《Nature Structural & Molecular Biology》：GPCR-MAPS: high-resolution functional and allosteric mapping of G-protein-coupled receptor activation functions and bias
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G蛋白偶联受体（GPCRs）是重要的药物靶点。靶向变构调节和偏向性信号转导（而非正构口袋）的方法可改善治疗药物的安全性。然而，GPCR结构的高分辨率定量功能注释的缺乏限制了精准治疗的合理设计。本研究提出GPCR-MAPS——一种快速且通用的方法，用于构建GPC
G蛋白偶联受体（GPCRs）是重要的药物靶点。靶向变构调节和偏向性信号转导（而非正构口袋）的方法可改善治疗药物的安全性。然而，GPCR结构的高分辨率定量功能注释的缺乏限制了精准治疗的合理设计。本研究提出GPCR-MAPS——一种快速且通用的方法，用于构建GPCR的完整、高分辨率、多模态功能与变构图谱。GPCR-MAPS量化蛋白质的直接招募，并解卷积氨基酸替换对受体表达的重大影响。研究人员将GPCR-MAPS应用于β2肾上腺素受体（β2AR），生成超过7,500条剂量-反应曲线，揭示了模块化的受体架构，其核心激活网络被控制定量参数和偏向性的残基所包围。研究人员利用该信息鉴定了多个变构表面口袋。该方法在GPCR超家族中的应用有望实现对这类受体的深入理解，并促进精准GPCR治疗药物的合理设计。
G蛋白偶联受体（GPCRs）是最大的跨膜蛋白家族，负责将外部信号传递至细胞内，其信号分子包括神经递质、代谢物、免疫系统分子、质子和光子等。GPCR具有七次跨膜螺旋（TM），由交替的细胞内环（ICLs）和细胞外环（ECLs）连接。激动剂结合受体胞外部分引起变构构象变化，使一个或多个异源三聚体G蛋白结合并激活，进而激活多种下游信号通路。激活还导致受体磷酸化（包括C端尾部）和β-抑制蛋白（β-arrestin）的招募，后者通过内化受体终止G蛋白信号，同时作为支架介导G蛋白非依赖性信号。由于GPCR作为主信号转导器的角色及其在细胞表面的可及性，其是最重要的药物靶点类别，目前三分之一的临床治疗药物靶向GPCR。绝大多数GPCR药物结合正构位点，但替代模式包括偏向性激动和变构调节。偏向性激动剂优先通过一条下游通路传递信号（例如G蛋白优先于β-arrestin），可提高治疗效力。变构药物结合正构位点以外的区域，靶向非保守位点可具有高特异性和低毒性；且由于变构药物调节对生理配体的反应，其效应在时间和空间上与生理信号过程匹配。然而，目前对这些分子的发现通常仅通过盲筛或对已知分子的迭代优化。为设计更好的GPCR药物，需要更深入理解连接激动剂结合与细胞内信号的功能和变构架构。结构研究已鉴定保守的"微开关"基序，包括CWxP、DRY、PIF和NPxxY，激活时发生局部结构重排。突变结合功能表征是理解蛋白质的有力补充方法。数百个丙氨酸替换对GPCR通过一条或两条通路信号的影响已揭示信号反应的多样性。 pooled方法已表征表面表达、配体结合和下游转录反应。然而，有限通量、仅关注19种变体中的一种以及缺乏多模态反应和信号参数的定量限制了可获得的见解。在药物发现方面，一个关键挑战是理解配体如何调节受体信号——是否所有配体接触位点对反应同等重要，还是仅一小部分"热点"残基重要。另一个挑战是理解受体结构上的扰动如何改变不同转导蛋白招募的偏向性，以及鉴定扰动可抑制、激活或调节信号的变构位点。GPCR有许多可用于治疗靶向的小口袋，了解哪些位点的扰动改变受体反应及其方式将极为有用。在此，研究人员提出一种通用高通量方法GPCR-MAPS，用于快速生成GPCR的综合功能图谱，并将其应用于研究最广泛的受体之一β2AR。