《Nature Methods》：PANGEA: an integrated cell atlas across diverse biological contexts enables systematic profiling of multicellular responses in human diseases
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疾病影响组织内多种细胞类型，但人类疾病中多细胞反应的整体图景在很大程度上仍未被探索。本研究基于一张重新映射的人类细胞图谱PANGEA，对人类疾病的多细胞反应进行分类，该图谱整合了通过自动化流程从公共存储库处理原始序列文件所获得的1260万个细胞。研究人员构建了
疾病影响组织内多种细胞类型，但人类疾病中多细胞反应的整体图景在很大程度上仍未被探索。本研究基于一张重新映射的人类细胞图谱PANGEA，对人类疾病的多细胞反应进行分类，该图谱整合了通过自动化流程从公共存储库处理原始序列文件所获得的1260万个细胞。研究人员构建了一个分层细胞分类框架，包含32种主要细胞类型和165种细胞亚型。基于该注释框架，研究人员探索了一张涵盖48个器官、160种疾病的4650万个细胞的大型人类细胞图谱，并揭示了在多个器官中反复出现的核心人类疾病原型。研究表明，该细胞图谱还可作为空间转录组学无偏分析的参考，揭示与免疫治疗反应相关的空间特征。总体而言，本研究为细胞本体论提供了基础性资源，使得跨组织的疾病细胞特征比较成为可能。
**研究背景与问题提出**
单细胞RNA测序（scRNA-seq）技术的进步加深了研究人员对人类疾病细胞架构的理解，使得研究者能够识别疾病相关转录反应的细胞热点。近年来，多项研究整合了多个独立数据集，试图对各种器官类型或疾病中的疾病相关细胞反应进行分类和比较。然而，当前的单细胞转录组图谱存在一些结构性局限：要么在疾病背景方面缺乏足够的多样性，要么局限于特定细胞类型或特定器官。因此，仍需要一张涵盖跨器官广泛疾病背景的综合性多细胞转录组图谱。
建立通用细胞参考往往受到多方面制约，包括后勤整合挑战以及非结构化自由文本中大量细胞注释在达成细胞本体论共识方面的巨大困难。尽管如此，标准化的细胞类型参考和稳健的细胞注释框架可以提供基础性生物学洞见，减少重复性人力投入并最小化个体研究者的偏倚。此外，标准化参考可作为无偏比较分析的稳健骨架。因此，构建通用细胞注释参考常被视为类似于人类基因组组装的工作，凸显了以数据驱动方式达成通用细胞本体论共识的迫切需求。
为成功实现大规模跨组织单细胞转录组数据整合，需满足以下要求：构建具有均一数据格式的广泛数据库、建立统一的质量控制（QC）流程、应用适当的批次整合策略以及采用统一命名系统。研究人员利用从公共序列存储库（NCBI GEO）收集原始序列文件的自动化流程，构建了一张大规模人类疾病单细胞转录组图谱——公共注释基因表达图谱（PANGEA），涵盖跨多种器官的多种人类疾病实体。研究人员通过人工交叉验证层和大语言模型（LLM）重新注释了每个单细胞转录组数据集的元数据。原始测序文件的重新比对产生了标准化数据格式，使得统一QC流程得以实施，促进了批次整合方法的应用，从而以统一命名系统推动了单细胞转录组数据的跨器官整合。
在此基础上，PANGEA提供了一个多背景细胞注释模型，能够系统性地分析人体组织中的多细胞反应。该框架还支持基于通用参考的注释和空间转录组数据集的交叉比较，从而促进细胞分辨率下空间生态系统的表征。研究人员进一步将该方法应用于剖析与肿瘤样本治疗反应相关的空间生态位。最后，研究人员展示了PANGEApy——一个可更新的注释框架，作为开源软件包和交互式网络门户提供。
