《Nature Cell Biology》：Mapping mammalian placental formation and implantation transitions with single-cell transcriptomics and live imaging
编辑推荐：
胚胎着床（implantation）仍是哺乳动物发育过程中最难研究的阶段。因此，尽管该时期是大多数妊娠失败发生的窗口，科研人员对胚胎如何协调细胞状态转变以建立体轴蓝图并启动胎盘形成的认识仍极为有限。本研究结合单细胞转录组学（single-cell transc
胚胎着床（implantation）仍是哺乳动物发育过程中最难研究的阶段。因此，尽管该时期是大多数妊娠失败发生的窗口，科研人员对胚胎如何协调细胞状态转变以建立体轴蓝图并启动胎盘形成的认识仍极为有限。本研究结合单细胞转录组学（single-cell transcriptomics）、活细胞成像（live imaging）与功能实验，在细胞分辨率水平定义了上述转变过程。研究结果识别出胚胎谱系中连接naive与primed多能性状态的中间态，追踪了前后轴（anterior–posterior axis）特化在胚外内胚层（extraembryonic endoderm）中的起源，并揭示滋养外胚层（trophectoderm）分叉为不同胎盘祖细胞群。值得注意的是，研究发现胎盘起源于两个来源：经典公认的极滋养外胚层（polar trophectoderm）以及一个此前未被识别的壁滋养外胚层（mural trophectoderm）群体，后者从极-壁边界迁移而来。人壁滋养外胚层表现出类似的区域特异性行为，并可能包含偏向侵袭性滋养层（invasive trophoblast）的祖细胞。上述发现为改进干细胞来源的胚胎模型以及揭示妊娠成功的早期决定因素开辟了新方向。
**研究背景与科学问题**
哺乳动物胚胎着床是发育生物学中研究最为薄弱的环节之一。由于胚胎一旦埋入子宫组织便难以在体内直接观察和操作，加之小鼠着床转变在一夜之间迅速完成，研究人员长期以来缺乏对这一过程的连续、高分辨率分子图谱。这一知识空白具有重要的临床意义，因为大多数妊娠失败恰恰发生在此窗口期。近年来，干细胞来源的胚胎模型（如blastoids和着床后胚胎模型）虽能重现着床前或着床后发育的诸多方面，但普遍无法跨越着床前后的关键转变——blastoids无法成功着床并推进至着床后阶段，着床后模型则缺乏功能性胎盘。因此，亟需在体内以高时间分辨率捕获着床期细胞状态转变和谱系轨迹，以理解胚胎与胚外组织如何协调重塑并生成持续发育所需结构。
**研究内容与结论**
针对上述问题，研究人员采集了覆盖着床前（E3.5、E4.5）、围着床期（E4.75）和着床后早期（E5.0、E5.25、E5.5）六个精确分期时间点的小鼠胚胎，利用单细胞RNA测序（scRNA-seq）对超过22,000个细胞进行了转录组 profiling，构建了着床期发育的连续高分辨率转录组图谱，识别出跨越三个主要谱系的15种胚胎及胚外细胞类型。研究进一步通过整合分析、免疫荧光、杂交链式反应（HCR）、活细胞成像、谱系追踪和功能去除实验，得出以下核心结论：鉴定出E4.75为连接naive与formative多能性的离散中间态，Wt1为该状态的标志物并可能参与调控； refined了远端内脏内胚层（DVE）特化时间至E5.0–E5.25，早于此前报道；最出人意料的发现是壁滋养外胚层（mural TE）中一群边界壁TE细胞在围着床期向近端迁移并贡献至外胎盘锥（EPC）形成，打破了EPC仅来源于极TE衍生ExE的传统观点；早期EPC即表现出由壁TE和极TE双来源导致的异质性；人胚胎壁TE表现类似的区域特异性行为并可能存在CDH5?ASCL2?胎盘祖细胞。这些发现修正了多能性进展和胎盘起源的经典模型，为改进干细胞来源胚胎模型和揭示妊娠成功早期决定因素提供了机制框架。
**关键技术方法**
研究人员采用的核心技术方法包括：高时间分辨率单细胞RNA测序（scRNA-seq）对六个分期小鼠胚胎进行转录组图谱构建（样本来源于体内自然发育胚胎，E3.5–E5.5，n=60、39、49、27、37枚胚胎）；活细胞成像与细胞追踪（利用H2b–GFP;mTmG和mTmG;Cdx2GFP转基因小鼠系及人胚胎SPY-555-actin/SiR-DNA染色）；谱系追踪实验（DiI染料和TAT-CRE重组酶 blastocoel微注射结合胚胎移植）；全胚组织透明化与光片/共聚焦成像；杂交链式反应（HCR）原位检测；以及功能去除实验（手动去除壁TE后体外培养和胚胎移植）。此外还整合了已发表的scRNA-seq、空间转录组和干细胞模型数据集进行投影比较分析。
