基于脂质纳米颗粒（LNP）的mRNA递送系统在肿瘤精准治疗中的应用：从免疫治疗策略到临床转化挑战

《Discover Nano》：Lipid nanoparticle-based mRNA delivery system for cancer management

基于信使RNA（mRNA）的治疗策略已深刻变革肿瘤治疗格局，尤其是在脂质纳米颗粒（LNP）赋能的mRNA疫苗取得成功之后。LNPs是有效的非病毒递送载体，可保护mRNA、增强细胞内递送并提升治疗安全性。本综述讨论了LNP介导的mRNA疗法的最新进展，包括mRNA疫苗、细胞因子递送、免疫调节及基于嵌合抗原受体（CAR）的策略。脂质配方的创新与高通量技术提升了递送效率。本文亦探讨了LNP-mRNA制剂如何激发免疫应答并改善肿瘤微环境。研究重点介绍了具有前景的个性化mRNA疫苗与疗法。然而，组织特异性、免疫原性与生产制造等挑战依然存在。脂质工程与个性化医学领域的新兴策略旨在解决上述问题，使LNP介导的mRNA疗法成为精准肿瘤学的关键手段。本报告对LNP-mRNA疗法在肿瘤治疗中的最新进展进行了全面综述，同时重点介绍了近期创新与临床试验，进一步强调了LNP-mRNA疗法在临床转化中的局限性与挑战，最后概述了基于LNP的mRNA疗法在个性化肿瘤治疗中的前景。

1 肿瘤免疫治疗概况。肿瘤仍是21世纪最重大的公共卫生问题之一，预计到2040年全球新增病例将达2800万、死亡1620万。人口老龄化、不良生活方式、环境暴露及感染相关恶性肿瘤是推动全球癌症负担加重的主要原因。传统化疗和放疗给患者带来严重的躯体和心理困难，且化疗可能诱发突变产生新抗原表位从而增加肿瘤抗原性。肿瘤免疫治疗始于1891年William B. Coley的链球菌注射试验，尽管当时饱受质疑，但现代免疫学研究已证实其理论正确性，Coley被誉为肿瘤免疫治疗之父。当前免疫治疗是利用机体免疫系统对抗肿瘤的前沿手段。正常情况下免疫系统可基于肿瘤相关抗原（TAAs）识别并清除浸润健康组织的肿瘤细胞，但肿瘤细胞可通过四种主要免疫逃逸机制规避识别：下调表面抗原表达降低免疫原性；上调表面免疫检查点抑制T细胞活性；招募调节性T细胞（Treg）和髓系来源抑制细胞（MDSCs）等抑制性免疫细胞及细胞因子构建抑制性免疫微环境；释放毒性酸性代谢物阻碍免疫细胞活性。现代肿瘤免疫治疗旨在建立强大的T细胞驱动的肿瘤-免疫循环：肿瘤细胞释放TAAs，抗原呈递细胞（APCs）加工抗原并经主要组织相容性复合体（MHC）分子呈递，激活初始T细胞并促进肿瘤特异性细胞毒性T淋巴细胞（CTLs）增殖。
2 肿瘤免疫治疗类型。肿瘤免疫治疗类型多样，主要包括：结合肿瘤特异性标志物启动免疫应答的单克隆抗体；阻断免疫检查点的检查点抑制剂；对患者T细胞进行基因修饰以靶向肿瘤的嵌合抗原受体（CAR）T细胞疗法。其他策略包括利用病毒杀伤肿瘤细胞并促进免疫的溶瘤病毒疗法；使用白细胞介素等免疫增强蛋白的细胞因子疗法；肿瘤疫苗（预防性或治疗性）及肿瘤浸润淋巴细胞等过继性细胞转移方法。各类型以独特方式增强免疫应答以对抗肿瘤。例如在多发性骨髓瘤（MM）患者中CAR-T细胞治疗效果良好；免疫检查点治疗中PD-1抗体已展现强大治疗潜力和临床价值，可显著改善总生存期和无进展生存期。针对抑制性免疫检查点CTLA-4和PD-1的单克隆抗体经探索优化后，通过在免疫循环多个阶段促进免疫激活产生显著抗肿瘤作用。白细胞介素2（IL-2）是目前唯一可治愈转移性肾细胞癌（RCC）患者的全身性药物，1985年首次报道IL-2可诱导转移性RCC客观治疗反应，1992年美国FDA基于多项试验中完全缓解的持续性批准高剂量IL-2用于转移性RCC治疗。此外，CAR巨噬细胞疗法在实体瘤临床前模型中展现令人鼓舞的结果，将CAR技术与脂质纳米颗粒整合用于体内巨噬细胞工程的平台已被证明可产生具有持久杀瘤活性的促炎性CAR巨噬细胞，作为肾细胞癌的成功治疗手段。
