《EMBO REPORTS》：Tunnelling nanotube-like intercellular projections are druggable mediators of cancer-niche crosstalk
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癌细胞与其微环境之间相互作用的细胞间连接（intercellular connections, ICCs）研究尚不充分。本研究开发了三维共培养类器官（3D co-culture organoids）以探究ICCs在耐药性（drug resistance）中的作
癌细胞与其微环境之间相互作用的细胞间连接（intercellular connections, ICCs）研究尚不充分。本研究开发了三维共培养类器官（3D co-culture organoids）以探究ICCs在耐药性（drug resistance）中的作用。研究人员构建了一种无动物源成分的模拟骨髓（bone marrow, BM）的玻连蛋白–海藻酸盐–层粘连蛋白（Vitronectin–Alginate–Laminin, VAL）水凝胶（hydrogel），该水凝胶具有代表人骨髓的黏弹性（viscoelastic properties）。VAL水凝胶支持间充质基质细胞（mesenchymal stroma cells, MSCs）的培养、患者来源急性淋巴细胞白血病（acute lymphoblastic leukaemia, ALL）细胞的植入与扩增，并由此形成三维共培养类器官。研究发现，ALL治疗药物，如地塞米松（dexamethasone）和BCL2抑制剂（ABT-199），或其联合使用，可诱导ALL细胞与MSCs之间形成隧道纳米管（tunnelling nanotube, TNT）样突起（projections）。在N-钙黏蛋白（N-cadherin）拮抗剂ADH-1存在时，这些TNT样突起消失。最终，研究揭示地塞米松、ABT-199和ADH-1三联药物组合可有效杀伤ALL细胞。地塞米松-ABT-199-ADH-1联合方案在不同高危患者来源异种移植（patient-derived xenograft, PDX）ALL样本中显示出高效性。总之，本研究呈现了ALL-骨髓组织样类器官（ALL-BM-tissue-like organoids），并利用其揭示了破坏癌症-MSC间TNT样ICCs以增强药物疗效的见解。
**研究背景与问题**
治疗耐药性是改善癌症患者预后的主要障碍，在白血病中尤为突出，初始治疗耐药和获得性耐药限制了当前疗法的疗效，导致患者预后不佳。白血病细胞与其周围骨髓微环境之间的相互作用支持疾病演化和治疗耐药，骨髓龛（BM niche）为白血病细胞提供了逃避治疗的保护性环境，并进一步支持耐药表型的出现。多种非细胞自主机制参与了龛驱动的治疗耐药，包括通过直接细胞–细胞接触的基质信号传导以及远距离细胞间细胞间连接（ICCs）的形成。ICCs通过被称为隧道纳米管（TNTs）的膜性突起介导细胞器在远距离细胞间的直接交换，这些TNTs调控细胞行为和功能，在癌症中发挥重要的保护作用。然而，尽管TNTs在恶性肿瘤（包括白血病）中具有重要意义，临床上靶向TNTs及类似癌症-基质ICCs的手段仍探索不足。部分原因是缺乏仿生且可操作的3D类器官组织样系统来模拟这种管状、三维的肿瘤-宿主ICCs。此外，监管机构近期指南强调在人体新疗法评估前尽量减少动物实验，并重视工程化新的人源相关非动物系统用于药物研究。血液恶性肿瘤尤其需要疾病相关的替代模型，因为生理相关的体外模型匮乏。尽管人类细胞技术和先进类器官平台取得了显著进展，但仍存在一些关键限制，包括需要简化、可塑、无动物源成分且化学定义的细胞外基质（ECM）配方，并具有生理相关的力学特性，从而更适合研究细胞–细胞串扰及与ECM的相互作用。
**研究开展与结论**
为解决上述方法和知识空白，研究人员工程化了一种新型水凝胶基3D系统，使得患者来源高危B细胞急性淋巴细胞白血病（ALL）细胞能够在模拟人骨髓的环境中共培养。研究人员进一步利用该模型揭示了癌症-龛串扰的新见解，如TNT样ICCs，并揭示了改善治疗敏感性的可操作策略。研究表明，VAL水凝胶整合了层粘连蛋白和玻连蛋白，具有与人骨髓组织相当的黏弹性特性（尽管处于组织力学特性的较低端）。VAL水凝胶支持iMSCs培养、中性粒细胞分化、HSPCs短期扩增，并重现了允许患者来源白血病细胞植入的致癌环境。利用VAL-iMSC-ALL共培养，研究人员探索了癌症-ECM-MSC相互作用，发现ALL-MSC串扰在地塞米松和ABT-199治疗存在下至少部分通过TNT样突起的形成来实现。值得注意的是，治疗诱导的PDX-ALL-iMSC TNT样结构在N-钙黏蛋白拮抗剂ADH-1处理后消失。研究人员进一步鉴定了地塞米松-ABT-199-ADH-1三联药物组合在体外直接靶向治疗诱导的白血病-龛TNTs的协同效应。该研究的意义在于提供了人源骨髓样类器官模型，可用于高通量ALL-MSC药物筛选，并为在生物相关复杂3D format中进一步分析癌细胞与周围微环境之间的ICCs提供了起点。
