《Nature》：Human replisomes direct a dedicated leading-strand primase for fork restart
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前导链合成的中断会损害并停滞复制叉，因为前导链聚合酶Pol ε的DNA合成对于复制性CMG（CDC45–MCM–GINS）解旋酶实现最佳模板解旋至关重要。未能有效重启和/或保护停滞的复制叉是基因组不稳定的主要来源。停滞的复制叉可通过多种机制重启，包括在障碍物下
前导链合成的中断会损害并停滞复制叉，因为前导链聚合酶Pol ε的DNA合成对于复制性CMG（CDC45–MCM–GINS）解旋酶实现最佳模板解旋至关重要。未能有效重启和/或保护停滞的复制叉是基因组不稳定的主要来源。停滞的复制叉可通过多种机制重启，包括在障碍物下游进行再引发。在人类细胞中，引物酶-聚合酶PRIMPOL在复制胁迫期间促进复制叉行进，但其活性如何被复制体协调尚不清楚。本研究通过纯化的人类蛋白重构复制叉停滞与重启，证明CMG解旋酶引导PRIMPOL实现高效的复制叉重启。出乎意料的是，PRIMPOL与复制蛋白A（RPA）之间的相互作用在该系统中对复制叉重启并非关键。研究人员证明PRIMPOL直接结合CMG，冷冻电镜（cryo-EM）结构揭示了该相互作用如何将PRIMPOL特异性靶向前导链引物合成以最小化复制后间隙的大小。消除CMG–PRIMPOL相互作用可在体外废除复制叉重启，并在人类细胞中废除PRIMPOL依赖的DNA损伤耐受。该工作确立了PRIMPOL作为人类复制体中专门负责前导链引物合成的整合组分。
研究背景：DNA复制过程中，前导链合成的中断会导致复制叉停滞，这是因为前导链聚合酶Pol ε的DNA合成对于复制性CMG（CDC45–MCM–GINS）解旋酶实现最佳模板解旋至关重要。停滞复制叉的有效重启和保护失败是基因组不稳定的主要来源。停滞的复制叉可通过多种机制重启，包括在障碍物下游进行再引发。在人类细胞中，引物酶-聚合酶PRIMPOL（Primase and DNA-directed polymerase）在复制胁迫期间促进复制叉行进，但其活性如何被复制体协调尚不清楚。此前研究表明，PRIMPOL通过与被RPA（复制蛋白A）包被的单链DNA（ssDNA）直接相互作用被招募到复制叉，但由于RPA组成性结合于后随链模板，这种招募模式是否足以实现PRIMPOL在前导链上的高效引物合成，还是存在额外机制将PRIMPOL特异性引导至前导链模板以挽救停滞的复制叉，尚不明确。此外，从纯化的酿酒酵母蛋白重构的真核复制体无法在 leading-strand lesions 下游有效恢复合成，因为负责每个冈崎片段引物合成的Pol α–引物酶复合体被靶向后随链模板，这一靶向机制在人类复制体中保守，表明Pol α–引物酶在前导链上的低效引物合成是真核复制体的普遍特征。与酿酒酵母不同，人类具有额外的引物酶PRIMPOL，但其是否被特异性引导至前导链模板及其机制尚缺乏证据。
研究人员开展的研究：研究人员利用先前开发的从纯化蛋白组装快速高效人类复制体的系统，在含单个环丁烷嘧啶二聚体（CPD）前导链模板上重构了复制叉停滞与重启。研究发现PRIMPOL的加入减少了停滞复制叉群体并积累了全长产物，同时在变性凝胶中出现约6.2 kb的重启前导链产物。二维凝胶电泳证实这些产物为真正的重启产物。研究发现复制叉重启也发生在脱嘌呤位点（abasic site）聚合酶停滞后，且不依赖于Pol δ和Pol α–引物酶，仅需要Pol ε延伸PRIMPOL合成的引物。通过建立近单核苷酸分辨率的前导链引物定位策略，研究人员发现大多数PRIMPOL依赖性引物在CPD的50个核苷酸以内合成，表明PRIMPOL活性在聚合酶停滞后立即被靶向前导链模板，将子链间隙限制在<50个核苷酸。