3 mRNA作为肿瘤治疗工具。3.1 mRNA结构与功能。mRNA暂存从DNA转录指导蛋白质合成的遗传信息，几乎涉及细胞生物学各个方面。转录产物由核糖核苷酸与磷酸基团及四种含氮碱基（腺嘌呤、鸟嘌呤、尿嘧啶和胞嘧啶）组成。加工前mRNA含编码区（外显子）和非编码区（内含子），剪接去除内含子并连接外显子，前体mRNA修饰还包括3'端多聚腺苷酸化及5'端7-甲基鸟苷加帽。3'多聚腺苷酸尾有助于稳定和促进mRNA转运，5'帽保护其免受降解。治疗性mRNA的结构设计是决定其稳定性、翻译效率和临床性能的关键因素，各结构组件经策略性优化以最大化蛋白表达同时最小化降解和不良免疫激活。5'帽结构特别是Cap 1构型可保护mRNA免受核酸外切酶介导的降解并辅助真核翻译起始机制，Cap 1还降低先天免疫受体激活从而提高翻译效率。5'和3'非翻译区（UTRs）通过与被细胞RNA结合蛋白相互作用调控mRNA稳定性、核糖体招募和转录本半衰期，合理选择和工程化UTR序列可大幅增加蛋白产量。密码子优化通过与宿主细胞tRNA池匹配增强翻译，减少核糖体暂停并限制抑制性二级结构而不改变氨基酸序列。修饰核苷 incorporation，最常用N1-甲基假尿苷（m1Ψ），可抑制Toll样受体和胞质RNA传感器等模式识别受体的识别，同时改善mRNA稳定性和翻译能力。poly(A)尾在治疗性构建体中通常维持100-150个核苷酸，有助于转录本稳定性、促进制造过程中的核输出并通过与poly(A)结合蛋白相互作用促进高效翻译。上述结构元件的优化整体上增强了细胞内持久性、增加了蛋白表达并改善了mRNA疗法在传染病疫苗、肿瘤免疫治疗和蛋白替代疗法等应用中的安全性和有效性。
3.2 mRNA疗法的优势。mRNA技术使疫苗和治疗药物的生产比传统方法更快速、更经济，近期mRNA药物应用日益增多。mRNA作为治疗分子在蛋白替代疗法、病毒疫苗、肿瘤免疫治疗和基因组编辑中具有巨大潜力，许多治疗在临床前研究中展现出令人鼓舞的疗效，如编码肿瘤抗原用于肿瘤疫苗、编码细胞因子用于免疫治疗、编码肿瘤抑制因子预防肿瘤发展、编码嵌合抗原受体用于工程化T细胞治疗及编码基因组编辑蛋白用于基因治疗。体外转录（IVT）mRNA用于多能干细胞生产、IVT mRNA编码设计核酸酶的基因组工程及IVT mRNA体内递送替代或增强蛋白等创新技术亦不断涌现。mRNA疗法为包括免疫相关和非免疫性疾病在内的多种疾病提供了新途径。尽管COVID-19疫情期间mRNA疫苗取得进展，但由于设计和管理欠佳，成功转化为临床应用仍然有限。mRNA药物在免疫治疗和非免疫治疗中具有独特特征，年龄、性别、疾病和病史等个体因素可影响其疗效和安全性，但仍缺乏对mRNA药物在个性化受者中结局的系统认识。近期mRNA工程和递送进展已大幅解决mRNA稳定性、免疫原性、体内分布及跨越不同生物屏障能力等问题。此外，基于脂质纳米颗粒（LNP）的mRNA疫苗的潜在长期效应应在已确立的生物机制和当前科学证据背景下解读。LNPs保护mRNA免于快速降解并促进其递送至宿主细胞，SARS-CoV-2刺突蛋白的瞬时翻译引发适应性免疫应答。产生的蛋白合成、mRNA分子和表达的抗原均通过正常细胞过程自然降解，mRNA不整合入宿主基因组。临床和临床前研究表明LNPs经历暂时性生物分布并诱导先天免疫信号通路的短暂激活，这有助于疫苗效力。尽管这些生物过程值得继续研究以更好理解罕见或持续性不良事件，但当前临床和流行病学数据尚未发现与LNP介导的mRNA疫苗递送直接相关的长期病理效应的一致性证据。