β2AR表达于心血管系统，调节平滑肌松弛和支气管扩张；多种β2AR激动剂已开发用于治疗哮喘和慢性阻塞性肺疾病。GPCR-MAPS包含四个组成部分：第一，生成受体的完整位点饱和文库，包含所有位置的所有可能氨基酸替换；第二，量化变体文库的细胞表面表达以量化折叠稳定性和运输缺陷；第三，使用pooled实验量化配体处理下构象特异性相互作用伴侣对每个受体变体的招募，利用配体滴定可在单次实验中量化所有可能受体变体的完整浓度-反应激活函数，测量不同相互作用伴侣的招募可量化受体偏向性的变化；第四，整合数据生成丰富的多模态功能图谱，揭示受体定量和多模态功能如何被整个结构中化学多样的扰动所改变。应用于β2AR，GPCR-MAPS量化了超过7,500个不同受体变体的激活功能和多模态特征，所得图谱揭示了模块化受体架构，核心激活网络被调节定量参数和偏向性的残基包围，图谱还鉴定了多个变构表面口袋。研究人员认为GPCR-MAPS在GPCR超家族中的应用将推进对最大人类膜受体家族的理解，并实现合理的精准药物设计。
研究人员开展了以下研究：为并行量化数千个受体变体的多模态表型（包括完整浓度-反应曲线），开发了模块化平台GPCR-MAPS，聚焦于量化与受体的直接结合相互作用，避免下游内源信号网络非线性、反馈和差异信号放大的混杂影响。GPCR-MAPS兼容基于cassette或SUNi的突变生成pooled受体变体文库，文库经条形码标记后快速整合到工程化HEK293"landing pad"细胞的单一基因座，确保每个细胞表达单拷贝单变体。通过FACS结合测序测量每个变体的细胞表面表达。为量化配体处理下受体相互作用伴侣的招募，基于先前平台开发了模块化蛋白质相互作用 assay，大幅改进信噪比并扩展至多种GPCR蛋白相互作用伴侣的模块化读出，包括活性态特异性纳米抗体Nb80、β-arrestin和mini-Gs。
关键技术方法包括：位点饱和突变文库构建与条形码关联（PacBio长读测序建立基因型-条形码联系）；landing pad细胞系介导的单拷贝基因整合；基于eLOV-TEVcs-Gal4转录报告系统的多重蛋白质招募 assay 结合短读RNA测序；FACS分选结合测序定量表面表达；以及四参数Hill曲线拟合定量浓度-反应关系。研究使用的HEK 293T LLP-iCasp9-Blast landing pad细胞由K. Matreyek赠送。
研究结果方面：（1）GPCR-MAPS平台开发——通过改进SPARK2系统，将受体构建体与报告构建体整合于单一质粒并添加DNA条形码，利用landing pad细胞确保拷贝数为1，采用uTEV1Δ和eLOV组合获得最高信噪比，验证了Nb80、β-arrestin和mini-Gs作为结合伴侣的适用性。（2）应用于β2AR——生成包含所有错义和无义替换、同义变体和单残基缺失的饱和突变文库，建立212,840个基因型-条形码联系，代表8,970个独特基因型（99.2%），获得8,740个表面表达测量值和7,850个高置信度Nb80及β-arrestin招募评分，跨膜区域对替换最敏感。（3）解卷积招募与表达——招募评分与表面表达相关（Nb80 ρ=0.55，β-arrestin ρ=0.6），但某些替换对招募的影响远超表达变化所能解释，如异丙肾上腺素结合位点替换对表达影响极小但对招募强烈有害；通过LOWESS回归建模表达-招募关系并计算残差z评分，鉴定功能获得（GoF）、功能丧失（LoF）和功能改变（CoF）残基。（4）Nb80和β-arrestin招募的完整功能图谱——分别鉴定49和73个LoF残基（47个共享），31和53个GoF残基（20个共享），34和31个CoF残基（8个共享）；LoF残基主要位于受体核心，GoF和CoF残基更偏外周。