**关键技术方法**
研究人员采用的主要技术方法包括：开发无动物源成分的玻连蛋白–海藻酸盐–层粘连蛋白（VAL）水凝胶并通过傅里叶变换红外光谱（FTIR）、扫描电子显微镜（SEM）和旋转流变学对其进行物理化学表征；利用人诱导多能干细胞（hiPSCs）分化为间充质干细胞（iMSCs）并与PDX-ALL细胞建立三维共培养类器官；采用共聚焦活细胞成像和Ridge Detection插件定量分析TNT样突起；通过流式细胞术检测CDH2/N-钙黏蛋白表达及活性氧（ROS）水平；使用SynergyFinder软件进行药物联合 synergy 评分分析。样本队列来源包括Newcastle PDX-ALL Biobank提供的PDX-ALL样本（L707、L49120、MS40、iAMP21、L4967等）以及VIVO Biobank提供的一例原代ALL样本。
**研究结果**
**合成VAL水凝胶维持人骨髓的力学特性**：通过FTIR鉴定VAL中藻酸盐键类型，SEM显示层粘连蛋白和玻连蛋白成功整合于水凝胶结构中，旋转流变学测量表明储能模量在交联过程中增加而损耗模量保持不变，储能模量持续高于损耗模量，证明VAL具有抵抗变形和保持物理交联的能力，其力学特性处于人骨髓组织范围的低端。
**VAL水凝胶支持关键骨髓功能如hiPSC来源MSC（iMSC）支持和中性粒细胞生成**：iMSCs在VAL中培养14天后形成球状聚集体，活细胞计数较常规2D培养显著增加，且恢复的iMSCs保留关键间充质标志物表达（NES mRNA水平在3D VAL培养中更高）。利用CD34+ HSPCs在VAL水凝胶中可生成约50% CD15+CD66b+中性粒细胞，其中超过40%表达成熟标志物CD16，超过85%表达CD11b。
**VAL预适应诱导PDX-ALL细胞在地塞米松处理后上调N-钙黏蛋白**：PDX-ALL细胞在VAL水凝胶中形成聚集体并与层粘连蛋白样带状结构结合，在3D-VAL培养中较无VAL悬浮培养表现出增强的增殖能力（短期和>14天培养）。VAL预适应14天的PDX-ALL细胞上调CDH2表达，在地塞米松处理21天后上调N-钙黏蛋白表达。
**治疗诱导的TNT样细胞间连接形成并可被N-钙黏蛋白阻断靶向**：SEM和免疫荧光显示PDX-ALL细胞与iMSCs在VAL-iMSC模型中的黏附，VAL-iMSC类器官支持两种高危原代ALL样本的短期生长以及五种不同遗传亚型PDX-ALL样本超过21天的显著扩增。PDX-ALL细胞与VAL-iMSC类器官共培养时对地塞米松的敏感性低于无iMSC的VAL水凝胶共培养。在无处理条件下未观察到PDX-ALL细胞与iMSCs之间的TNTs或类似ICCs；地塞米松（10 nM）处理诱导共培养中形成长纳米管样细胞间突起（ALL-to-iMSC、ALL-to-ALL及iMSCs之间）；ABT-199（100 nM）单药或与地塞米松联合未导致iMSC-ALL TNT样突起的可见变化；ADH-1（150 μM）处理或与地塞米松、ABT-199或其组合联合处理后，ALL-iMSC TNT样突起消失。
**N-钙黏蛋白阻断改善VAL-iMSC-ALL类器官中地塞米松/ABT-199的疗效**：ADH-1对TERT-MSCs无剂量依赖性反应，PDX-ALL细胞在VAL-iMSC共培养中的反应与VAL-TERT-MSC共培养相当。三种高危PDX-ALL样本（L707、L4967、L49120）与VAL-iMSC类器官共培养时对ADH-1联合地塞米松和ABT-199敏感。SynergyFinder分析采用Bliss、Loewe、ZIP和HSA四种参考模型，地塞米松-ABT-199-ADH-1联合处理L707样本的synergy评分均大于10，三种药物组合在临床可转化药物浓度下最大协同区域（MSA）评分约为30。
**讨论部分总结**
尽管骨髓微环境在调控白血病生物学包括治疗反应中的作用已被证实，但靶向龛赋予的治疗耐药仍是一个挑战，尤其包括白血病-MSC ICCs的研究及临床靶向。研究人员开发了VAL作为无动物源成分的骨髓模拟水凝胶原型，并建立了VAL-ALL-iMSC共培养类器官，发现地塞米松和/或ABT-199诱导ALL细胞向iMSCs形成TNT样突起，而加入N-钙黏蛋白拮抗剂ADH-1后这些突起消失。研究提供了概念验证证据，表明地塞米松-ABT-199-ADH-1三联药物组合在ALL与MSCs及BM-ECM模拟VAL水凝胶共培养中有效，可能允许靶向微环境诱导的TNT样ICCs。研究还指出，骨髓微环境固有复杂，除间充质龛外还包括窦状和免疫龛组分，所描述类器官方法的进一步发展将使其更具仿生性并可能扩展应用范围。ALL具有高度异质性，确认该模型支持更广泛疾病亚型样本的体外培养将很有价值。
**研究结论翻译**
总之，研究人员已证明其人源骨髓样类器官模型适用于较高通量的ALL-MSC药物筛选，并为在生物相关复杂3D format中进一步分析癌细胞与其周围微环境之间的ICCs提供了起点。