持续的药物警戒和长期随访对检测罕见安全信号仍至关重要，但累积证据表明mRNA疫苗接种在减少重症COVID-19、住院和死亡方面的益处继续大幅超过罕见不良事件的风险。此外，临床试验和上市后监测一致显示mRNA COVID-19疫苗具有良好安全性特征，最常见报告的不良反应轻微且自限，包括注射部位疼痛、疲劳和头痛。严重不良事件罕见，包括心肌炎和心包炎，主要发生于12-29岁男性，BNT162b2估计发生率为每百万剂8-15例，mRNA-1273为每百万剂6-10例。虽多数疫苗相关心肌炎病例病程轻微并经支持治疗缓解，但仍需进一步长期随访研究以更好表征其长期结局。
3.3 基于mRNA的肿瘤治疗疫苗。肿瘤治疗mRNA疫苗的最新进展迅速且引起强烈研究兴趣。肿瘤疫苗开发与其他传染病疫苗基本相似，包括mRNA、DNA、树突状细胞、全细胞和抗原疫苗。技术进步改善了mRNA稳定性和特异性激活免疫应答的递送方法，导致临床转化成功率提高。mRNA疫苗的进展通过限制肿瘤生长和转移有利于提高生活质量；此外，有限副作用、快速生产和针对广泛抗原的有效性为疫苗高需求的出现开辟了途径。与DNA疫苗相比，mRNA疫苗令人印象深刻，因其可诱导针对广泛抗原和生长因子的免疫应答，易于递送且可容易修饰以产生缺陷酶、激素、抗体和细胞培养蛋白用于递送至细胞。mRNA递送至细胞质而非细胞核，因此mRNA疫苗使用非整合平台，规避插入突变风险并由生理细胞过程控制。由于mRNA半衰期短暂，需要载体保护mRNA免受RNase酶促破坏。为控制所需蛋白，mRNA必须逃逸内体，载体必须可靶向以实现特定治疗效果。研究人员已开发多种mRNA纳米载体递送系统，包括蛋白衍生物、脂质、聚合物和纳米颗粒（NPs）。mRNA疫苗激活体液免疫和细胞免疫，这对于激活和维持抗肿瘤应答至关重要。与其他免疫疗法联合，mRNA疫苗是未来肿瘤管理的有前景的治疗候选。裸mRNA分子经纳米颗粒修饰，这一有前景的工具可实现安全递送和高效细胞摄取、防止酶促降解并允许mRNA疫苗的控释。脂质基纳米颗粒在mRNA疫苗中显示最佳结果，因其疏水核心保护mRNA，实现高效疫苗递送和受控细胞内释放。聚合物、肽和鱼精蛋白的表面修饰提供靶向药物递送优势。各种合成和天然聚合物设计保护裸mRNA免受降解。肽和鱼精蛋白纳米复合物因表面修饰具有高效细胞穿透能力。基于mRNA的肿瘤治疗通过激活免疫系统对抗肿瘤抗原来攻击肿瘤细胞。体外转录从含必需序列（包括RNA聚合酶识别的启动子）的DNA模板合成mRNA。5'帽对mRNA稳定性和翻译至关重要；因此转录过程中在酶帮助下形成与天然mRNA高度相似的合成mRNA。修饰的5'帽结构有助于降低免疫原性并防止核酸外切酶降解。3' poly A尾与poly(A)结合蛋白的相互作用有助于翻译效率，确保对肿瘤细胞的有效应答。递送载体经封装以确保对肿瘤细胞的靶向递送和抗RNase保护。含可电离脂质和聚乙二醇的脂质纳米颗粒用于mRNA疫苗可增加循环时间、降低免疫识别并防止纳米颗粒过早清除。mRNA疫苗通过多种途径给药以获得最佳治疗效果，如静脉（广泛分布）、皮下（局部全身应答）、瘤内（靶向肿瘤细胞实现局部免疫应答）和肌内（强全身应答）。mRNA疫苗机制涉及宿主细胞将mRNA翻译为肿瘤特异性抗原，蛋白与主要组织相容性复合体结合并展示于靶器官细胞表面。树突状细胞吸收mRNA、翻译为蛋白并将抗原呈递于细胞表面以被T细胞识别。MHC分子呈递肿瘤抗原进一步激活细胞毒性T细胞增殖，有助于破坏肿瘤细胞。此外，活化T细胞释放的细胞因子进一步加强针对肿瘤细胞的免疫应答。mRNA疫苗可通过激活先天和适应性免疫应答实现全面抗肿瘤效果。引入的mRNA被TLR3和TLR7/8等Toll样受体识别，导致先天免疫应答激活。先天免疫激活过程中促炎细胞因子和干扰素的释放也刺激适应性免疫系统。