通过替换CPD下游162个核苷酸序列，研究人员发现DNA序列影响引物合成位点，但大多数重启产物仍在CPD的<50个核苷酸以内引发。出人意料的是，缺失两个RPA结合基序（RBMs）或RBM-A突变的PRIMPOL突变体与野生型PRIMPOL具有相当的复制叉重启效率，表明RBM介导的PRIMPOL–RPA相互作用在重构系统中对复制叉重启非必需。Pull-down实验表明PRIMPOL与CMG特异性相互作用。研究人员通过单颗粒冷冻电镜（cryo-EM）解析了PRIMPOL与CMG结合的结构（3.5 ?分辨率），揭示了PRIMPOL N端21个氨基酸的α螺旋结合MCM7，以及紧随其后的约20个氨基酸环夹在MCM4浅槽和PRIMPOL AEP结构域之间。PRIMPOL AEP结构域位于MCM中央孔出口侧方，其催化核心定向为支持模板DNA从CMG直接进料进行引物合成。研究人员通过去除PRIMPOL前39个氨基酸（PRIMPOL?1–39）消除了CMG–PRIMPOL相互作用，发现该突变体保留了ssDNA引物酶活性但无法促进复制叉重启，表明CMG–PRIMPOL相互作用对前导链再引发至关重要。进一步突变分析表明，PRIMPOL与MCM4和MCM7的精确定位对高效前导链重启是必需的。在低PRIMPOL浓度下，RBM介导的PRIMPOL–RPA相互作用对复制叉重启变得重要，表明RBM功能在于提高PRIMPOL在复制叉处的局部浓度。利用PRIMPOL缺失使PCNA K164R（pcnaK164R）TK6淋巴母细胞对顺铂敏感的细胞模型，研究人员发现表达PRIMPOL?1–39无法补救pcnaK164R细胞对顺铂的额外敏感性，表明CMG–PRIMPOL相互作用对PRIMPOL介导的DNA损伤耐受在人类细胞中具有重要性。
主要关键技术方法：研究人员采用了纯化蛋白重构的人类复制体系统，在含单个CPD或脱嘌呤位点的9.7 kb分叉DNA模板上进行复制叉停滞与重启实验，结合碱性琼脂糖凝胶电泳、天然琼脂糖凝胶电泳、二维凝胶电泳和尿素-聚丙烯酰胺测序凝胶进行产物分析；利用单颗粒冷冻电镜（cryo-EM）解析了PRIMPOL–CMG复合物结构（3.5 ?）；通过Pull-down assay和Western blotting验证蛋白相互作用；使用CRISPR–Cas9构建PRIMPOL敲除的pcnaK164R TK6细胞系进行顺铂敏感性克隆存活实验。样本队列来源为TK6人类淋巴母细胞系。
研究结果：
重构人类复制叉重启：研究人员在含前导链CPD的模板上重构了复制叉停滞与重启，发现PRIMPOL通过前导链再引发促进复制叉重启。二维凝胶电泳证实6.2 kb产物为真正的重启产物，且引物酶缺陷型PRIMPOL突变体（ZnFD2A）仅产生停滞前导链和冈崎片段。复制叉重启也发生在脱嘌呤位点，且独立于Pol δ和Pol α–引物酶。ATP足以启动引物合成，锰离子不增强重启效率。
PRIMPOL产生小的ssDNA间隙：通过近单核苷酸分辨率定位引物合成位点，研究人员发现大多数PRIMPOL依赖性引物在CPD的50个核苷酸以内合成，表明PRIMPOL活性被靶向前导链模板，将子链间隙限制在<50个核苷酸。
DNA序列影响引物合成位点：替换CPD下游162个核苷酸序列后，重启产物模式发生改变，表明PRIMPOL在前导链上的再引发受DNA序列调控，但大多数重启产物仍在CPD的<50个核苷酸以内引发。
PRIMPOL RBMs在体外非必需：缺失RBMs或RBM-A突变的PRIMPOL突变体与野生型具有相当的复制叉重启效率和相同的引物合成位点模式，表明RBM介导的PRIMPOL–RPA相互作用在重构系统中对复制叉重启非必需。