（5）LoF残基定义核心激活网络——47个共享LoF残基中39个形成连接配体结合位点与转导蛋白结合位点的互联路径，包括异丙肾上腺素结合口袋全部9个残基、CWxP基序的W2866×48、PIF基序的I1213×40、NPxxY基序的N3227×49和Y3267×53等，通过两条通路连接至N3227×49；与先前网络约一半重叠，但在配体结合位点附近鉴定了更多残基；先前两个网络共享但不在本核心网络中的6个残基中，4个被鉴定为CoF或GoF，强调经验性检测所有19种替换的价值。（6）GoF位点位于离子锁、NPxxY基序附近和胞外前庭——D1303×49和E2686×30参与保守离子锁，其他GoF残基主要聚集在TM3/TM5/TM6靠近NPxxY和DRY基序区域以及配体结合位点附近的胞外前庭，C端尾部有7个GoF残基。（7）CoF位点毗邻核心网络——CoF残基聚集在激活时发生结构变化的重要LoF残基附近，如S1203×39和E1223×41毗邻PIF基序的I1213×40，F3217×48毗邻NPxxY基序的N3227×49。（8）异丙肾上腺素结合口袋残基的差异贡献——所有残基均为LoF但效应 magnitude 不同，D1133×32效应最强（表达调整后Nb80和β-arrestin招募中位数分别为?0.94和?0.89），N2936×55虽与异丙肾上腺素形成氢键但替换损害最小（?0.24和?0.4），S2045×44不直接接触配体但效应强烈有害（?0.96和?0.81），提示其作用更多与受体激活相关。（9）招募偏向性的遗传控制——Nb80和β-arrestin招募的突变效应高度相关（Pearson r=0.89），先前报道的偏向性变体F193A、Y219A和Y199A在本实验中确实偏向Nb80；鉴定19个残基替换对β-arrestin招募影响更大、7个对Nb80影响更大，以及偏向性切换残基；偏向β-arrestin的7个残基中3个（P13834×50、F13934×51和Y3267×53）与Nb80和β-arrestin均直接结合，提示其对Nb80结合更关键；胞外前庭富集Nb80偏向性残基（ECLs OR=6.4，ECL2 OR=5.6），与沙美特罗（G蛋白偏向性激动剂）的ECL2结合位点一致；TM7靠近NPxxY基序也富集偏向性残基（OR=3.7）。（10）超过7,500个β2AR变体的激活函数——用12个系列稀释异丙肾上腺素浓度（10 pM至10 μM）进行Nb80招募实验，通过qPCR估计报告转录总量并进行标准化，量化7,680个变体的浓度-反应关系（约92,000个测量值），聚类揭示野生型样、中度损害和强LoF三个主要簇；野生型EC50为26.2 nM，Hill系数0.84，获得5,588条高质量浓度-反应曲线；EC50测量与单独检测的替换结果相关（Pearson r=0.74）。（11）表面表达是受体效力的主要决定因素——表面表达与log EC50相关性最强（ρ=?0.41），通过LOWESS回归解卷积后鉴定29个EC50 GoF和59个EC50 LoF残基，与饱和浓度实验有部分重叠；异丙肾上腺素直接接触残基的替换多完全废除激活，仅39/165个错义变体可拟合曲线，但这些变体效力降低超过一个数量级（中位EC50=359 nM vs 野生型26.2 nM）；EC50 LoF残基富集于第二壳层（OR=4.12），提示其变构效应；EC50 LoF和CoF残基在三维空间上比GoF残基更接近核心激活网络；最显著的EC50 GoF残基包括E2686×30、D1303×49和L2726×34，ICL3富集9个EC50 GoF残基（OR=3.38），可能削弱TM3与TM6或其他螺旋的相互作用或消除ICL3的自抑制效应；N端两个GoF残基与两个N-糖基化位点重合；PIF基序的F2826×44是最强EC50 CoF残基，芳香族替换（Y或W）产生稳定但效力强烈降低的受体，可能稳定非活性态。