异进行验证；采用Illumina TruSeq Stranded mRNA Library Preparation Kit建库，在Illumina NovaSeq 6000平台进行配对端RNA测序，清洁reads以HISAT2比对至GRCh38参考基因组；采用弹性网（Enet，alpha=0.2）等55种机器学习方法从基线RNA测序数据中衍生40基因预后特征，并进行共识聚类；采用xCell算法进行细胞类型去卷积分析微环境景观；采用ssGSEA和GSEA进行基因集富集分析；采用Firth惩罚多变量Cox回归和交叉验证LASSO-Cox敏感性分析评估预后特征的稳健性。研究队列来源于北京大学人民医院单中心连续病例，包括临床试验入组和上市后临床实践患者。

研究结果如下：

受试者特征：141例（70%）为男性，中位年龄44岁（IQR 32–52岁）。3G-TKI启动时125例（62%）处于慢性期，77例（38%）处于加速期。从诊断至3G-TKI启动的中位间隔为56个月（IQR 26–105个月）。23例（11%）既往仅接受伊马替尼，22例（11%）仅接受2G-TKIs，157例（78%）同时接受过伊马替尼和2G-TKIs。3G-TKI治疗中位随访58个月（IQR 39–72个月）。194例基线无CCyR的受试者中，119例（61%）随后在中位3个月（IQR 2–8个月）达到CCyR。108例（53%）达到主要分子学应答（MMR），85例（42%）达到MR4。19例慢性期受试者在中位28个月（IQR 15–50个月）进展为加速期（n=9）或急变期（n=10）；28例加速期受试者在中位14个月（IQR 4–26个月）进展为急变期。35例（17%）死亡，其中28例死于疾病进展，7例死于CML无关原因。CCyR、MMR和MR4的5年累积发生率分别为66%（95%CI 61–71%）、57%（51–63%）和49%（39–59%）。无进展生存（PFS）、总生存和CML相关生存的5年概率分别为77%（68–86%）、83%（76–90%）和86%（75–97%）。所有202例受试者均有基线样本用于靶向DNA测序，149例样本合格用于RNA测序，111例有连续随访样本用于遗传变异动态分析，130例用于纵向基因表达谱分析。

基线遗传变异景观：167例（83%）携带ABL1变异，中位数为每例1个（IQR 1–2），其中单纯ABL1^T315I 96例（48%），ABL1^T315I合并其他ABL1变异38例（19%），其他ABL1变异33例（16%）。177例（88%）检出131个基因的其他体细胞变异，中位数为每例2个（IQR 1–3），涉及染色质修饰（n=153；76%）、转录因子（n=30；15%）、细胞信号（n=29；14%）、DNA甲基化（n=21；10%）、抑癌基因（n=16；8%）和黏连蛋白复合物（n=6；3%）。最常见的变异基因为ASXL1（n=133；66%）、RUNX1（n=14；7%）、KMT2D（n=15；7%）、KMT2C（n=12；6%）、DNMT3A（n=10；5%）和TET2（n=10；5%）。携带ASXL1变异的受试者中，44例（22%）携带ASXL1^G646Wfs*12变异。慢性期与加速期受试者携带ABL1或其他体细胞变异的比例无显著差异，但加速期受试者每例携带的ABL1变异数（p=0.02）和其他体细胞变异数（p=0.03）更多；加速期受试者中ASXL1^G646Wfs*12（p=0.006）、RUNX1（p=0.04）和KMT2C（p=0.01）变异频率及Ph+ ACAs（p<0.001）显著高于慢性期受试者；加速期受试者ASXL1变异VAF（包括ASXL1^{non-G646Wfs*12}，p=0.009；ASXL1^G646Wfs*12，p=0.04）显著更高。随着既往TKI治疗线数增加，携带ABL1变异的受试者比例降低（p<0.001），而携带其他体细胞变异的受试者比例升高；每例ABL1变异数也随既往TKI暴露增加而减少（p=0.006），其他体细胞变异数呈非显著增加（p=0.13）；具体而言，DNMT3A（p=0.04）和TET2（p=0.04）变异频率增加，ASXL1变异VAF增加（p=0.01–0.04）。研究人员还探索了体细胞变异与细胞遗传学异常之间的共现和互斥关系。