肿瘤相关抗原经加工并通过MHC分子呈递于细胞表面。CD4+辅助T细胞和CD8+细胞毒性T细胞的免疫应答消除肿瘤细胞特异性抗原。因此，通过接合免疫系统两大分支，基于mRNA的肿瘤疫苗是抗肿瘤细胞的潜在治疗选择。静脉给予添加阳离子和阴离子脂质的纳米颗粒促进器官特异性药物递送，有助于靶向特异性免疫激活。近期报道显示使用淋巴结特异性可电离脂质产生强CD8+ T细胞应答，显示基于mRNA的肿瘤疫苗疗效改善。使用电穿孔mRNA疫苗的树突状细胞和脂质复合物刺激免疫应答并有助于细胞摄取。mRNA疫苗开发的主要挑战是鉴定用于激活免疫应答的肿瘤特异性抗原。肿瘤特异性抗原或源于突变或为新抗原。选择负责编码肿瘤抗原的匹配mRNA序列是人工合成具有免疫原性、翻译能力和稳定性的mRNA序列所必需的。佐剂或细胞因子也附着于mRNA疫苗以增强免疫应答。细胞因子释放调节免疫细胞活性，佐剂激活抗原呈递细胞以支持免疫应答。通过激活细胞毒性T细胞，肿瘤细胞被识别和杀伤；然而mRNA疫苗除触发针对肿瘤细胞的急性免疫应答外，还可诱导针对肿瘤抗原的记忆应答以产生持久免疫记忆。针对肿瘤细胞开发记忆推进了mRNA疫苗并有助于预防肿瘤复发。渐进技术通过减少不良反应、增加效力和改善患者结局提高mRNA肿瘤免疫治疗疗效。对于不能单纯通过手术治愈的恶性肿瘤，mRNA肿瘤疫苗可被认为有效，因其具有激发全身免疫应答的潜力。据Fu等报道，mRNA肿瘤疫苗平台可大致分为三类：3.3.1 非复制型mRNA。这一传统方法使用含真核mRNA片段的简单mRNA分子，包括5'帽、3'和5'非翻译区、poly(A)尾和一个或少数开放阅读框。3.3.2 自扩增mRNA（SAM）。源自单链mRNA（如弹状病毒、Semliki-Fowlkes病毒、Sindbis病毒），以提供延长抗原生产和低剂量需求著称。然而该平台易受多种降解RNase影响且细胞内化效率不高。将病毒复制颗粒作为递送载体掺入自扩增mRNA已报道可引起毒性、感染和针对病毒颗粒的免疫激活。研究人员生产缺陷型VRP以降低感染风险。药物递送平台还包括合成载体和保留质粒递送分子的DNA启动SAM复制子（DREP）。自扩增mRNA也通过聚乙烯亚胺、脂质纳米颗粒和pabol等载体递送以提高感染风险安全性。3.3.3 反式扩增mRNA（taRNA）。该平台有两个组件：载体盒和复制酶。与自扩增mRNA相比，该平台据报道提供安全性、灵活性和易开发性。它允许独立优化反式复制子和复制酶作为载体，维持复制子的结构完整性和翻译效率。免疫应答因翻译效率增加而增强。由于taRNA载体系统的分裂现象，具有更好的储存和运输潜力。它比自扩增mRNA平台在更低剂量下更有效工作。通过大规模生产插入所需药物所需的编码复制酶载体，可增加针对肿瘤的taRNA疫苗生产。此外，膜结合细胞外囊泡（EVs）也已成为有前景的mRNA递送平台。EVs通过细胞生物发生途径形成，含富含蛋白、脂质和核酸的脂质双层。其良好的膜通透性和屏蔽货物免于变质的固有能力使其成为mRNA递送的优秀候选。EVs还提供多种优势，包括低免疫原性、足够的RNA运输能力、内在组织靶向潜力及跨越生理屏障的能力。这些特性使其成为开发基于mRNA的治疗和疫苗的有吸引力的候选。它们通过内吞、膜融合和其他摄取途径等机制将货物递送至受体细胞，实现高效细胞内mRNA转移。此外，其潜力可通过化学或基因工程修饰增强。尽管有潜力，若干挑战限制EV基递送系统的临床转化，包括低产量、纯化困难、异质性、有限货物装载效率和储存稳定性。当前研究集中于改进通过内源性（细胞介导）和外源性（分离后）装载策略将治疗性mRNA包装入EVs的方法，同时保持EV完整性和递送效率。