（12）已知变构口袋——AS408（负变构调节剂，结合于TM3和TM5之间）口袋的7个残基共有7个功能注释（相比所有220个结构解析表面暴露残基的96个注释），V1293×48为最大招募和EC50的LoF，E1223×41为CoF，C1253×44为EC50 CoF，I2145×53为EC50 LoF；Cmpd-6FA（正变构调节剂）口袋9个残基中仅4个注释，但D1303×49替换导致最大招募和EC50的强GoF，可能解释其PAM活性，K1494×41为EC50 CoF。（13）预测变构口袋——Fpocket预测的非活性β2AR中TM5和TM6之间的一个口袋10个残基中有8个功能注释（多为LoF或CoF，另有1个GoF），提示高度活跃口袋，与GPCR"pocketome"数据集的孤儿位点5重叠；邻近部分重叠的另一口袋9个残基中仅2个注释，提示扰动该口袋不太可能对受体激活产生功能影响。
讨论部分总结：研究人员提出了GPCR-MAPS——一种通用、模块化、大规模可扩展的方法，精确量化替换对GPCR活性和偏向性的影响。相比现有技术有多项重要技术进步：第一，量化蛋白质向受体的招募，最小化非线性和不等信号放大以及内源细胞类型特异性信号网络反馈的混杂效应；第二，模块化设计，验证了纳米抗体、mini-G蛋白和β-arrestin的使用，受体近端读出便于跨招募蛋白比较；第三，测量并定量解卷积表达变化对信号参数的重大混杂影响；第四，将GPCR突变扫描扩展至所有替换的完整浓度-反应曲线激活函数的量化。应用于β2AR，GPCR-MAPS绘制了定量多模态受体表型如何响应整个结构扰动的完整氨基酸分辨率图谱。解卷积表达效应后，破坏招募的残基形成连接配体结合位点与转导蛋白偶联位点的互联核心激活网络。数据还鉴定胞外前庭（特别是ECL2）作为控制受体偏向性的主要变构位点，以及TM7靠近NPxxY基序作为变构控制受体激活偏向性的内部区域。在单次实验中量化超过7,500个受体变体的完整激活函数揭示表达也是EC50的主要影响因素，这与理论模型预测和近期植物激素受体研究一致。校正表达变化影响后，EC50调节替换在拓扑上定位：增加效力的变体位于ICL3和N端两个N-糖基化位点，降低效力的替换靠近核心激活网络可能调节该网络，而增加效力的残基远离核心网络可能通过不同机制起作用。这种LoF和GoF变体位置和可能机制的区分与Src和其他激酶中的观察平行。精确模态如偏向性信号和变构调节将允许开发强大的新型GPCR药物。尽管GPCR结构生物学发生了革命，但研究人员缺乏对GPCR激活和效应器招募的足够功能理解来设计变构和偏向性调节剂。量化多模态突变效应将加速新型精准药物的开发。偏向Nb80招募的残基富集于ECL2（沙美特罗的外部位点组成部分），提示突变行为与药物活性结合位点相关；已知变构调节剂结合的口袋具有与其活性匹配的高影响替换。除已知变构位点外，GPCR-MAPS优先推荐了β2AR中一个额外的变构口袋用于靶向，并降低了一个替换仅有限影响的口袋的优先级。GPCR药物发现已从盲筛高通量时代进入基于结构的药物发现时代，研究人员认为现在正进入第三个时代——定量信号参数的高分辨率功能图谱赋能先进GPCR治疗药物（包括精准偏向性和变构调节剂）的合理设计。
研究结论翻译：本研究提出了GPCR-MAPS——一种通用、模块化且大规模可扩展的方法，用于精确量化替换对GPCR活性和偏向性的影响。该方法在GPCR药物发现中具有重要技术优势，包括直接量化蛋白质招募、模块化读出、解卷积表达效应以及完整浓度-反应曲线的量化。应用于β2AR，GPCR-MAPS揭示了模块化受体架构、核心激活网络、变构表面口袋以及决定效力和偏向性的关键残基，为合理设计精准GPCR治疗药物奠定了基础。