体细胞变异对治疗应答和结局的影响：携带更多ABL1或其他体细胞变异的受试者应答和结局更差。携带转录因子变异的受试者CCyR率更低（p=0.04），PFS更差（p=0.04）；携带抑癌基因变异的受试者PFS（p=0.03）、总生存（p=0.002）和CML相关生存（p=0.004）更差。在常见变异中，133例（66%）受试者基线携带ASXL1变异，涉及55种不同的蛋白改变变异，大多数为移码（n=29，53%）或无义（n=24；44%）变异，仅鉴定出2种错义变异；最常见变异为ASXL1^G646Wfs*12（n=44，22%）。鉴于ASXL1变异可能发生于白血病性克隆或克隆性造血区室，对 bulk 样本靶向DNA测序检出的这些变异应谨慎解读。研究人员采用最大选择log-rank统计量结合1000次bootstrap重采样探索ASXL1变异亚组的VAF阈值，从稳定截断区域选择ASXL1^{non-G646Wfs*12}约15%和ASXL1^G646Wfs*12约30%作为后续分析阈值。ASXL1^G646Wfs*12 VAF≥30%的受试者结局更差，PFS、总生存和CML相关生存显著较差；ASXL1^{non-G646Wfs*12} VAF≥15%也与较差结局相关，但预后影响不如ASXL1^G646Wfs*12显著。根据所选VAF阈值将受试者分为2个ASXL1风险组：低风险组（n=183，91%）包括ASXL1野生型、ASXL1^{non-G646Wfs*12}（无论VAF）和VAF<30%的ASXL1^G646Wfs*12；高风险组（n=19，9%）为VAF≥30%的ASXL1^G646Wfs*12。高风险组受试者应答和结局显著差于低风险组。此外，携带RUNX1变异的受试者CCyR（p=0.04）和MMR（p=0.02）显著更低；携带RUNX1（p=0.001）、GATA2（p=0.04）和PHF6（p=0.008）变异的受试者PFS显著更差；携带IKZF1（p=0.009）、SETBP1（p=0.01）和PBRM1（p=0.03）变异的受试者总生存更差；携带DNMT3A（p=0.04）、IKZF1（p=0.002）、STAT5A（p=0.04）、SETBP1（p=0.003）、TNFAIP3（p=0.02）和PBRM1（p=0.01）变异的受试者CML相关生存更差。携带复杂核型或额外Ph染色体的受试者细胞遗传学应答更低、结局更差。同时携带ASXL1^{non-G646Wfs*12}与SETBP1变异、或RUNX1与IKZF1变异的受试者结局更差。在Firth惩罚多变量Cox模型中，ASXL1高风险状态（ASXL1^G646Wfs*12 VAF≥30%）与较低的细胞遗传学和分子学应答显著相关；ASXL1^G646Wfs*12 VAF≥30%、RUNX1、PHF6和GATA2变异与较差的PFS相关；ASXL1^G646Wfs*12 VAF≥30%、SETBP1、TNFAIP3和PBRM1变异与较差的总生存相关；ASXL1^G646Wfs*12 VAF≥30%、DNMT3A、SETBP1、TNFAIP3和PBRM1变异与较差的CML相关生存相关。鉴于携带某些罕见变异（尤其是TNFAIP3和PBRM1）的受试者数量较少，且这些受试者常合并其他高影响共突变，这些关联应视为探索性而非独立的基因特异性预后效应。按功能分组纳入Firth惩罚多变量Cox模型时，转录因子变异与较差的PFS和CML相关生存显著相关；抑癌基因变异与较差的总生存和CML相关生存相关。交叉验证LASSO-Cox敏感性分析进一步证实了主要预后特征的稳健性。