4 基于脂质纳米颗粒的mRNA肿瘤治疗。过去二十年纳米技术提供了具有独特理化特性和小于100 nm尺寸的一系列纳米材料。纳米载体能够装载靶分子以保护并将其递送至疾病部位。为实现治疗效力，mRNA必须到达靶细胞并表达足够蛋白，因此开发有效递送系统必要且关键。mRNA最常用的纳米载体包括脂质体、树枝状聚合物、聚合物、碳纳米材料、石墨烯纳米颗粒、细胞外囊泡和脂质纳米颗粒。其中脂质纳米颗粒因具有所需理化和生物学特性（包括生物相容性、生物可降解性和无毒性）而受青睐。脂质纳米颗粒作为纳米载体时mRNA递送已显示有前景的治疗潜力，因此目前许多mRNA疫苗开发工作集中于脂质纳米颗粒作为载体。文献表明LNPs关键依赖其脂质组件的结构和理化特性。可电离脂质的表观pKa通常由TNS荧光测定法确定，是效力的主要决定因素，最佳值一般在6.0至7.0之间。在此范围内脂质在生理pH下基本保持中性，从而降低毒性和非特异性相互作用，但在酸性内体环境（pH约5-6）中充分质子化以促进mRNA复合和膜去稳定化，促进胞质释放。偏离该pKa窗口可使效力降低几个数量级。值得注意的是配制LNP的pKa通常比游离可电离脂质低2-3个单位，反映脂质环境和质子溶剂化效应的影响。Carrasco等（2021）发现疏水尾结构进一步调节LNP性能。支链尾（无论对称或末端定位）常比同等碳长度线性等效物赋予优势，通过降低核心疏水性、降低表面电荷并改善胶体稳定性和融合性。特定支链设计如CL4F 8-6增加内部微粘度，导致更好的储存稳定性和肝脾中更高蛋白表达。较短尾可促进脾趋向性，而分支支持锥形分子几何结构有助于内体膜破坏。高效将mRNA分布至特定细胞类型和组织是必要的。近期研究使用脂质纳米颗粒（LNPs），其为短干扰RNA（siRNAs）的有效载体。mRNA分子常使用LNPs递送。然而关于转基因表达动力学、生物分布和纳米颗粒载体药代动力学之间的度量关系知之甚少。在此背景下Di等（2022）报道掺入可裂解连接子（如酯、酰胺、脲或二硫化物）增强生物可降解性，因这些连接子经酶促或谷胱甘肽介导裂解为无毒代谢物。此类修饰减轻长期蓄积和毒性同时保持或改善递送效率。模块化合成方法包括定向进化策略已产生优化不对称脂质，在肝mRNA递送和基因编辑应用中优于不可降解基准。LNPs的药代动力学（PK）和生物分布及其对所得基因产物分布和动力学的后续影响尚未充分研究。先前研究通过六种不同途径检查mRNA LNP递送的转基因表达动力学但未涉及LNP PK。另一研究检查LNP大小与诱导免疫应答之间的潜在关系但未涉及 underlying原因或联系。辅助脂质包括胆固醇和PEG-脂质也发挥互补作用。辅助磷脂包括磷脂（1,2-二硬脂酰-sn-甘油-3-磷酸胆碱（DSPC））。DSPC提供结构刚性而1,2-二油酰-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺（DOPE）促进融合性（典型约10 mol%）。胆固醇（约38-45 mol%）通过填充酰基链空隙稳定颗粒并可被植物甾醇替代以有利于促进内体逃逸的多晶型结构。PEG-脂质（1-2 mol%），以ALC-0159或定制类似物为代表，控制粒径、抑制聚集、塑造蛋白冠（如白蛋白关联用于肝靶向）并控制影响摄取和细胞内运输的脱落速率。PEG-脂质结构的细微修饰已产生递送效率的大幅提升。除粒径（最佳50-150 nm）外，内体逃逸和生物分布相互依赖。较小LNPs通常表现增强的细胞摄取和转染，粒径也调节途径特异性分布（肌内与静脉）。内体逃逸仍是主要瓶颈，效率通常在2-10%范围，由pH依赖性电离和脂质介导的膜破坏驱动，常发生于回收或晚期内体中。总之这些参数决定组织嗜性——通常倾向于肝和脾但可通过尾设计、PEG组成或辅助脂质选择调整以实现肝外靶向。总之这些结构-活性原则为本节综述的研究提供背景并强调支撑临床成功（如mRNA疫苗）的设计策略同时为持续优化工作提供信息。