《Nature Cancer》：A single-cell lung cancer atlas reveals cellular and molecular drivers of metastasis and clinical outcome
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非小细胞肺癌（NSCLC）仍是癌症相关死亡的主要原因，其特征为广泛的细胞和分子异质性。为捕捉这一复杂性，研究人员呈现了LuCaS+，一个多中心单细胞RNA测序图谱，包含来自454例具有长期随访和完整临床注释的NSCLC患者的超过250万个细胞核。LuCaS+由
非小细胞肺癌（NSCLC）仍是癌症相关死亡的主要原因，其特征为广泛的细胞和分子异质性。为捕捉这一复杂性，研究人员呈现了LuCaS+，一个多中心单细胞RNA测序图谱，包含来自454例具有长期随访和完整临床注释的NSCLC患者的超过250万个细胞核。LuCaS+由发现数据集（柏林和科隆，364例患者）和一个独立验证数据集（慕尼黑，90例患者）组成。利用该数据集，研究人员鉴定了具有高转移潜能的肿瘤亚群，这些亚群与致癌信号传导、免疫逃逸和上皮–间充质转化（EMT）相关。在早期腺癌（肺腺癌）中，这些细胞显示出强大的预后价值。整合肿瘤和微环境细胞图谱改善了所有分期的生存预测，识别出不同的肿瘤–免疫–基质相互作用模式。这些模式包括单核细胞和成纤维细胞驱动的炎症（肺腺癌）、VEGF–TGFβ介导的血管生成反馈环路（肺鳞状细胞癌）以及促进抗肿瘤免疫的免疫允许性生态位。LuCaS+提供了一个具有临床锚定的单细胞资源，可用于NSCLC的个性化、生物学驱动的治疗。
**研究背景**
非小细胞肺癌（non-small-cell lung cancer，NSCLC）仍然是癌症相关死亡的主要原因之一，其显著特征在于广泛的细胞和分子异质性。近年来，癌症生物学研究进展强调了细胞层面机制（如瘤内异质性和肿瘤微环境（tumor microenvironment，TME））在驱动肿瘤进展和转移中的关键作用。尽管单细胞方法被认为是癌症研究的变革性工具，但其向临床实践的转化仍然有限，主要原因是缺乏具有完整临床数据的大型整合性患者数据集。克服这一局限性有望改变研究人员对疾病机制的理解、识别潜在药物靶点并指导治疗决策。单细胞技术的进步使得更深入的转录组分析、多重样本处理以及对福尔马林固定石蜡包埋（formalin-fixed paraffin-embedded，FFPE）组织应用单核RNA测序（single-nucleus RNA sequencing，snRNAseq）成为可能。与新鲜组织不同，FFPE样本能够回顾性获取独特且特征明确的患者队列。
**研究概述与结论**
研究人员利用上述技术进展构建了单细胞肺癌图谱LuCaS+（single-cell Lung Cancer Atlas），作为一个转化性癌症研究资源，包含来自三家德国大学医院治疗的454例NSCLC患者的snRNAseq图谱和临床数据。来自柏林和科隆大学医院的364例患者样本构成LuCaS+的发现数据集，来自慕尼黑的90例患者独立队列单独处理用于验证。LuCaS+涵盖超过250万个细胞核和75亿条转录本，提供了NSCLC转录组景观的全面单细胞分辨率图谱，将肿瘤生物学和微环境见解与详细临床特征相结合。研究人员通过以下方式展示了该大规模数据集的潜力：首先研究了分子单癌细胞特征与其转移潜能之间的关系（single cell metastatic potential，scMP）；其次证明整合癌细胞转录谱与基质和免疫细胞数据可改善所有临床分期的生存预测，并在现行临床标准之外增强预后分层。研究人员利用留出验证数据集验证了结果，并使用空间转录组学（spatial transcriptomics，ST）在组织背景中定位了关键结果。研究结果表明，将单细胞分辨率转录组学与临床结局相关联具有强大效力，使转化研究人员能够研究疾病机制、在临床相关背景中验证发现，并推动NSCLC治疗的进步。
