两种常见移植物抗宿主病预防方案对肠道微生物组影响的随机III期临床试验

《Nature Medicine》：Effect of two common GVHD prophylaxis regimens on the gut microbiome in a randomized phase 3 trial

　　

中文摘要翻译 异基因造血干细胞移植（allo-HCT）可治愈某些血液系统疾病，但伴有多种并发症。回顾性研究中，低肠道微生物组多样性与不良临床结局相关。2023年，血液与骨髓移植临床试验网络1703（BMT CTN 1703）随机III期试验证明，在接受allo-HCT的血液恶性肿瘤受试者中，移植后环磷酰胺（PTCy）联合吗替麦考酚酯方案在预防移植物抗宿主病（GVHD）方面优于他克莫司联合甲氨蝶呤（Tac/MTX）方案。本文报告了BMT CTN 1801——1703研究的微生物组辅助研究，该研究共同招募受试者并共享试验注册信息。主要终点是中性粒细胞植入时的微生物组多样性与1年后非复发死亡率（NRM）之间的关联；次要终点包括与其他临床结局以及与基线微生物组多样性的关联。基于来自304名受试者（Tac/MTX组n=147，PTCy组n=157）的2575份纵向粪便样本，未观察到植入时微生物组多样性与NRM之间存在关联（P=0.314），未达到主要终点。较低的基线微生物组多样性与较短的总生存期（OS）相关（P=0.007）。安全性数据已在原始1703号出版物中报告。在探索性分析中，与Tac/MTX相比，PTCy组在HCT后第14-28天期间微生物组多样性和绝对微生物负荷均较低，且独立于非预防性抗生素暴露。微生物优势事件（单一物种相对丰度超过30%）在研究组间无显著差异，既反映了病原体爆发，也反映了微生物群落较不严重的破坏。在HCT后，PTCy组的Clostridium scindens和次级胆汁酸代谢通路的流行率低于Tac/MTX组。总之，研究人员发现预防方案可能对微生物组和免疫系统产生独立影响，并且也可能影响它们之间的相互作用。因此，要了解微生物组靶向干预措施是否能以及如何改善移植结局，需要在每种特定治疗背景下仔细厘清这些效应。ClinicalTrials.gov标识符：NCT03959241。

论文解读文章

研究背景

异基因造血干细胞移植（allo-HCT）是治疗多种血液系统恶性肿瘤的关键手段，但移植物抗宿主病（GVHD）是其最常见且严重的并发症。供体T细胞攻击宿主组织，导致急性和慢性免疫相关并发症，是接受allo-HCT患者死亡的主要原因之一。传统的GVHD预防方案（如钙调磷酸酶抑制剂联合甲氨蝶呤（MTX））虽有一定效果，但仍有超过一半的患者发生GVHD。近年来，移植后环磷酰胺（PTCy）方案因其在GVHD无复发生存（GRFS）方面的优越性而受到关注。此前的研究表明，肠道微生物组，尤其是其多样性，与allo-HCT的不良结局（如GVHD风险、血流感染和死亡率）密切相关。然而，这些关联大多是在PTCy时代之前建立的。随着PTCy成为新的标准预防方案，有必要在前瞻性、多中心随机对照试验的框架下，重新评估肠道微生物组与临床结局之间的关系，并探索不同GVHD预防方案对微生物组的影响。

研究目的与结论

为探究上述问题，研究人员开展了BMT CTN 1801研究，这是BMT CTN 1703随机III期试验的辅助研究。该研究共纳入304名受试者（Tac/MTX组147人，PTCy组157人），收集了2575份纵向粪便样本并进行宏基因组测序。主要终点是中性粒细胞植入时微生物组多样性与1年非复发死亡率（NRM）的关联，但结果显示两者无显著相关性（P=0.314），未达到主要终点。然而，研究发现较低的基线微生物组多样性与更短的总生存期（OS）显著相关（P=0.007）。此外，在探索性分析中，研究人员发现PTCy方案在HCT后第14-28天导致比Tac/MTX方案更低的微生物组多样性和绝对微生物负荷，这种差异不能完全由抗生素暴露差异解释。同时，PTCy组中与次级胆汁酸代谢相关的Clostridium scindens菌种及相关代谢通路流行率更低。该研究的重要意义在于挑战了既往关于植入时微生物组多样性与死亡率关联的普遍认知，揭示了GVHD预防方案本身对微生物组具有独立影响，并为理解微生物组、免疫系统和移植结局之间的复杂相互作用提供了新视角。

关键技术方法

1. 1.
   研究设计与样本队列：本研究为前瞻性、多中心、随机对照III期临床试验（BMT CTN 1703）的辅助研究（BMT CTN 1801），受试者来自多个研究中心，被随机分配至Tac/MTX组或PTCy组。
2. 2.
   粪便样本采集与DNA提取：在预处理前、输注前及HCT后多个时间点（直至第730天）收集粪便样本，使用QIAamp PowerFecal Pro DNA Kit进行DNA提取。
3. 3.
   宏基因组鸟枪法测序：使用NovaSeq 6000平台对提取的DNA进行双端150 bp测序，目标深度为6 Gbp。
4. 4.
   生物信息学分析：使用mOTUs v3.0.3软件进行物种水平的分类学谱分析，计算Shannon指数等α多样性指标；使用HUMAnN v3.9进行功能谱分析。
5. 5.
   绝对微生物负荷定量：结合数字微滴PCR（ddPCR）实验测量16S rRNA基因拷贝数和机器学习模型预测，估算每份样本中的绝对微生物负荷。