近年来随着科学家和临床医生日益关注脂质纳米颗粒辅助mRNA治疗系统的潜力，肿瘤治疗发生显著转变。这些创新方法在不同肿瘤治疗中显示显著成功，提供靶向递送、增强疗效和改善患者结局的新策略。脂质纳米颗粒作为mRNA递送纳米载体用于肿瘤免疫治疗因保护mRNA有效载荷和提升细胞内递送效率的能力而获显著关注。研究人员探索不同方法优化mRNA编码疗法的开发和给药，解决该方法的挑战和局限。mRNA-脂质纳米颗粒框架的主要优势是其多功能性，允许开发广泛的免疫治疗策略，包括递送携带肿瘤相关抗原的mRNA以刺激抗原特异性免疫反应、表达细胞因子或检查点抑制剂以调节肿瘤微环境以及生成CAR-T（嵌合抗原受体T）细胞以精确消除肿瘤细胞。获批LNPs大多由可电离脂质、辅助脂质、胆固醇和PEG-脂质通过疏水和静电相互作用自组装产生。基于RNA的肿瘤免疫治疗高度有前景，因mRNA可定制产生任何蛋白并引发所需免疫活性。一种流行方法涉及给予编码肿瘤抗原的mRNA进行免疫。此外mRNA可工程化产生免疫调节蛋白和试剂或其他可修饰肿瘤相关环境并恢复免疫能力的生物活性蛋白。此外将mRNA与传统治疗方法整合提供有吸引力的肿瘤治疗途径。mRNA疗法通过增强肿瘤相关抗原（TAAs）在肿瘤治疗中发挥关键作用。为此mRNA必须有效递送至APCs，在那里触发TAAs或新抗原的产生。这些抗原与主要组织相容性复合体（MHC）分子结合于APCs表面并被T淋巴细胞识别。这种相互作用激活CD4+和CD8+ T淋巴细胞导致肿瘤细胞的靶向破坏。Oberli等精细调整编码OVA（卵清蛋白）、TRP2（酪氨酸酶相关蛋白2）或27位修饰糖蛋白100（gp100）的mRNA-LNP制剂以治疗B16F10肿瘤小鼠。所得mRNA-LNP系统诱导强抗原靶向CD8+ T细胞免疫活性并显著减少肿瘤进展。他们发现添加脂多糖可增强抗肿瘤效果和小鼠耐力。后续研究强调mRNA-LNP平台在递送广泛肿瘤抗原和新抗原方面的适应性，突显其个性化肿瘤免疫治疗的潜力。Islam等开发了能够同时刺激先天和适应性保护的聚合物-脂质杂合纳米颗粒平台，诱导强OVA专属CD8+ T细胞反应，报道在OVA表达淋巴瘤和前列腺癌小鼠中84%的肿瘤预防和60%的肿瘤进展减少。三阴性乳腺癌（TNBC）缺乏足够水平的ERs和PRs（雌激素和孕激素受体）及HER2s（人表皮生长因子受体）。Sha等显示编码四种新抗原的mRNA-LNPs可在小鼠中触发针对TNBC肿瘤的强抗原靶向CD8+ T细胞反应并显著延长生存期。针对TNBC他们开发了由药物和p53 mRNA封装于PAL和CAL脂质中的联合治疗。正交优化后使用原位TNBC裸鼠进行PAL-p53 LNPs的体外和体内筛选显示由于有利的联合效应比其他治疗组具有更大治疗潜力。他们还通过将编码OX40的mRNA封装于磷脂中解决该问题。基于细胞筛选选择PL1作为先导化合物并将mRNA封装于PL1 LNP进行体内分析。对A20荷瘤小鼠瘤内给药后PL1-OX40 LNPs相比接受PL1空LNPs或游离OX40 mRNA的对照组显著减少肿瘤生长。这些报道强调脂质纳米颗粒平台在有效递送多种mRNA治疗剂（包括肿瘤抗原、免疫调节剂和肿瘤抑制基因）以在多种肿瘤模型中引发强效抗肿瘤免疫活性方面的灵活性。Thran等使用mRNA-LNPs产生利妥昔单抗，在细胞和动物模型中确认其抗肿瘤性能。研究结果表明mRNA-LNPs在Raji细胞中比利妥昔单抗更有效抑制肿瘤，即使在较低剂量（50 μg相比200 μg静脉注射）给药时。同样Rybakova等创建抗HER2抗体（曲妥珠单抗）mRNA-LNPs，展示有效抑制HER2阳性肿瘤生长。在肝细胞癌模型小鼠中脂质纳米颗粒已显示显著增加CD44+CD3+CD4+ T辅助细胞向肿瘤的浸润并增强IFNγ产生导致显著肿瘤抑制。