**关键技术方法**
研究人员采用的主要关键技术方法包括：对FFPE组织进行snRNAseq（发现队列364例来自柏林和科隆，验证队列90例来自慕尼黑），结合对比学习（contrastive learning）进行降维和层次聚类以定义细胞簇；利用拷贝数变异推断、增殖评估和恶性评分流程区分恶性与非恶性上皮细胞；通过逻辑回归模型计算单细胞转移潜能（scMP）评分；应用弹性网络Cox（elastic net Cox）模型整合细胞簇比例与临床分期进行生存预测；使用CellChat推断配体–受体相互作用；采用Xenium In Situ平台对35例发现队列样本进行空间转录组学验证；并对配对原发肿瘤和脑转移瘤进行分析，同时在外部数据集（Tagore等）中进行验证。
**研究结果**
**NSCLC单核图谱**
研究共分析454例患者，分为发现队列（364例）和独立验证队列（90例）。经过严格质量控制，数据未显示机构来源、FFPE蜡块保存时间或其他技术因素的明显分离。研究人员利用基于对比学习的低维嵌入和随后的层次聚类鉴定了500个细胞簇。通过综合标记基因、拷贝数变异推断、增殖评估和恶性评分的工作流程，将136个簇（691,173个细胞；34.4%）鉴定为恶性。286个簇（1,103,572个细胞；54.9%）鉴定为非恶性；78个簇（214,280个细胞；10.7%）因显示混合表型被排除。非恶性细胞进一步细分为60种不同细胞类型，包括33种免疫细胞、11种基质细胞、9种血管细胞和7种正常上皮细胞类型。大多数恶性簇以相似比例包含肺腺癌（lung adenocarcinoma，LUAD）和肺鳞状细胞癌（lung squamous cell carcinoma，LUSC）细胞，表明跨组织学类型的转录相似性，但经典亚型标记仍清晰差异表达，线性分类器区分LUAD和LUSC肿瘤细胞的AUROC达0.979。通路分析显示肿瘤细胞簇具有从生长促进到应激反应和抗凋亡的不同激活模式。在非恶性细胞方面，研究人员基于Cords等人分类对癌症相关成纤维细胞（cancer-associated fibroblasts，CAFs）进行亚型划分，并定义了额外的结构型CAFs亚型；巨噬细胞被细分为八个簇，反映了极化谱系而非传统M1/M2二分法。LUAD和LUSC在非恶性细胞类型组成上存在显著差异。
**癌细胞簇具有独特转移潜能**
基于LuCaS+的综合临床病理注释，研究人员探究了转录定义的肿瘤细胞亚克隆如何贡献于转移形成。研究人员假设已发生区域淋巴结或远处器官转移的患者原发肿瘤含有与转移形成相关的转录亚克隆，因此应用逻辑回归基于各细胞簇比例建模转移的存在，并校正肿瘤大小。每个癌细胞簇被赋予"单细胞转移潜能"（scMP）评分，定义为其在所有簇中回归系数的百分位排名。Bootstrap分析确认了scMP评分在重采样下的稳健性。跨患者比较显示scMP存在显著的瘤间变异性。scMP与肿瘤分期相关（LUAD：Spearman's ρ=0.16，P<1×10?1?；LUSC：ρ=0.16，P<1×10?1?）。
**与伪时间和scMP空间分布的相关性**
扩散伪时间（diffusion pseudotime，DPT）分析显示，沿伪时间轨迹远离正常上皮细胞的进展与平均scMP水平升高显著相关（LUAD：ρ=0.72，P<0.001；LUSC：ρ=0.72，P<0.001）。按肿瘤分期分层后，scMP与伪时间的相关性在LUAD中平均为0.71–0.76，在LUSC中为0.47–0.74。为评估肿瘤内空间组织，研究人员将scMP评分转移至匹配的ST数据集。在LUAD中，实性生长等高grade形态区域显示显著高于腺泡生长等低/中grade形态区域的scMP评分（加权平均值：53.1 vs 40；P=1.1×10?2?），与组织病理学分级系统一致。在LUSC中，靠近基质界面的基底细胞层显示低scMP值（加权平均44.9），向心尖肿瘤区域增高（加权平均72.7；P=4.0×10?23），尤其在向坏死过渡的区域。
**scMP特征的分子基础**
研究人员检查了按scMP评分分层的癌细胞簇的转录谱。高scMP的肿瘤细胞簇显示关键致癌信号通路的激活，包括MAPK（R=0.58，P=9.3×10?1?）、TGFβ（R=0.54，P=1.6×10?11）、缺氧（R=0.49，P=9.2×10?1?）和PI3K（R=0.48，P=3.0×10??）。相反，scMP与TRAIL通路活性呈负相关（R=?0.46，P=1.2×10??），表明高scMP肿瘤细胞簇中促凋亡信号丧失。研究人员通过对转录因子（transcription factor，TF）活性进行k-means聚类将癌细胞簇分配至五种转移指纹（metastatic fingerprint，mFP），平均scMP从mFP 1到mFP 5递减。