《Scientific Reports》：Umbilical cord blood plasma-derived small extracellular vesicles attenuate the immune response as a novel therapy for type 1 diabetes
编辑推荐：
越来越多的证据表明，来源于脐带血干细胞的sEVs（小细胞外囊泡）对退行性疾病和自身免疫性疾病均发挥治疗作用。脐带血血浆作为单核细胞采集的"副产品"，已在退行性疾病治疗中展现出潜力。值得注意的是，来源于脐带血血浆的sEVs（CB-sEVs）在调控组织再生中发挥治
越来越多的证据表明，来源于脐带血干细胞的sEVs（小细胞外囊泡）对退行性疾病和自身免疫性疾病均发挥治疗作用。脐带血血浆作为单核细胞采集的"副产品"，已在退行性疾病治疗中展现出潜力。值得注意的是，来源于脐带血血浆的sEVs（CB-sEVs）在调控组织再生中发挥治疗作用。本研究探讨了CB-sEVs对1型糖尿病（T1D）的治疗效果。数据显示，CB-sEVs降低了过继转移T1D小鼠的糖尿病发病率，降低了血糖水平，并减轻了胰腺β细胞炎症。此外，CB-sEVs在体外显著抑制了抗CD3/CD28磁珠激活后的人T细胞增殖。研究还观察到效应T细胞和中央记忆T细胞比例相应降低，而初始T细胞百分比显著增加。此外，CB-sEVs的miRNA谱分析揭示了独特的miRNA特征，为CB-sEVs中可能驱动其治疗效果的活性分子成分提供了见解。这些发现表明CB-sEVs代表了一种用于T1D的新型有前景的疗法。
**研究背景与意义**
1型糖尿病（T1D）是一种以靶向破坏胰岛素分泌型胰腺β细胞为特征的自身免疫性疾病，导致胰岛素缺乏。据估计，2025年全球约有950万人患有T1D，预计到2040年将增至1470万人。T1D具有危及生命的风险，持续高血糖与糖尿病酮症酸中毒、严重低血糖等急性并发症以及慢性微血管和大血管并发症相关，严重影响生活质量并缩短预期寿命。外源性胰岛素给药仍是T1D治疗的基石，但并未解决驱动疾病的潜在免疫失调问题。因此，亟需开发超越血糖控制、靶向T1D基本病理机制的治疗策略。在此背景下，基于细胞的疗法因其恢复T1D患者免疫平衡的潜力而受到广泛关注。脐带血已成为T1D治疗中干细胞的重要来源，脐带血来源的干细胞包括间充质干细胞（UC-MSC）和脐带血来源干细胞（CB-SC）已在T1D患者中显示出有前景的临床结果。然而，这些细胞疗法面临多方面挑战，包括不良反应、伦理问题以及临床转化的局限性。纳米级细胞外囊泡（sEVs）直径为40–150 nm，近来已成为多种疾病治疗和诊断应用的有前景的候选者。来源于干细胞的sEVs表现出与其祖细胞相似的强大免疫调节特性，使其对T1D治疗极具吸引力。脐带血血浆来源的sEVs（CB-sEVs）具有强大的再生能力，包括促进伤口愈合、增强骨再生和调节肝纤维化。尽管有这些令人关注的发现，其在T1D中的治疗潜力仍未得到充分探索。本研究旨在探讨CB-sEVs在T1D背景下的治疗潜力，具体评估了CB-sEVs在体内延缓T1D发病的能力，并对其对T细胞增殖的影响进行了初步分析，同时探索了CB-sEVs的潜在机制，重点关注其携带的小RNA及其对免疫抑制功能的潜在贡献。
**关键技术方法**
研究人员从健康志愿者捐赠者的脐带血单位中通过超速离心法分离CB-sEVs，并采用透射电子显微镜（TEM）、动态光散射（DLS）、流式细胞术和Western blotting进行表征。研究使用了过继转移T1D模型，将14周龄糖尿病前期雌性NOD/LtJ供体小鼠的脾细胞转移至6–8周龄雌性NOD/SCID受体小鼠。CB-sEVs以10或100 μg/只的剂量在第0、4和7天静脉给药。体外实验使用CFSE标记的健康供体外周血单核细胞（PBMC），经抗CD3/CD28抗体Dynabeads刺激72小时。此外，研究人员对CB-sEVs进行了miRNA分离、测序及qRT-PCR验证，并开展了GO和KEGG通路富集分析。