**研究结果**
*胚胎着床的分期单细胞路线图*：通过对E3.5至E5.5六个时间点超过22,000个细胞的scRNA-seq分析，构建了连续转录组图谱，识别出15种细胞类型，包括ICM、着床前和着床后EPI、PaE、VE、ExVE、EmVE、DVE、壁TE、极TE、p-TGC、ExE和EPC等，覆盖了围着床期三个主要谱系的早期多样化过程。
*Wt1标记naive与primed多能性之间的 poised 状态*：通过将E3.5–E5.5 ICM/EPI数据与已发表E6.5–E8.5数据集整合，发现E4.75形成离散的中间聚类而非渐进过渡，且现有体外干细胞模型不能完全捕获该状态。鉴定Wt1为E4.75特异性瞬时表达标志物，SCENIC分析显示其调控子活性在该阶段达峰。Wt1敲除胚胎在E5.25–E5.5表现前羊膜腔形成缺陷，提示Wt1参与EPI腔化过程。
*围着床期前后体轴的出现*：PAGA分析显示PE在E4.5已分化为PaE和VE，VE在E4.75–E5.0进一步分离为ExVE和EmVE，早于此前认为的E5.25–E5.5。DVE转录特征在E5.0即可检测，HCR证实Cer1和Lefty1共表达在E5.0–E5.25出现于1–3个DVE细胞，表明DVE特化早于E5.5的单侧迁移。
*壁TE与胎盘祖细胞共享分子特征*：扩散图分析显示E4.5时壁TE和极TE转录相似，至E4.75明显分叉，极TE与ExE对齐，壁TE则靠近p-TGC和EPC状态。壁TE表达Gata2、Krt19和Cdh5等p-TGC/EPC富集标志物。免疫荧光证实CDH5?细胞在E4.75出现于约8个靠近极-壁边界的壁TE细胞，至E5.25出现CDH5?ASCL2? EPC细胞。
*边界壁TE贡献于胎盘祖细胞*：活细胞成像追踪到E4.75边界壁TE细胞在极TE内陷形成ExE过程中向近端迁移（每胚胎约2–4个）。HCR显示Ascl2?细胞在E4.5已存在于边界壁TE，至E5.0迁移至胚胎顶部，E5.5标记发育中的EPC。DiI和TAT-CRE谱系追踪证实壁TE来源细胞贡献至EPC（约占10–30%）和p-TGC，且在移植后100小时仍可检测于EPC外周区域。
*壁TE对EPC发育不可或缺*：去除壁TE的E4.5胚胎体外培养后57%形成圆柱结构但无一形成EPC；移植后仅2%进展至着床后发育，回收胚胎中多数缺乏EPC。表明壁TE既是EPC的直接贡献者也是其正常形成的必要条件。
*围着床期双TE谱系导致早期EPC异质性*：整合E7.5–E8.5滋养层图谱发现EPC分为两个群体——与壁TE聚类的mEPC（表达Cdh5、Plac8）和与ExE聚类的pEPC（表达Cdx2、Sox2）。拟时序分析支持ExE→pEPC和壁TE→mEPC两条轨迹。空间转录组数据证实Cdh5富集于EPC外周区域。
*边界壁TE身份在于宫界面形成*：全胚透明化成像显示GD4时一圈mT?CDH5?边界壁TE细胞对接于CDH5?子宫内膜，而远端壁TE尚未接触子宫壁且不表达CDH5。至GD5这些细胞向近端迁移，GD5.25到达EPC近端区域，此时EPC已包含CDH5?CDX2?和CDH5?CDX2^low两个空间分布不同的群体。
*人围着床期壁TE的行为*：活细胞成像显示7 dpf人胚胎中约40%被追踪壁TE细胞向EPI方向迁移。免疫染色发现7–9 dpf间1–2个靠近ICM的TE细胞开始表达CDH5和ASCL2。已发表scRNA-seq数据中9 dpf起可检测CDH5?ASCL2?细胞（原注释为EVT），第二 trimester基底板空间转录组中EVT祖细胞表达CDH5和ASCL2。
**讨论与结论**
讨论部分指出，本研究通过结合高分辨率单细胞转录组学、活胚胎成像和功能实验，提供了小鼠围着床期发育的连续分期分子路线图，将E4.75鉴定为协调多能性转变与早期胎盘谱系特化的中心节点。研究提出Wt1不仅是E4.75多能性状态的标志物，还可能是该转变调控网络的组成部分，其缺陷影响EPI腔化形成。DVE特化时间的 refined 支持前后轴建立的渐进模型，即早期分子不对称性预模式化后续AP patterning。最关键的修正是关于EPC起源的认识：边界壁TE细胞在E4.75前后向近端迁移并贡献至EPC，这些细胞在迁移前已表达Ascl2。研究人员提出E4.75锥形胚胎与V形子宫腔形成的几何独特界面可能使边界壁TE最早接触子宫内膜，CDH5（VE-Cadherin）的表达提示其可能获得迁移或内皮样特性。壁TE去除实验证明其对EPC形成不可或缺，这对干细胞来源胚胎模型具有重要意义——此类模型通常缺乏真正的壁TE区室，可能正是其无法忠实重现围着床期形态发生和生成 authentic 胎盘的原因。人胚胎数据提示壁TE异质性方面可能保守存在，CDH5?ASCL2? TE细胞可能代表小鼠特化壁TE的功能类似物，这对植入前遗传检测中TE活检的空间异质性具有潜在临床意义。研究结论翻译如下：本研究提供了围着床期发育的分期体内蓝图，修正了多能性进展和EPC起源的长期模型，并为理解该窗口为何难以体外捕获提供了机制框架；这些发现为改进干细胞来源胚胎模型和揭示妊娠成功早期决定因素开辟了新方向。