研究结果

BMT CTN 1801研究设计

研究人员描述了BMT CTN 1801作为BMT CTN 1703辅助研究的试验设计。所有受试者在allo-HCT前接受了减低强度预处理，并被随机分配至Tac/MTX标准预防组或PTCy+MMF+Tac实验组。研究共招募了304名提供至少一份粪便样本的受试者，最常见的原发疾病是急性髓系白血病（AML）和骨髓增生异常综合征（MDS）。

主要终点：植入时微生物组多样性与NRM的关联

预设的主要目标是评估中性粒细胞植入时微生物组多样性与1年NRM的关联。通过Fine-Gray模型分析，无论是将多样性按三分位数分类还是作为连续线性变量处理，均未发现植入时微生物组多样性与NRM累积发生率之间存在显著关联。

次要终点：微生物组多样性与其他临床结局的关联

在预设的次要分析中，研究人员发现植入时微生物组多样性与NRM以外的其他临床结局（如复发、急慢性GVHD、OS等）也无显著关联。然而，基线微生物组多样性与临床结局相关：最低多样性三分位数组的OS显著短于最高组；作为连续预测因子时，较低的基线多样性与更短的OS和更差的GRFS显著相关。此外，HCT后前30天内较高的抗菌药物暴露与II-IV级急性GVHD风险增加相关。

安全性

安全性分析已在BMT CTN 1703研究中报告。在BMT CTN 1801的324名共同入组受试者中，共有71例死亡。

敏感性分析

针对34名非中性粒细胞减少症受试者的敏感性分析（将其植入时间点样本替换为第14天样本）证实了主要分析的稳健性，即植入时微生物组多样性与临床结局之间缺乏一致的显著关联。

事后分析：微生物组α多样性和绝对微生物负荷

研究人员比较了两种预防方案对微生物组多样性和绝对微生物负荷轨迹的影响。基线时两组无差异。HCT后，两组的多样性和微生物负荷均下降，但PTCy组在第14-28天期间的下降更为显著。这种差异不能完全由两组间抗生素暴露的差异来解释，即使在调整了非预防性抗生素暴露因素后，微生物负荷的差异仍然显著。

事后分析：微生物优势事件

研究人员分析了微生物优势事件（单一物种相对丰度>30%）。优势事件在HCT后常见，约50%的样本在第14天出现优势。尽管优势事件涉及的物种包括病原体（如Enterococcus faecium）、共生菌（如Ruminococcus gnavus）以及饮食来源的菌种（如Lactobacillus rhamnosus），但整体上优势事件的发生率在两组间无显著差异。值得注意的是，由L. rhamnosus和Streptococcus thermophilus主导的优势事件伴随着极低的绝对微生物负荷，暗示这可能是微生物群落崩溃而非真正细菌爆发的表现。分析未发现微生物优势事件与长期临床结局之间存在一致性的显著关联。

事后分析：治疗组间的肠道微生物组差异

研究人员识别了在HCT后第14-28天期间，两组间丰度存在差异的菌种。PTCy组中，Clostridium scindens等多种梭菌属（Clostridia）物种的丰度显著低于Tac/MTX组。功能分析显示，PTCy组中次级胆汁酸代谢通路的丰度也显著更低。有趣的是，在Tac/MTX组中，存在次级胆汁酸代谢通路与较低的慢性GVHD风险相关，但在PTCy组中未观察到这一关联。

总结与讨论

本研究是迄今为止规模最大的、在allo-HCT领域内前瞻性收集粪便样本用于微生物组分析的随机对照试验之一。研究结果挑战了此前认为植入时微生物组多样性与死亡率存在强关联的观点。研究发现，虽然PTCy方案在临床上优于Tac/MTX方案，但它却与更严重的早期微生物组紊乱（包括更低多样性和更低微生物负荷）相关，这表明微生物组多样性本身可能并非决定预后的直接因果因素，而是与免疫状态（尤其是同种反应性T细胞的活性）相互作用。研究人员提出一个模型：PTCy通过清除活化的同种反应性T细胞，打断了由T细胞介导的肠道损伤与微生物组失调之间的恶性循环，从而使得即使微生物组状态较差，也不会转化为更差的临床结局。此外，PTCy组中C. scindens和次级胆汁酸代谢通路的缺失，以及后者与Tac/MTX组中慢性GVHD风险的关联，进一步支持了微生物组与不同免疫抑制方案之间存在特异性相互作用的观点。研究结论指出，PTCy方案与更好的1年临床结局相关，但其对微生物组的强烈抑制作用是否会产生长期后果仍需更长时间的随访来验证。未来的机制研究需要厘清T细胞库、PTCy和微生物组之间的直接与间接相互作用。