治疗期间变异景观的动态变化：根据3G-TKI应答，将有合格随访样本的受试者分为应答组（n=49）和无应答组（n=62），后者包括原发耐药（n=50）和继发耐药（n=12）。治疗期间，应答组和原发耐药组携带ABL1变异的受试者比例显著降低（p<0.001和p=0.02），每例ABL1变异数也显著减少（均p<0.001）。应答组携带其他体细胞变异的受试者比例和每例其他体细胞变异数均显著降低（均p=0.001）；原发耐药组携带其他体细胞变异的受试者比例与基线相比无显著差异（p=0.36），但每例变异数甚至显著增加（p<0.001）。应答组治疗期间ASXL1变异显著减少（从67%降至22%；p<0.001），主要为ASXL1^{non-G646Wfs*12}（从55%降至22%，p=0.001）。原发耐药组其他体细胞变异无显著减少，Ph+ ACAs比例从20%增至46%（p=0.006）。对纵向非ABL1体细胞变异进行无监督聚类（排除持续无变异或极低负荷病例后，基于基线与随访样本间VAF动态变化），识别出4种具有临床信息价值的动态模式：模式1（聚类2）为基线和随访持续可检测且VAF无显著变化的持续变异克隆，最常见为ASXL1变异（尤其是ASXL1^G646Wfs*12），其次为RUNX1、STAT5A和PHF6变异，92%位于原发耐药组；模式2（聚类4）为治疗期间新出现或扩增的变异，最常见为ASXL1^G646Wfs*12、RUNX1和PHF6变异，84%位于原发耐药组；模式3（聚类3）为治疗期间优势变异克隆显著减少或完全清除，包括ASXL1、KDM6A和KMT2D，这些变异的中位VAF从基线41%（IQR 35–44%）降至1%（IQR 0–16%），62%位于原发耐药组；模式4（聚类5）为次要克隆中检出的变异减少或清除，最常见减少的为ASXL1^G646Wfs*12和ASXL1^E635Rfs*15变异，中位VAF从基线14%（IQR 7–18%）降至0%（IQR 0–0%），74%位于应答组。继发耐药组12例有连续高质量随访样本，治疗期间携带ABL1变异的受试者比例和每例ABL1变异数较基线均无显著降低；相反，应答丢失时非ABL1其他体细胞变异负荷增加，并出现新发变异，包括ASXL1、RUNX1、SETBP1和TP53，同时BCR::ABL1转录本增加。由于样本量有限，这些发现应谨慎解读。

基于GEPs的聚类与3G-TKI治疗较差应答和结局相关：研究人员利用与应答和结局相关的蛋白编码基因，开发了发现阶段的基于GEPs的转录组分类器。在55种机器学习方法中，根据bootstrap内部性能选择弹性网（Enet，alpha=0.2），产生40基因特征。基于40基因特征的共识聚类识别出3个稳定且生物学上不同的转录聚类，命名为GEPC1（n=42，28%）、GEPC2（n=86，58%）和GEPC3（n=21，14%），三者在CCyR（p<0.001）、MMR（p<0.001）、MR4（p=0.006）及PFS、总生存和CML相关生存（均p<0.001）方面存在显著差异。在Firth惩罚多变量Cox分析中，基于GEPs的聚类与应答和结局独立相关。此外，既往最佳应答<次要细胞遗传学应答（MCyR）、100% Ph+中期分裂相和缺乏ABL1变异也与较低应答相关，而高风险ACAs与较差PFS相关。交叉验证LASSO-Cox敏感性分析进一步支持这些主要预后特征的稳健性。基于bootstrap的内部时间依赖ROC分析表明，基于GEPs的聚类在临床或基因组协变量之外提供了额外预后信息，整合临床、基因组和转录组协变量时内部AUROC估计值最高。

GEPs聚类的独特分子特征：通路富集分析显示，GEPC1富集免疫激活和凋亡相关通路，如通过NF-κB的TNF-α信号、免疫应答正调控和程序性细胞死亡正调控；GEPC2富集基质主导特征，包括细胞外基质组织和胶原合成相关通路；GEPC3以增殖和细胞周期相关通路上调为标志。ssGSEA分析显示，GEPC1免疫激活特征显著较高，白血病干细胞（LSC）相关特征较低；GEPC3富集LSC相关通路且免疫相关特征受抑制；GEPC2为中间转录状态，LSC和免疫相关特征中度富集，基质/龛相关特征占主导。GSEA分析证实了这些模式。3个聚类的体细胞变异和Ph+ ACA谱相似，但GEPC3更常见ABL1^T315I变异，且每例其他体细胞变异数更多。

GEPs聚类的微环境景观：采用xCell算法进行细胞类型去卷积分析，GEPC1富集免疫细胞群，包括CD4阳性记忆T细胞、CD8阳性中央记忆T细胞（CD8+ Tcm）、调节性T细胞（Tregs）和自然杀伤（NK）细胞；GEPC3这些免疫细胞群的推断富集较低，但造血干细胞（HSCs）、共同髓系祖细胞（CMPs）、粒细胞-巨噬细胞祖细胞（GMPs）和巨核细胞-红细胞祖细胞（MEPs）等干/祖细胞的富集评分显著较高；GEPC2呈中间模式。