虽然细胞因子在肿瘤治疗中引起显著兴趣但其全身给药受毒性限制包括3级和4级严重不良事件。因此局部注射如瘤内给药更受青睐。此外细胞因子编码mRNA可与其他免疫增强剂配对以实现联合治疗效果。细胞因子是获批用于人类肿瘤治疗的免疫治疗剂。剂量限制性毒性使在细胞中达到足够治疗浓度具有挑战性。这可通过将细胞因子递送至肿瘤来克服。在此方向Liu等开发了封装于LNPs的IL-12、IL-27和GM-CSF细胞因子编码mRNA。DAL4-LNP在不同可电离脂质中体外和体内高效运输多种mRNA至肿瘤。其中IL-12 mRNA在抑制B16F10黑色素瘤肿瘤生长方面显示更高治疗效力。由于免疫抑制性肿瘤微环境，免疫检查点阻断对肝细胞癌（HCC）的潜力有限。在此方向Xiao等研究恢复p53信号如何影响免疫TME和ICB疗效并开发了CXCR4定制mRNA在HCC模型中高效刺激p53信号。CTCE-p53-mRNA和aPD1共同强烈刺激TME的细胞和分子组分。这增强抗肿瘤治疗效力超过单独（mRNA或aPD1）效力。此外血性腹水和胸腔积液发生率降低，肺转移也减少。结论是p53恢复大幅增强aPD1在p53缺失HCC中的治疗潜力，mRNA和ICB联合可能是肿瘤管理的潜在策略。然而此类联合研究难以确定两种治疗方法的正确组合。多数联合研究为保持新颖性而进行并发表结果，但这并不意味着所报道的组合最佳。因此联合治疗还必须与不同mRNA治疗剂彻底评估以确定最佳可能组合。联合治疗也可能有副作用；因此副作用应监测至少6个月至1年。例如COVID-19 mRNA疫苗给药2-3年后已报道罕见副作用。mRNA治疗的长期副作用需研究。各种研究集中于mRNA运输的创新平台结合含肽、维生素、胆固醇及其衍生物的LNPs。脂质和肽广泛用作纳米载体。因此脂质和肽纳米颗粒也可能有前景，肽可为靶向mRNA递送提供各种功能特征。Li等配制脂质-肽-mRNA系统以恢复未分化甲状腺癌放射碘治疗中的钠碘同向转运体（NIS）信号。LP(R9H6) m NP递送的mRNA在体外增强ATC细胞中NIS信号>10倍。体内瘤内注射LPm NP中的NIS mRNA显著提高裸鼠NIS浓度和肿瘤中[96]I蓄积。生物分布通过体内SPECT/CT成像评估。用含正常碘和放射性[96]I不同制剂治疗的动物体内图像清楚显示甲状腺蓄积和全身无放射性信号。作者在手术切除后用γ计数器测量组织放射性。这是一项有趣的研究，可用于递送放射性元素用于各种疾病治疗和诊断。另一报道中Oyama等使用可电离脂质（IL）材料与维生素E（Vit-E）支架的组合作为mRNA治疗系统引发潜在细胞毒性T细胞应答。含IL和Vit-E支架编码OVA的mRNA疫苗在E.G7-OVA肿瘤模型中显示OVA靶向细胞毒性T细胞反应和治疗效力。进一步研究使用其抗原TgPF确认疫苗抗弓形虫潜力。他们还通过测量给药后6小时皮肤组织和血清中IL-6水平研究空-LNPssPalmE在给药部位的先天免疫激活，并研究治疗后长达36小时的IL-6水平。他们使用肌内和静脉途径给药。静脉给药时先天免疫激活可忽略不计而肌内途径给药时观察到良好先天免疫激活。该研究清楚证明递送途径影响mRNA治疗剂的治疗能力。此外Dania等研究脂质-肽纳米复合物辅助mRNA递送至黑色素瘤、结肠癌和人肺支气管肺泡细胞。他们通过组合和多因素筛选鉴定用于mRNA转染效率的脂质-肽纳米复合物。最佳制剂在无稳定剂情况下在4°C下保持稳定性和治疗潜力长达14天。添加胆固醇时针对B16-F10肿瘤模型观察到体外和体内最佳转染。虽结果有趣但需详细体内分析。Patel等研究羟基胆固醇修饰的iLNPs用于mRNA运输至T细胞。过去十年mRNA和基于mRNA的研究与开发主要集中于将mRNA运输至免疫细胞。