**关键技术方法**
研究人员采用两种独立策略进行数据收集：重新比对策略和人工管理策略。重新比对策略从NCBI GEO获取原始序列文件，使用CellRanger流程比对至参考基因组GRCh38-2020-A（10x Genomics；GENCODE v32，Ensembl 98）生成计数矩阵。人工管理策略从Single Cell Portal、Human Tumor Atlas Network和GEO等门户获取数据集。细胞类型注释采用CellTypist训练的逻辑回归模型，主要细胞类型图谱使用scVI进行整合，细胞亚型图谱使用Harmony进行批次校正。空间转录组分析采用Cell2location和RCTD进行去卷积。血液表型和组织表型分析使用Leiden聚类和Milo差异丰度检验。外部验证队列包括阿尔茨海默病、系统性红斑狼疮、COVID-19、炎症性肠病及多种癌症的独立单细胞转录组队列。
**研究结果**
**人类疾病跨组织转录组图谱的构建**
研究人员采用重新比对和人工管理两种独立策略收集数据。重新比对数据集经QC后保留2,058例出生后人体体内样本，包括632例癌症样本和1,426例非癌症样本。与CZ CELLxGENE数据库比较，两者规模相近但重叠极小，PANGEA在出版物来源上展现更大多样性。两个策略合并后总计收集46,500万个细胞（重新比对数据集1,260万个，管理数据集3,390万个）。通过人工注释者独立交叉验证层和LLM层对元数据注释进行交叉核查，最终从整个PANGEA数据集中识别出48个器官的160种疾病实体。
**跨组织主要细胞类型的鉴定**
研究人员从每个计数矩阵中提取固定数量高质量细胞（每矩阵250个），使用geosketch保留稀有细胞类型，以scVI整合后鉴定出32种主要细胞类型。基于此图谱使用CellTypist训练逻辑回归模型，将细胞标签投影至其余数据集。通过既定标记基因表达验证主要细胞类型标签的有效性，预测评分在癌症与非癌症样本间相当。与SingleR和scType的基准比较显示，PANGEA框架在总体准确率和调整兰德指数方面均优于现有方法。器官分布模式与既有知识一致，如兴奋性和抑制性神经元仅见于脑样本，肝细胞仅见于肝脏样本。
**分层细胞亚型分类系统的建立**
研究人员从每个矩阵提取最多100个高质量细胞，使用Harmony进行批次校正，从10种全局分布的主要细胞类型中鉴定出165种细胞亚型。亚型分类框架涵盖多种稀有亚型和近期研究新发现的亚型，包括表达TRDV1或TRDV2的Vδ1+和Vδ2+ γδ T细胞、BEST4+肠上皮细胞、表达BMX的簇状细胞、ADAMDEC1+成纤维细胞、表达CCL25的皮质胸腺上皮细胞及MARCO+肺泡巨噬细胞。通过对人肺细胞图谱、人肠图谱和跨组织成纤维细胞图谱的评估，PANGEA框架展现稳健预测结果，并成功将不同器官的细胞注释（如肝库普弗细胞、乳腺M2巨噬细胞和心脏髓系细胞）统一为LYVE1+巨噬细胞。
**人外周血的年龄相关转录组特征**
利用PANGEA细胞注释框架分析有年龄注释的血液样本，发现与年龄相关的细胞亚型包括γδ T细胞、初始/中央记忆CD8+ T细胞、CD4+ Tregs、CD8+ TEMRA细胞、Th2记忆CD4+ T细胞和非典型记忆B细胞。通过假批量分析评估T&NK细胞、成熟B细胞、单核细胞和经典树突状细胞的年龄相关转录特征，发现成熟B细胞和T&NK细胞的转录特征可预测样本年龄，这些年龄关联模式在硬皮病、COVID-19和健康样本队列中得到验证。通路分析表明T&NK细胞中趋化基因随年龄上调，成熟B细胞和T&NK细胞中分解代谢通路基因上调。
**人外周血的多细胞表型**
研究人员基于T&NK细胞、成熟B细胞和单核细胞的亚型组成谱对人类血液样本进行Leiden聚类，通过差异丰度检验识别疾病富集的血液表型（BP）。BP9在COVID-19患者样本中高度富集，BP7在系统性红斑狼疮（SLE）患者中高度富集。BP9富集干扰素刺激基因（ISG）的细胞亚型，BP7富集滤泡辅助T细胞和Th17细胞以及干扰素刺激单核细胞群体。BP10以调节性CD4 T细胞（Tregs）高水平为特征，富集多种癌症患者血液样本。BP4与阿尔茨海默病相关。外部队列验证确认了这些关联，BP7在SLE非严重疾病患者中高度富集，而严重疾病患者主要归入BP9；BP9表型在COVID-19感染急性期特异性检测到。
