《Scientific Reports》：Generation of Quarter- and Hemi-embryos via blastomere isolation reduces mosaicism and reveals editing patterns in Cas9 RNP-edited bovine embryos
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CRISPR/Cas9基因组编辑在植入前胚胎中持续存在嵌合现象（mosaicism）这一局限。本研究检验了在2-细胞或4-细胞期分离卵裂球（blastomere）是否可降低所得囊胚（blastocyst）中的嵌合现象，并利用靶区域的变异模式分析电穿孔（elec
CRISPR/Cas9基因组编辑在植入前胚胎中持续存在嵌合现象（mosaicism）这一局限。本研究检验了在2-细胞或4-细胞期分离卵裂球（blastomere）是否可降低所得囊胚（blastocyst）中的嵌合现象，并利用靶区域的变异模式分析电穿孔（electroporation）后Cas9-RNP复合物的活性持续时间。体外生产的牛受精卵在授精后10 h针对酪氨酸酶（Tyrosinase, TYR）基因进行Cas9-RNP电穿孔，分离2-或4-细胞期卵裂胚胎的单个卵裂球以生成半胚胎（Hemi-embryos）和四分之一胚胎（Quarter-embryos）。虽然胚胎的单独培养与集团培养相比未降低囊胚形成率，但半胚胎的每源胚胎囊胚产量显著高于无透明带对照（88.2 ± 29.0% vs. 51.1 ± 08.1%），而四分之一胚胎的每源胚胎囊胚产量（68.2 ± 28.8%）与其他四个处理组均无显著差异。编辑效率不受透明带去除和胚胎分割的影响，但四分之一胚胎和半胚胎的嵌合现象较完整胚胎显著降低（分别为21.4 ± 10.8% vs. 29.3 ± 31.2% vs. 59.8 ± 32.9%）。编辑事件评估表明，约66%的推定单等位基因编辑（若在未分割胚胎中被鉴定）实际上是嵌合的。最后，靶区域的最大等位基因变异计数与Cas9-RNP活性至少持续至第二次卵裂分裂相关的S期（约对应4-细胞期）并在此后逐渐受限相一致。这些等位基因模式为早期胚胎卵裂期间可检测的Cas9-RNP活性时间窗口提供了间接估计。总之，本研究结果推断了早期胚胎卵裂期间Cas9活性的时间窗口。综上所述，卵裂球分离显著降低了嵌合现象发生率，为优化家畜育种中的基因组编辑策略提供了有吸引力的启示。
**研究背景与问题**
CRISPR/Cas9基因组编辑技术在家畜胚胎中的应用面临嵌合现象的持续困扰。在牛胚胎中直接进行受精卵编辑虽可为生成 founders 动物提供无需体细胞核移植的实用途径，但嵌合胚胎的频繁产生——即单个胚胎内不同卵裂球携带不同等位基因结果——限制了该方法的效率和可预测性。在家畜中，同一胚胎内细胞谱系间的遗传异质性尤为棘手，因为世代间隔长且繁殖周期昂贵，使得嵌合 founders 的检测和淘汰耗费大量资源。因此，降低嵌合现象已成为牛胚胎基因组编辑的核心目标。