治疗期间的动态转录组重塑：130例受试者有配对基线和随访bulk RNA测序数据，包括63例应答者、62例原发耐药者和5例继发耐药者。ssGSEA分析显示，应答组治疗期间LSC特征显著下调，伴随凋亡增加和选择性免疫激活；原发耐药组LSC特征未降低，免疫特征动态变化有限，基质特征上调；5例继发耐药受试者的匹配转录组数据也描述性观察到类似的转录组重塑。研究人员还研究了GEPs聚类间的纵向转录组重塑：GEPC1显示LSC特征降低，凋亡增加和选择性免疫激活；GEPC2复合LSC评分稳定，但核心细胞周期特征下调，伴适度免疫激活和基质重塑减少；GEPC3尽管治疗中有一定下降，但仍保留相对较高的LSC特征，凋亡和免疫激活有限。纵向xCell分析显示，GEPC1免疫细胞特征增加、干/祖细胞特征降低；GEPC3持续免疫抑制和残余干/祖细胞富集；GEPC2呈中间变化。

讨论部分总结：研究人员整合基因组、转录组和纵向分析，识别了与3G-TKI应答和结局相关的特征，为预后异质性和个体化风险分层提供了见解。研究发现，既往TKI暴露增加与ABL1变异减少但非ABL1体细胞变异增多相关，提示后线治疗中从BCR::ABL1依赖性耐药向BCR::ABL1非依赖性克隆演化转变；纵向分析支持这一解释，耐药受试者中ABL1变异下降而持续存在、新出现或扩增的非ABL1克隆。这些发现支持在重度治疗CML中超越ABL1变异检测进行更广泛的分子风险评估。既往研究报道ASXL1、RUNX1和PHF6变异与接受伊马替尼和/或2G-TKIs的CML患者TKI耐药或疾病进展相关；本研究发现RUNX1、PHF6、IKZF1、SETBP1、TNFAIP3和/或PBRM1变异与3G-TKIs应答和结局显著相关，但由于其中某些基因（尤其是TNFAIP3和PBRM1）在CML中不常见，且某些非截短变异被注释为意义未明变异，这些关联应视为探索性，需独立的临床和功能验证。ASXL1编码一种在髓系恶性肿瘤中频繁改变的表观遗传调控因子，其在CML中的预后相关性仍有争议；本研究发现ASXL1^G646Wfs*12（尤其是VAF≥30%）与较差应答和结局相关，耐药或进展时ASXL1^G646Wfs*12频繁持续、新出现或扩增，支持变异和VAF依赖的3G-TKI耐药关联。然而，bulk测序无法区分BCR::ABL1阳性白血病细胞中的ASXL1变异与Ph阴性克隆性造血，因此ASXL1高风险状态应视为bulk测序衍生的预后特征，内部衍生的VAF阈值需独立外部验证。除基因组数据外，转录组分析为3G-TKI应答异质性提供了发现阶段框架；基于GEPs的聚类在同一队列中衍生和评估，尽管进行了bootstrap内部评估，仍需外部验证；高风险转录状态以增殖/干性增加和免疫抑制为特征，与3G-TKI耐药生物学一致。若经验证，高风险基因组或转录组特征可能有助于识别需要更密切细胞遗传学和分子学监测、适时早期移植评估以及考虑研究性方案（包括STAMP抑制剂、基于TKI的联合方案或临床试验）的受试者；3G-TKIs联合去甲基化药物可能具有协同抗白血病活性的证据为高风险表观遗传或转录因子相关变异受试者的此类联合提供了依据，但这些策略需前瞻性验证，并非基于本回顾性分析的治疗推荐。本探索性研究存在若干局限性：第一，队列包括2种不同的3G-TKIs，不能排除潜在药物特异性效应；第二，靶向DNA测序和bulk DNA/RNA分析限制了对结构异常和细胞分辨率的检测，初步RNA-seq融合筛查未纳入，因为非BCR::ABL1候选融合罕见、reads支持弱且未验证；此外，无法确定克隆性造血相关基因（如DNMT3A、TET2和ASXL1）中的变异是局限于BCR::ABL1阳性白血病细胞还是存在于Ph阴性造血克隆中；第三，结局事件有限和变异阳性亚组较小可能影响某些基因水平关联的稳定性，尽管采用了惩罚回归和敏感性分析，这些罕见变异发现应视为探索性和假设生成性，而非个体化临床决策的确定性预测因子；最后，基因组风险因素和基于GEPs的聚类未经外部验证，因此在独立、临床可比队列和功能研究确认前应视为探索性。研究结论翻译：总之，研究人员整合基因组和转录组数据，识别了与CML患者3G-TKI治疗应答和结局相关的分子决定因素。高负荷ASXL1^G646Wfs*12变异和基于GEPs的聚类成为与较差治疗获益相关的主要发现阶段特征。这些发现为分子风险分层提供了潜在框架，并为在高风险分子特征CML受试者中探索风险适应性治疗策略（如基于TKI的联合方案）提供了生物学依据，但在临床实施前需独立验证。