**跨器官人类疾病的多细胞表型**
研究人员排除器官特异性亚型后，基于跨器官分布细胞亚型的组成谱对样本进行聚类，鉴定出10种不同的组织表型（TP），显示器官身份在样本簇中的混合分布，表明该组织表型框架的跨器官性质。TP4在肿瘤样本中高度富集，TP9与多种免疫性疾病相关（包括硬皮病、炎症性肠病和结节病）。来自不同器官的肿瘤样本汇聚于TP4，不同器官的硬皮病样本汇聚于TP9，表明该框架根据疾病背景而非器官身份对样本进行聚类。TP9富集CCL19+成纤维细胞和调节性CD4 T细胞，TP4富集耗竭CD8 T细胞、调节性CD4 T细胞和LRRC15+成纤维细胞。外部队列验证了TP9与IBD的关联以及TP4与结直肠癌、胰腺癌和宫颈癌的关联。
**肿瘤相关细胞类型的空间相关性**
研究人员使用Cell2location以PANGEA细胞参考对公共空间转录组数据集进行去卷积分析。成纤维细胞亚型的器官分布模式在空间数据集中得到良好保留，肿瘤特异性分布模式在两种模态间显著相关。在胶质母细胞瘤数据集中，LRRC15+成纤维细胞、TNFAIP6+壁细胞和CXCR4+内皮细胞清晰标记了肿瘤核心侧与瘤旁侧之间的边界。CXCR4+内皮细胞与TNFAIP6+血管周围壁细胞之间的强空间关联在多种癌症类型中得到重现。空间关联网络识别出多个功能注释的生态位：含淋巴细胞、CCL19+ FRC样成纤维细胞和成熟LAMP3+树突细胞的淋巴结构生态位；以多谱系干扰素反应细胞为特征的干扰素反应生态位；富集髓系细胞和炎症成纤维细胞的炎症生态位；以及CXCR4+内皮细胞和TNFAIP6+血管周围壁细胞的血管生成生态位。LRRC15+成纤维细胞在胰腺癌上皮核心内的浸润率异常高，其浸润率与肿瘤反应性耗竭CD8 T细胞的上皮浸润率呈负相关，且与免疫治疗反应率呈负相关。
**框架可扩展性：缺失细胞类型的检测与整合**
研究人员通过"减一"模型模拟缺失细胞场景，发现从参考模型中排除特定细胞类型会选择性降低该细胞群体的预测性能。"加一"模型模拟中，将框架从32种扩展至33种主要细胞类型（新增"内分泌"标签），在内分泌细胞簇中产生显著改善的分类性能，同时其他细胞类型的性能基本保持。独立人类胰腺数据集验证了"加内分泌"模型的改进性能。这些结果突显了该模型识别自身局限并通过系统扩展优化未来性能的能力。
**讨论与结论**
参考细胞图谱可促进单细胞转录组数据集的准确比较和新细胞类型的发现。构建通用细胞图谱的努力常受多种障碍阻碍，包括后勤制约、不一致的QC措施、批次效应和缺乏统一命名系统。本研究利用通过自动化流程从公共存储库无偏收集原始序列文件处理的跨多器官多样疾病背景的重新映射单细胞转录组数据库，构建了参考细胞图谱和分层分类模型。统一注释框架使得在共享特征空间内跨多样器官和疾病的细胞组成谱直接比较成为可能。利用该标准化特征空间，研究人员识别了跨多器官反复出现的细胞反应原型，揭示了人类疾病中保守的多细胞组织模式。
尽管本研究的注释框架在广度和深度上仍有限，但可通过纳入代表更广泛生物学背景的额外高质量数据集进行前瞻性扩展。重要的是，此处生成的标准化框架和广泛管理的元数据为未来自动化数据管理提供了宝贵资源。随着LLM和其他AI系统在元数据协调和细胞注释中越来越多地发挥作用，研究人员手动管理的注释提供了高质量训练语料库，以支持更准确和稳健的自动化流程。此外，该图谱和注释模型可作为基准资源。作为初步但可扩展的草案，该框架为未来更新和完善奠定了基础，有助于 comprehensive 人类细胞图谱的长期发展。