CRISPR-Cas9编辑后的嵌合现象与核酸酶活性持续至第一次胚胎DNA复制之后密切相关，使得独立的切割和修复事件在不同卵裂球中产生不同等位基因。理想情况下，基因组编辑应发生在单细胞受精卵DNA合成之前，从而在所有后代细胞中产生统一的等位基因结果。然而，当Cas9活性持续至后续卵裂阶段时，独立的双链断裂（DSB）和修复事件可能在各自卵裂球中发生，生成具有多个等位基因和遗传上不同谱系的胚胎。在牛胚胎中，DNA复制在受精后相对较早开始，较晚授精后时间点递送CRISPR组分与嵌合现象升高相关。在分子水平上，Cas9诱导的双链断裂常通过易出错的非同源末端连接（NHEJ）修复，产生插入和缺失，而精确的同源定向修复在早期胚胎发育中效率较低。因此，重复或延迟的Cas9切割可在不同卵裂球中产生不同等位基因结果并增加等位基因异质性。
胚胎基因组激活（EGA）及相关染色质重塑可能影响早期发育中Cas9介导的编辑动态。小鼠中主要EGA发生在2-细胞期，而牛胚胎中约在8-细胞期，因此牛胚胎在主要转录激活前经历数次卵裂分裂。Cas9持续性是编辑异质性的重要决定因素，实验性缩短Cas9半衰期可降低嵌合现象。同时，EGA前后染色质可及性的发育变化可能改变基因组靶位点对残留Cas9复合物的可及性。Cas9持续性和染色质可及性的发育变化可能共同影响牛胚胎中编辑事件的时间和谱系分布。
已有多种策略通过限制Cas9活性的持续时间或时机来减少嵌合现象，包括早期递送CRISPR组分、使用核糖核蛋白（RNP）复合物以及优化试剂浓度等。其他方法包括加速Cas9降解、化学调控Cas9稳定性、自限性CRISPR系统以及光裂解向导RNA等。尽管取得这些进展，许多研究仍使用全胚胎基因分型评估编辑结果。由于所有组成卵裂球的测序信号被混合，该方法可能掩盖谱系特异性等位基因异质性。此外，全胚胎基因分型具有破坏性，限制了其在选择编辑胚胎用于移植方面的适用性。滋养外胚层活检提供了一种保留胚胎的植入前基因分型替代方案，但当存在嵌合现象时，仅采样细胞亚群可能限制其与整个胚胎基因型的一致性。因此，需要谱系分辨方法来确定编辑结果如何在源自单个分离卵裂球的谱系间分布。
**研究内容与结论**
本研究将CRISPR-Cas9 RNP电穿孔与牛胚胎2-或4-细胞期卵裂球分离相结合，评估了透明带操作、单独培养和卵裂球分离对胚胎发育和囊胚形成的影响，并比较了未分割胚胎、半胚胎和四分之一胚胎间的编辑效率、等位基因变异多样性、编辑事件分布和嵌合现象。研究结果表明，卵裂球分离通过物理隔离独立编辑的卵裂球谱系降低了可检测的嵌合现象，并增加了卵裂球衍生胚胎中非嵌合单等位基因和双等位基因结果的发生频率。谱系分辨分析进一步表明，传统全胚胎基因分型因未能区分同一胚胎内遗传上不同的卵裂球谱系而可能低估嵌合现象。最后，卵裂球分离后等位基因变异多样性的逐渐受限为推断早期卵裂发育中Cas9-RNP活性的时间窗口提供了间接依据。该研究为优化家畜育种中的基因组编辑策略提供了重要启示。
**关键技术方法**
研究人员在授精后10 h对体外生产的牛受精卵进行Cas9-RNP电穿孔靶向TYR基因外显子1，在2-细胞期（30–32 hpi）或4-细胞期（44–46 hpi）分离单个卵裂球，分别生成半胚胎和四分之一胚胎，采用Well of the Well（WoW）培养系统进行单独培养至第8天。通过Sanger测序和ICE（Inference of CRISPR Edits）平台进行基因分型和编辑结果量化。牛卵巢来自当地屠宰场，共进行5次独立生物学重复。