PRIMPOL直接结合CMG：Pull-down实验表明PRIMPOL与CMG特异性相互作用，提示PRIMPOL可能通过与核心复制体相互作用被引导至停滞复制叉。
PRIMPOL–CMG冷冻电镜结构：cryo-EM结构揭示了PRIMPOL N端α螺旋结合MCM7、下游环夹在MCM4和AEP结构域之间，AEP结构域位于MCM中央孔出口侧方，催化核心定向为支持模板DNA从CMG直接进料进行引物合成。
CMG–PRIMPOL相互作用对复制叉重启至关重要：PRIMPOL?1–39消除了CMG结合但保留引物酶活性，无法促进复制叉重启。去除N端α螺旋（PRIMPOL?1–21）导致重启适度降低，对最靠近CPD的引发事件影响尤为显著。替换环区（PRIMPOLGS22–39）或环区六残基突变为丙氨酸（PRIMPOL6A loop）导致重启产物完全丧失。靶向MCM4界面的三个环残基（PRIMPOL3A loop）缺陷较靶向Tyr28和Arg29（PRIMPOL2A loop）轻，表明PRIMPOL在MCM C-tier旁的刚性定位对高效前导链重启是必需的。
RBMs在低PRIMPOL水平下辅助重启：在低PRIMPOL浓度下，PRIMPOLΔRBM的重启效率显著低于野生型，表明RBM介导的PRIMPOL–RPA相互作用促进PRIMPOL在复制叉处的定位。
PRIMPOL–CMG相互作用促进顺铂耐受：表达PRIMPOL?1–39无法补救pcnaK164R细胞对顺铂的额外敏感性，而野生型PRIMPOL可完全补救，表明CMG–PRIMPOL相互作用对PRIMPOL介导的DNA损伤耐受在人类细胞中具有重要性。
讨论部分总结：研究人员提出了PRIMPOL介导再引发的模型。生化重构证明PRIMPOL RBMs在体外对前导链再引发非必需，但在低PRIMPOL浓度下变得重要，细胞研究证据表明RBM-A对PRIMPOL招募至染色质和复制胁迫期间的复制叉行进是必需的。研究人员提出PRIMPOL与RPA的相互作用（低亲和力、可能瞬时）主要服务于将PRIMPOL定位到活跃复制的基因组位点，这可能是因为PRIMPOL在人类细胞中丰度相对较低。CMG–PRIMPOL相互作用通过MCM4和MCM7确保再引发与CMG行进紧密耦合，限制留给复制后修复途径的ssDNA间隙大小。PRIMPOL招募的两阶段模型（涉及RPA和CMG相互作用）类似于TLS聚合酶招募至复制叉的机制。此外，PRIMPOL活性受检查点和细胞周期激酶调控，表明过度再引发和子链间隙形成是有害的。PRIMPOL由CMG引导至前导链可能导致其通过竞争新生前导链干扰Pol ε，添加PRIMPOL轻度减缓未损伤模板上的复制叉行进，且该效应在省略CTF18-RFC时加剧，该抑制依赖于PRIMPOL与CMG的相互作用但不依赖于引物酶活性。PRIMPOL的广泛系统发育分布及其CMG相互作用基序的保守性表明存在通过再引发保持复制叉行进的进化压力，也表明在缺乏慢性复制胁迫时，再引发可能是复制体对前导链合成障碍的默认响应。这意味着人类细胞中前导链合成可能比以前认为的更加不连续。多种途径协同保护和重启停滞复制叉，决定再引发与其他复制叉加工途径（如复制叉逆转）之间平衡的因素是未来研究的重要领域。
研究结论翻译：本研究通过纯化的人类蛋白重构复制叉停滞与重启，证明CMG解旋酶引导PRIMPOL实现高效的复制叉重启。PRIMPOL直接结合CMG，冷冻电镜结构揭示了该相互作用如何将PRIMPOL特异性靶向前导链引物合成以最小化复制后间隙的大小。消除CMG–PRIMPOL相互作用可在体外废除复制叉重启，并在人类细胞中废除PRIMPOL依赖的DNA损伤耐受。该工作确立了PRIMPOL作为人类复制体中专门负责前导链引物合成的整合组分，建立了人类复制体中的分工：Pol α–引物酶作用于后随链，而PRIMPOL作用于前导链。