mFP 1（"致癌信号、EMT"）以MYC、JUN和p53等关键TF激活为特征，与LUAD中Ki-67表达（R=0.36，P=7.1×10??）和TP53突变状态（P=1.5×10??）相关，NFκB和STAT1上调提示免疫逃逸，CellChat揭示该指纹内肿瘤细胞簇通过PD-L1/PD-1轴与细胞毒性T细胞显示最强相互作用，并呈现EMT高表型。mFP 2（"致癌信号、应激反应"）与mFP 1相似但显示雄激素受体（androgen receptor，AR）激活、ATF6和YBX3上调。mFP 3（"细胞周期激活"）显示以E2F1、E2F4和MYC强激活为标志的增殖中心表型。mFP 4（"低增殖和炎症"）显示HNF1A和SOX17高活性，关键炎症反应和增殖标记被强烈抑制。mFP 5（"肺细胞样"）以NKX2-1等高活性为特征，代表高分化转录表型。
**配对原发肿瘤和脑转移中的scMP**
研究人员分析了四对配对原发肺肿瘤及其相应脑转移瘤。所有脑转移瘤显示高scMP指纹mFP 1比例更高（P=0.027），高分化mFP 5簇相对耗竭（边缘显著性P=0.076）。在外部数据集（11例原发LUAD和31例脑转移瘤）中验证，转移瘤中scMP评分显著高于原发肿瘤（平均scMP：43.4 vs 17.4，P<1×10?1?）。
**scMP预测LUAD患者肿瘤复发和生存**
研究人员将"患者转移潜能"（patient metastatic potential，PMP）定义为每个肿瘤中前三个最高scMP值的平均值。按UICC分期分层，PMP在UICC I期肿瘤中强烈预测复发（C-index 0.64，P=0.006）和总生存（C-index 0.63，P=0.004）。在独立验证队列（26例UICC I期LUAD患者）中，PMP对复发（C-index 0.93，P<0.001）和总生存（C-index 0.74，P=0.0019）显示强预测力。研究人员提出PMP阈值分层为低风险组（low-risk group，LRG）和高风险组（high-risk group，HRG）。LRG在发现队列和验证队列中5年无复发生存率分别为79%和74%，HRG分别为55%和19%。在发现队列中，HRG患者复发风险比为2.85（P=0.017），死亡风险比为2.5（P=0.01）。验证队列确认了这些发现。在较小的LUSC队列中，PMP预测在发现队列I期患者中对总生存显示显著分层（C-index 0.66，P=0.03），但对复发未达显著（C-index 0.55，P=0.57），验证队列未达显著。
**肺癌单细胞景观揭示癌细胞与基质细胞之间临床相关相互作用**
研究人员对发现数据集应用交叉验证弹性网络Cox建模，以估计单细胞群体分布如何影响患者预后，仅聚焦于未接受辅助治疗的患者。在LUAD中，分子模型显示强生存预测力（C-index 0.70），加入UICC分期的完整模型进一步提升（C-index 0.727），显著优于单独UICC分期（C-index 0.650；P=0.005），且优于包含UICC分期、ECOG体能状态和吸烟史的扩展临床基线模型。基于完整模型风险再分层定义了四个风险分层（FM1–4），FM1和FM2患者5年生存率分别为93.3%和70.1%，FM3和FM4分别为30.8%和0.0%。再分层在常规UICC分期极端值处影响最强。在UICC I期肿瘤中，分子模型识别出25.3%（20/79）患者被重新分配至FM3和FM4，5年生存率仅35.0%；在UICC IV期患者中，5/20被重新分层至FM1–2，5年生存率达80%，而FM3–4患者仅8%。这些患者未检测到可靶向致癌变异。独立验证队列（n=47）预测总生存C-index为0.678，显著优于UICC分期（C-index=0.576；P=0.043）。在LUSC中，分子模型C-index为0.728，整合UICC分期后提升至0.757（P=0.07），验证队列中完整模型C-index显著高于UICC分期（0.64 vs 0.55，P=0.043）。