**研究结果**
**单独培养和透明带去除与受精卵电穿孔后的植入前发育兼容**：电穿孔后各组的平均存活率、卵裂率和囊胚形成率均无显著差异（P值分别为0.21、0.22、0.72），表明透明带去除和单独培养不影响胚胎发育。
**分离的卵裂球以阶段依赖方式保留发育能力**：半胚胎的每源胚胎囊胚产量（88.2 ± 29.0%）显著高于集团培养对照（46.9 ± 13.2%，P = 0.03）、单独培养对照（44.7 ± 15.4%，P = 0.02）和无透明带组（51.1 ± 8.1%，P = 0.04）。四分之一胚胎的囊胚产量（68.2 ± 28.8%）与其他组无显著差异。按分离卵裂球计算，2-细胞来源的卵裂球发育率显著高于4-细胞来源者（44.1 ± 14.5% vs. 17.0 ± 7.2%，P = 0.01）。
**受精卵Cas9 RNP电穿孔后基因组编辑效率在后续胚胎操作中得以维持**：四个处理组的基因组编辑效率保持高水平（77.2 ± 27.3%至82.5 ± 16.8%），组间无显著差异（P = 0.6132）。半胚胎和四分之一胚胎衍生囊胚的编辑率分别为57.2 ± 29.3%和67.0 ± 19.6%，两组间无显著差异（P = 0.224）。
**2-细胞期去除透明带不显著改变基因组编辑结果分布**：单独培养对照和无透明带对照在完全编辑、部分编辑和未编辑囊胚的分布以及双等位基因、单等位基因、嵌合和未编辑结果的分布上均无显著差异。嵌合胚胎在两组的全部分析囊胚中均占最大比例（55.1 ± 22.6%和59.8 ± 32.9%，P = 0.41）。
**卵裂球分离使基因组编辑结果向遗传上统一的胚胎谱系偏移**：无透明带对照中嵌合现象占全部囊胚的59.8 ± 32.9%，而半胚胎和四分之一胚胎中分别显著降低至29.3 ± 31.2%和21.4 ± 10.8%（P < 0.0001）。在仅分析编辑囊胚时，嵌合现象同样显著降低（无透明带对照83.0 ± 14.1%，半胚胎49.4 ± 39.7%，四分之一胚胎32.7 ± 13.3%，P < 0.0001）。
**半胚胎与四分之一胚胎间编辑结果分布无显著差异**：两组在完全编辑、部分编辑和未编辑囊胚的分布以及编辑事件类型分布上均无显著差异。
**卵裂球谱系基因分型揭示全胚胎分析低估嵌合现象**：在39个半胚胎重建源胚胎谱中，11个若通过传统全胚胎基因分型将被分类为单等位基因编辑，但卵裂球谱系分析确认仅4个（36.3%）为真正单等位基因编辑，其余7个（63.7%）包含遗传上不同的卵裂球谱系应重新分类为嵌合。四分之一胚胎组中，3个推定单等位基因编辑胚胎仅1个（33.3%）确认为真正单等位基因编辑，其余2个（66.7%）为嵌合。
**卵裂球分离限制编辑牛囊胚中等位基因变异多样性**：未分割胚胎（单独培养对照和无透明带对照）表现出更大的等位基因变异多样性，单个胚胎最多含8种不同序列变异。半胚胎中78.0%含1–2种变异，仅2.0%含5–8种变异；四分之一胚胎中78.0%含1–2种变异，其余22.0%含3–4种变异，最大变异数为4。
**讨论与结论**
本研究证明卵裂球分离后单独培养可实现牛胚胎CRISPR-Cas9基因组编辑结果的谱系特异性表征。透明带去除和单独培养不损害植入前发育，分离的卵裂球以阶段依赖方式保留发育能力，且这些操作均不损害基因组编辑效率。卵裂球分离通过物理隔离独立编辑的卵裂球谱系降低了可检测的嵌合现象，并增加了非嵌合单等位基因和双等位基因结果的发生频率。谱系分辨分析进一步表明，传统全胚胎基因分型可能因未能区分同一胚胎内遗传上不同的卵裂球谱系而低估嵌合现象。卵裂球分离后等位基因变异多样性的逐渐受限为推断早期卵裂发育中Cas9-RNP活性的时间窗口提供了间接依据。总之，本研究结果推断了早期胚胎卵裂期间Cas9活性的时间窗口，卵裂球分离显著降低了嵌合现象发生率，为优化家畜育种中的基因组编辑策略提供了有吸引力的启示。