**研究结果**
*CB-sEVs的表征*：通过系列离心步骤分离CB-sEVs后，TEM检查显示圆形CB-sEVs大小约100 nm；DLS分析显示平均直径为100.2 ± 22.5 nm；流式细胞术确认CB-sEVs高表达sEVs相关标志物CD9、CD63和CD81；Western blot分析确认了外泌体特异性标志物Alix的存在以及内质网和高尔基体标志物Calnexin和GM130的缺失，证实了CB-sEVs的纯度。这些发现确认了分离的CB-sEVs的纯度和特征，支持其进一步用于功能研究。
*CB-sEVs延缓小鼠T1D发病*：研究人员利用过继转移T1D模型，在脾细胞转移后立即静脉注射CB-sEVs（10 μg/只或100 μg/只），并在第4天和第7天追加两次注射。结果显示，高剂量CB-sEVs（100 μg/受体）强烈延缓了T1D发病，而低剂量（10 μg/受体）未能显示此效果。腹腔葡萄糖耐量试验（IPGTT）显示，与PBS处理组相比，CB-sEVs处理组在葡萄糖激发后高血糖减轻，曲线下面积（AUC）显著降低。CB-sEVs治疗可部分恢复受损胰岛的功能。
*CB-sEVs通过抑制T细胞增殖改善糖尿病发病率*：第58天时，未处理组糖尿病发病率为90%，而CB-sEVs处理组仅为10%。流式细胞术和組織学分析显示，CB-sEVs处理组胰腺浸润T细胞百分比显著低于PBS处理组，CD3? T细胞数量减少。组织学分析显示PBS处理组小鼠呈现广泛的免疫细胞浸润和多数胰岛破坏，残余胰岛显示严重胰岛炎；而CB-sEVs处理组显示胰岛炎减轻、胰岛结构保留，浸润T细胞减少。这些发现表明CB-sEVs通过减轻T细胞诱导的胰岛损伤来预防T1D发病。
*CB-sEVs通过抑制人PBMC增殖发挥抗炎功能*：使用CFSE标记的人PBMC和抗CD3/CD28磁珠模拟T细胞活化和增殖，CB-sEVs在40 μg/mL剂量下显著抑制PBMC增殖约25%，在80 μg/mL剂量下抑制超过50%。PI染色排除CB-sEVs诱导细胞凋亡的可能性，数据表明CB-sEVs不影响细胞活力但抑制细胞增殖。细胞因子分析显示，CB-sEVs处理组中Th1相关炎性细胞因子IFN-γ和TNF-α水平显著降低，Th17相关炎性细胞因子IL-17A受到抑制。Th2相关抗炎细胞因子也显示类似降低。总体上，CB-sEVs抑制T细胞增殖并降低炎性细胞因子水平。
*CB-sEVs抑制T细胞活化并调节T细胞亚群*：流式细胞术分析显示，40 μg/mL CB-sEVs处理后活化CD4?HLA-DR?和CD8?HLA-DR? T细胞百分比降低约15%，80 μg/mL时降低25%。记忆T细胞标志物评估显示，CB-sEVs处理显著增加初始CD4? T细胞（CD4?CD45RO?CCR7?，CD4? Tn）比例，而CD4?效应记忆T细胞（CD4?CD45RO?CCR7?，CD4? TEM）频率显著降低。CD4?中央记忆T细胞（CD4?CD45RO?CCR7?，CD4? TCM）百分比在高剂量（80 μg/mL）时适度降低。在门控CD8? T细胞中观察到类似趋势，初始CD8? T细胞显著增加，CD8? TCM和CD8? TEM细胞在CB-sEVs处理后降低。这些发现表明CB-sEVs可通过下调活化CD4?和CD8? T细胞并同时增加初始CD4?和CD8? T细胞比例来缓解T1D进展。
*CB-sEVs的miRNA谱*：研究人员从四份不同健康脐带血样本中分离CB-sEVs并对其miRNA谱进行测序分析。热图显示了CB-sEVs中表达最高的50个miRNA，qRT-PCR分析验证了所选microRNA序列结果。GO富集结果显示，BP类别中最富集的术语是RNA聚合酶II启动子转录的正调控；CC类别中显著术语包括细胞质和核质；MF类别中显著术语为激活素结合和配体依赖性核受体转录共激活因子活性。KEGG分析显示，与所鉴定miRNA最常相关的通路为癌症相关通路、MAPK信号通路和PI3K-Akt信号通路。研究人员进一步分析了miRNA靶标相互作用并构建了调控网络，miR-16、miR-126-5p、miR-126-3p和miR-142-3p的靶基因富集于前十KEGG通路，转录因子MYC、TCF12、BRD4和EP300显著调控CB-sEVs的microRNA。