**功能性TME相互作用的可解释性与空间相关性**
利用完整模型系数，研究人员量化了每个肿瘤和微环境细胞簇对总生存预测的贡献，发现炎症细胞（如细胞毒性T细胞）高水平通常与良好预后相关，而血管化增加提示较差临床结局。研究人员进一步定义了由 distinct 转录信号通路活性结合特定TME背景定义的预后信息表型，通过CellChat推断配体–受体相互作用，并在35例样本的ST数据中验证。在LUAD中，识别出五种预后不良表型：（1）TP53缺陷型：p53通路活性降低、MAPK信号升高、TP53突变边缘富集（60% vs 46%；P=0.004）、肿瘤突变负荷更高（22.2 vs 15.43；P=3.2×10??），肥大细胞和细胞毒性T细胞减少提示免疫荒漠微环境，ST分析证实TP53通路活性标记表达降低（P=9.5×10??）和细胞毒性T细胞密度降低（P=0.018）。（2）单核细胞–炎症型：肿瘤细胞与经典和非经典单核细胞及炎症高CAFs相关，CellChat提示肿瘤细胞和炎症高CAFs通过CSF和CXCL招募单核细胞、单核细胞来源IL1激活肿瘤细胞NFκB通路以及炎症高CAFs分泌FGF，ST分析证实FGF靶基因表达显著富集（P=9.9×10??）及单核细胞（P=0.006）和炎症高CAFs（P=0.023）富集。（3）WNT激活型：WNT和TRAIL通路显著激活，肥大细胞和细胞毒性T细胞减少提示免疫荒漠微环境，ST证实肥大细胞浸润显著减少（P=0.009）。（4）血管生成型：缺氧相关通路活性增高，与尖端样内皮细胞、循环周细胞和周细胞相关，ST分析显示循环周细胞显著富集（P=0.023）。（5）TNF激活型：TNF通路活性高，与中性粒细胞浸润相关（R=0.37，P=9.1×10?1?），ST证实中性粒细胞富集（P=0.009）和TNF下游靶基因显著上调（P=0.007）。相反，识别出两种预后良好表型：（1）免疫允许性–髓系型：肿瘤细胞高表达免疫和抗原呈递相关基因（CXCL17、C3、C2和LAMP3），与MARCO高LAMP2高巨噬细胞和肥大细胞相关，ST证实肥大细胞（P=0.044）和MARCO高LAMP2高巨噬细胞（P=0.023）显著富集。（2）免疫允许性–淋巴系型：以多种T细胞亚群丰富为特征，CellChat提示通过肿瘤来源CXCL16和IL2信号招募T细胞，ST显示CXCL16表达升高（P=0.011）及耗竭细胞毒性T细胞（P=0.029）和循环辅助性T细胞（P=0.023）密度增加。在LUSC中，预后不良表型主要为"血管生成、TGFβ激活型"，snRNAseq显示强TGFβ通路活性并与多种新生血管化细胞类型相关，同时伴有基质CAFs和SPP1高巨噬细胞富集，CellChat支持VEGF驱动的内皮激活由这些基质成分介导，并提示循环周细胞向肿瘤细胞的TGFβ信号以及CSF1介导的SPP1高巨噬细胞招募，形成自我强化的血管生成生态位。ST数据证实尖端样内皮细胞（P=0.017）和循环周细胞（P=0.017）富集，血管衬里表达TGFβ配体和受体，相邻肿瘤区域TGFβ配体表达升高（P=0.009），空间邻域分析证实SPP1高巨噬细胞在周细胞（P=0.023）、循环周细胞（P=0.014）和尖端样内皮细胞（P=0.001）附近显著富集。
**讨论与结论**
本研究呈现了LuCaS+，一个多中心snRNAseq图谱，涵盖454例肺癌患者的超过250万个细胞及广泛临床随访，使研究人员能够将临床患者特征与单细胞水平肿瘤特征相关联。利用该资源，研究人员鉴定了具有不同转移潜能的肿瘤细胞簇（scMP评分），scMP沿关键致癌信号通路（如MAPK和TGFβ）激活、EMT增强和免疫逃逸为特征的转录梯度升高，并与不良预后相关。UICC I期LUAD患者的肿瘤复发强烈依赖于高scMP肿瘤细胞的存在，这些细胞虽尚未临床可检测为转移，但具有驱动后续疾病复发的潜能。scMP分层在LUSC中效果较差，可能由于样本量有限或缺乏仅显示低scMP、上皮维持/肺细胞样分子指纹的患者。作为第二个应用，研究人员整合恶性和非恶性细胞预测所有临床分期的生存。在LUAD中，观察到与临床结局相关的多种肿瘤–微环境表型，为联合免疫检查点抑制剂与靶向治疗提供了理论依据。在LUSC中，不良生态位以高血管化、基质CAF丰富微环境中的TGFβ激活为特征，靶向TGFβ信号可能恢复局部免疫反应并增强免疫检查点抑制剂疗效。对于临床转化，跨站点泛化至关重要，该模型利用比对工具整合了跨中心的单细胞信息，为前瞻性试验测试单细胞信息指导的辅助治疗提供了强有力的理论依据。LuCaS+可作为转化性癌症研究的宝贵平台，促进临床相关转录组亚型和分子驱动因素的发现，将高分辨率肿瘤生物学与真实世界临床终点相桥接，为更精准有效的肺癌诊疗铺平道路。
