《npj Biomedical Innovations》：StrataChip: a microphysiological system to capture dynamic keratinocyte fate and mechanical transitions during human epidermal morphogenesis
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表皮发育与稳态维持需要角质形成细胞（keratinocyte）分化与力学特性之间的精确协调。然而，整合上述过程的机制目前仍认识不足，部分原因在于现有实验系统的局限性。本研究引入StrataChip，一种可操控的微生理系统（microphysiological
表皮发育与稳态维持需要角质形成细胞（keratinocyte）分化与力学特性之间的精确协调。然而，整合上述过程的机制目前仍认识不足，部分原因在于现有实验系统的局限性。本研究引入StrataChip，一种可操控的微生理系统（microphysiological system），能够对人表皮形态发生（epidermal morphogenesis）进行动态、多模态的解析。该平台在微流控装置（microfluidic device）内将培养基灌流的真皮组织与人表皮角质形成细胞相整合，并在建立气液界面（air-liquid interface, ALI）后支持表皮快速分层。高分辨率共聚焦成像（confocal imaging）与单细胞RNA测序（single-cell RNA sequencing）表明，StrataChip再现了人表皮的关键结构学与分子学特征，包括由经典分化标志物及黏附分子组织所定义的、界限分明的基底层（basal layer）、棘层（spinous layer）与颗粒层（granular layer）。单细胞图谱揭示出转录水平上相互区分的基底与棘层亚群，其中包含与棘上（suprabasal）定向相关的过渡状态。原位活细胞三维成像（live 3D imaging）捕获了角质形成细胞的形态动力学（morphodynamics），包括表皮分层早期的基底细胞脱离（delamination）与不对称分裂（asymmetric division）。总之，StrataChip提供了一个稳健的平台，能够对表皮形态发生过程中基因调控与细胞力学变化如何耦联进行动态与机制层面的解析。
研究背景与问题 组织发育与稳态维持依赖细胞力学与细胞命运的协调。表皮作为抵御外界刺激的坚固屏障，在细胞尺度上仍保持动态以维持组织稳态。为补充表皮，基底角质形成细胞改变形态并向组织表面迁移，以替代从外层脱落的细胞；在此迁移过程中，角质形成细胞分化与力学变化需被精细编排。该编排的破坏是基底细胞癌（basal cell carcinoma）、银屑病（psoriasis）及自身免疫性疾病发生发展的基础。尽管细胞-细胞黏附、细胞-细胞外基质（extracellular matrix, ECM）黏附及其相关细胞骨架在该协调中的重要性已被充分认识，但它们如何与基因调控协同以完成细胞状态转变的机制仍不清楚，部分原因在于缺乏可对人表皮形态发生进行动态、多模态解析的可操控实验系统。现有研究依赖体外与体内系统：活细胞成像技术（如共聚焦与双光子显微镜）结合遗传可操作的模型系统（如秀丽隐杆线虫、黑腹果蝇及蛙、小鼠等脊椎动物模型），可在完整生物体内评估候选基因，但受限于有限的时间成像窗口与有限的机制解析能力；体外方法包括由表皮角质形成细胞与真皮成纤维细胞构建的三维（3D）人器官型气液界面培养，可解析表皮分层、分化与屏障形成，但常存在实验可操作性差、非生理性组织-组织界面以及与高倍活细胞显微成像不兼容等问题。为此，研究人员提出一种新的微生理模型StrataChip，具备高度可操作性、模块化并与常规活细胞共聚焦显微镜兼容。
主要技术方法 研究人员采用光刻（photolithography）与聚二甲基硅氧烷（PDMS）软光刻（soft lithography）制备微流控装置，并在中央腔室内聚合载有人真皮成纤维细胞的I型胶原水凝胶以近似真皮；采用聚多巴胺（polydopamine, PDA）对PDMS腔室表面进行功能化以抑制成纤维细胞驱动的凝胶收缩；在凝胶上接种人表皮角质形成细胞（Ker-CT），待其汇合后移除中央端口培养基以建立气液界面（ALI）诱导分层；结合共聚焦免疫荧光、单细胞RNA测序（Parse Biosciences Evercode WT平台，Illumina NovaSeq 6000测序）以及基于旋转盘共聚焦与单物镜光片显微镜（OPM/SOLS）的活细胞三维成像开展分析。
研究结果 在"一种再现表皮形态发生的微生理系统"部分，研究人员构建了StrataChip：中央腔室由PDMS柱围限，允许相邻通道培养基扩散；PDA功能化相较溶剂对照（水凝胶面积下降50%）在聚合后未见含成纤维细胞水凝胶收缩（第5、6、7、8天P值分别为0.01073、0.00095、0.00030、0.00005，每组N=4个独立装置），从而获得稳定的真皮组织模拟物。接种角质形成细胞后2–3天汇合，第3天建立ALI，仅培养7天即生成分层良好的表皮，并与下方成纤维细胞-胶原水凝胶形成生理性组织-组织界面；装置小体积构造使共聚焦显微镜可对整个组织进行原位分析。