**讨论与结论**
讨论部分指出，T1D是一种异质性疾病，其发病、进展速度和免疫特征在患者间存在差异。免疫靶向治疗通常在早期或症状前阶段最为有效，此时残余β细胞质量尚存且自身反应性T细胞分化程度较低。本研究聚焦于糖尿病前期小鼠，模拟了这种早期干预，与延缓疾病发病在广泛β细胞丢失之前更为可实现的临床证据一致。近年来，基于sEVs的疗法已成为传统细胞疗法的有前景替代方案，具有多项转化和安全性优势。与干细胞移植不同，sEVs不会植入宿主组织，从而最大限度地降低了不受控制的增殖和肿瘤发生的风险。在各种sEVs来源中，脐带血干细胞来源的sEVs因其易于获取而作为T1D治疗候选者受到显著关注。MSC来源的sEVs可改善高血糖、保护胰腺完整性，同时刺激胰岛细胞增殖和胰岛素生物合成。CB-SC来源的sEVs已被证明可诱导抗炎M2巨噬细胞分化，有助于在人类T1D患者中观察到的治疗效果。此外，CB-Treg扩增培养基来源的sEVs在体外表现出免疫抑制活性，调节人T细胞表型，促进抗炎巨噬细胞（M2）分化，并减少炎性细胞因子IL-6的产生。除干细胞来源的sEVs外，从脐带血血浆中分离的sEVs因其组织再生特性而受到关注。然而，脐带血血浆中存在的sEVs是否可应用于T1D治疗仍不清楚。本研究从人脐带血中收集sEVs并确认了其在T1D背景下的抗炎作用，这些发现突显了脐带血来源sEVs作为T1D未来治疗策略的潜在应用。T细胞被认为在T1D发病机制中发挥核心作用。多种靶向T细胞的治疗策略已在T1D中开发，但其在人类患者中的成功率有限。先前研究表明新发T1D患者中胰岛抗原特异性CD4? TEM细胞增加，T1D患者初始和TCM细胞百分比和绝对数量均降低，而终末分化效应记忆T细胞显著升高。本研究中，研究人员使用抗CD3和抗CD28磁珠模拟抗原经历过程，观察到T细胞增殖并分化为终末记忆阶段。值得注意的是，CB-sEVs治疗抑制了T细胞增殖和活化，同时保留初始T细胞。miRNA是一类内源性小非编码RNA，通过诱导mRNA降解或抑制翻译来调控基因表达。越来越多的证据强调miRNA在T1D发病机制中的关键作用。miRNA谱分析显示CB-sEVs富集了多种免疫调节miRNA，包括miR-16、miR-126、let-7和miR-142，这些miRNA可能共同贡献于观察到的免疫应答调节效应。值得注意的是，miR-16在T1D患者样本中降低，并与β细胞保护相关。此外，miR-16已被证明可显著抑制小鼠模型中CD8? T细胞增殖和终末记忆T细胞分化。同样，miR-126与T1D和效应T细胞调控相关。此外，miR-142-3p和let-7d也已被鉴定为Treg来源EVs中的免疫调节miRNA，分别介导对常规CD4? T细胞增殖和活化以及Th1细胞增殖和IFN-γ产生的抑制。总体而言，这些miRNA的富集表明CB-sEVs可能通过多种非冗余的miRNA介导途径调节免疫应答。KEGG通路分析进一步表明这些miRNA可能靶向涉及细胞周期阻滞和免疫信号的通路，突显了CB-sEVs介导延缓T1D发病的机制基础。本研究存在若干局限性：尽管miRNA谱分析揭示了CB-sEVs中丰富的miRNA，但应进行经和未经CB-sEVs处理的T细胞的全面转录组分析以评估sEVs的靶基因；高剂量CB-sEVs治疗（100 μg/只）已被证明可减轻过继转移T1D小鼠模型中的T细胞应答，但更高剂量的效果尚未探索；本研究主要采用共转移过继转移模型而非治疗已建立糖尿病的小鼠，该模型虽有助于评估CB-sEVs在T1D发展过程中的免疫调节作用，但不能完全再现临床环境中治疗干预通常在疾病发病后开始的场景；CB-sEV给药基于总sEV蛋白而非颗粒数，颗粒与蛋白比率及相应颗粒剂量未确定，可能限制精确剂量标准化和跨sEV制剂的可比性；脐带血可用性有限以及分离足够sEVs（5–50 mg/kg）的挑战对深入研究和推进CB-sEVs作为治疗剂的临床转化构成重大障碍。综上所述，本研究证明CB-sEVs治疗糖尿病前期小鼠可通过抑制胰岛浸润T细胞增殖有效延缓T1D发病。对人T细胞的进一步分析揭示了类似效果，包括T细胞增殖减少、T细胞活化抑制、初始和中央记忆T（TCM）细胞百分比增加以及效应记忆T（TEM）细胞百分比降低。miRNA谱分析为CB-sEVs的生物活性成分提供了有价值的见解，值得进一步研究其具体作用。总之，这些发现通过使用CB-sEVs为T1D和其他自身免疫性疾病提出了一种有前景的治疗策略。