在"单细胞转录组学捕获StrataChip中的关键表皮细胞命运"部分，F-actin成像显示从第2天（ALI前）至第7天渐进性细胞分层，表皮平均厚度45 μm，下方真皮水凝胶平均327 μm（N=15个独立装置）。免疫荧光显示三层结构：近水凝胶侧KRT14阳性基底层、KRT10阳性棘层、最外层外皮蛋白（involucrin, IVL）与兜甲蛋白（loricrin）阳性颗粒层；干性/自我更新调控因子p63特异性定位于基底层。对7份表皮组织进行单细胞RNA测序，聚类鉴定出基底、棘层、颗粒层三类主要细胞类型及成纤维细胞，并依据标志物标注：基底（KRT14+、ITGA6+、CDH3+）、棘层（KRT10+、SBSN+、KRTDAP+）、颗粒层（IVL+、FLG+、LOR+）、成纤维细胞（PDGFRA+、DCN+）；Monocle3轨迹推断显示由基底经棘层向颗粒层的伪时间进展；GO分析显示细胞-基质黏附通路富集于基底细胞、角化（cornification）通路富集于颗粒细胞。此外鉴定出基底I与基底II两个转录上不同的亚群：基底I富集细胞-基质黏附程序（多种层粘连蛋白亚基及半桥粒组分如COL17A1），基底II高表达应激相关角蛋白（KRT16、KRT6A/B）及棘上标志物（DSG1、DSP、KRT10）；并鉴定出棘层I与棘层II两个亚群，棘层I富集核糖体生物合成与翻译程序（RPS8、RPL34）及免疫相关转录本（S100A8/9），棘层II富集信号转导与肌动蛋白细胞骨架调控基因（DOCK1、MYO1D）；扩散图与PAGA分析显示由基底I到基底II、再经棘层I或棘层II平行分化、最终汇聚于颗粒层亚群的清晰轨迹。
在"StrataChip中关键表皮结构特征的保留"部分，F-actin标记显示各层特征性细胞形态：基底细胞小而紧凑、棘层细胞呈鳞状、颗粒层细胞扁平、早期角质层细胞扁平且无核；并观察到棘层相较颗粒层F-actin强度降低（平均富集倍数高于1.2）及个别细胞相对邻近细胞的F-actin高强度异质性。Imaris分割定量显示基底角质形成细胞核质比（N/C）大于颗粒细胞，颗粒层细胞体积更大（N=3个独立装置）。黏附分子呈现层别性空间组织：E-钙黏蛋白（E-cadherin）在各层普遍表达；桥粒芯蛋白-1（desmoglein-1）相对基底层富集于棘层与颗粒层；闭锁小带蛋白-1（ZO-1）局限于最顶端细胞，与终末分化颗粒细胞中紧密连接组装一致（每种黏附分子N=3个独立装置）。
在"表皮形态发生过程中角质形成细胞动力学的活细胞三维成像"部分，研究人员使用细胞可透膜荧光活细胞探针FastAct与Spy-DNA标记F-actin与细胞核，实现各分层细胞形态及层特异性形态动力学的活体三维可视化。在早期分层阶段观察到基底角质形成细胞脱离（delamination）并随后嵌入棘上层，此过程不依赖有丝分裂；另观察到不对称有丝分裂，即基底细胞变圆并分裂，一个子细胞维持基底ECM接触、另一个朝向棘上层；还观察到终末分化角化过程中细胞核降解与DNA泄漏，且特异地发生于最外层顶端定位的细胞核。
讨论与结论 器官型人气液界面表皮组织是体外分层与屏障形成研究的基础模型，但常受技术变异、光学可及性受限以及依赖整体分子读出或终点组织学的限制，制约了对角质形成细胞动力学及形态学定义层内细胞异质性的分析。StrataChip作为可操控、模块化的微生理平台，支持稳定的真皮-表皮结构、高分辨率活细胞成像与单细胞转录组分析。研究人员以PDA获得稳定真皮组织，其降低细胞活力的效应在本系统中因多数细胞与PDA处理表面被胶原分隔而最小；7天方案兼顾培养效率与表皮成熟度，系统可稳定维持至14天且表皮厚度略有增加，更长时间线可能带来真皮不稳定风险，可通过调整成纤维细胞数量或添加其他基质细胞类型解决。该系统可识别关键表皮细胞状态并展示黏附与细胞骨架机器在各层的协调空间排布，活细胞显微成像进一步捕获与基底层分层相关的单个角质形成细胞形态动力学；光毒性与细胞损伤是活细胞成像的关注点，可通过确定感兴趣事件的精确捕获窗口加以最小化。StrataChip将经典器官型模型拓展为可动态、机制性地解析表皮形态发生中基因调控与细胞力学耦联的平台，并可用于解析离散角质形成细胞状态如何出现、转变及病理性重编程：单细胞分析鉴定出富集应激相关角蛋白（KRT6/16）、黏附重塑程序与细胞骨架调控因子的基底与棘层亚群，这些特征常被银屑病与早期肿瘤进展等表皮炎症与过度增殖性疾病所利用；结合基因工程、基于CRISPR的扰动与荧光谱系报告系统，可实时因果性地连接基因调控与力学状态转变。该平台可引入与极性、黏附或分化程序相关的疾病突变（如与寻常型天疱疮和表皮松解症相关的桥粒与半桥粒蛋白突变），以判断其是否使细胞偏向异常过渡状态、改变脱离动力学或使分层与终末分化解耦；整合方法有望建模基底细胞癌、银屑病及皮炎等疾病发生前最早的细胞状态转变。StrataChip的自上而下与活细胞成像能力可较依赖正交切片成像的表皮模型更高分辨率地研究黏附、细胞骨架等分子细节；其模块化架构便于重构上皮与基质区室以模拟更广谱的复层鳞状组织与微环境复杂性，上皮层可替换为口腔、食管或宫颈等屏障组织来源的角质形成细胞，真皮区室可引入内皮细胞形成可灌流的微血管网络并调整ECM组成，免疫细胞可经水凝胶或灌流通道引入以研究炎症交互与免疫介导病理。该研究捕获了与力学完整性相关的关键表皮细胞状态与黏附标志物，但尚未全面表征表皮屏障与真皮力学等功能特性，需后续研究验证。总体而言，StrataChip提供了此前仅能通过全组织动物模型与人体组织获得的人表皮结构与形态发生的高效深入观察途径。