胆固醇使用增强了mRNA递送。他们使用羟基胆固醇及其对mRNA运输至T细胞的影响以进一步探索。25% 7α-羟基胆固醇和50%胆固醇修饰LNP将mRNA运输至T细胞提高1.8倍和2.0倍。虽为有趣研究但研究掺入胆固醇的各种官能团以鉴定最有效胆固醇衍生物用于mRNA运输至T细胞有很大空间。同时必须研究不同疾病小鼠模型中的副作用和治疗潜力。鉴定所需含胆固醇官能团及其通过高效mRNA递送用于特定疾病治疗的潜力将是有趣的。另一广泛用于创建有效LNP-mRNA肿瘤干预的策略是合成具有不同头基、尾基和连接子的脂质库，因脂质化学结构直接影响脂质用于mRNA递送的潜力，不同组件比例的脂质纳米颗粒库以鉴定特异性递送mRNA至特定肿瘤细胞或肿瘤组织的潜在LNPs。对于临床可行的mRNA疫苗，脂质纳米颗粒的安全性和有效性至关重要。在此方向Lv等使用Keta-Ester化学构建了一系列易分解可电离脂质。缩酮作为头基酯作为尾。具有所需立体化学的最佳含头和尾脂质显示可电离特性。详细研究鉴定(4 S)-KEL12为安全高效的可电离脂质用于mRNA递送，具有高递送潜力和较低毒性。使用(4 S)-KEL12脂质的mRNA递送通过强激活抗原特异性CD8+ T细胞引发强细胞免疫应答并延长TC-1荷瘤小鼠生存期。脂质内编码HPV抗原的mRNA在体内显示优异抗肿瘤治疗潜力。立体化学、毒性、生物降解、生物分布和SAR在潜在脂质的合理设计和发现中发挥关键作用。此外Yan等探索具有支链疏水尾的脂质对mRNA运输用于肿瘤治疗的影响。他们开发了119种新型脂质。体外研究显示几种脂质表现优异mRNA运输能力。此外通过静脉注射编码荧光素酶的mRNA-LNP后在6和24小时成像分析脂质mRNA运输潜力。进一步研究显示具有支链疏水尾的脂质表现更好mRNA递送效率。编码卵清蛋白的mRNA递送至B16-OVA荷瘤小鼠进一步评估最佳脂质潜力。结果显示肿瘤中CD8+ T细胞显著激活并抑制B16-OVA肿瘤生长。本研究集中于支链疏水尾。然而不同头基也发挥关键作用，头和尾的最佳组合可能是mRNA递送的理想选择。可电离脂质已被研究用于mRNA递送。然而细胞靶向mRNA递送具有挑战性，限制细胞特异性疫苗开发。Naidu等研究细胞类型靶向mRNA运输。他们制造了具有不同疏水尾链和连接子的ILs库。他们使用微流控技术制造LNPs。利用荧光素酶mRNA、mCherry mRNA、Cre mRNA和TdTomato小鼠模型实现细胞靶向mRNA运输。体外研究显示具有支链酯链和连接子羟胺的尾在mRNA运输中表现不佳。进一步详细体内分析显示Lipid 13是有利于mRNA运输至肝的脂质。肿瘤成像确认荧光素酶mRNA运输使用Lipid 16大于Lipid 6（3.79倍）和23（2.48倍）。此外Lipid 16-LNP的肿瘤与肝Luc信号比更高。开发无需任何靶向剂特异性靶向细胞类型和/或组织类型的脂质非常有趣。这将显著改善mRNA运输至疾病特异性细胞或组织的整体治疗策略，进一步显著最小化递送系统的副作用。若干研究人员尝试设计携带特定代码或遗传信息以产生在治疗中发挥关键作用的特定蛋白的mRNA。Granot-Matok等开发用于实体瘤的毒素mRNA疫苗。他们开发编码细菌毒素的mRNA通过LNPs递送于B16荷瘤小鼠。显示优异抗肿瘤潜力和改善小鼠生存。这也称为肿瘤自杀基因干预。他们报道编码假单胞菌外毒素A结构域III的mRNA封装于LNP在体外和体内显示显著抗肿瘤特性。本研究的主要局限是治疗窗口的时间限制。因此全身给药可克服肿瘤特异性mRNA表达的需求。另一报道中Li等开发免疫冷肿瘤的治疗。他们报道编码gasdermin（GSDM）N端的LNP-mRNA刺激焦亡诱导强抗肿瘤应答。GSDM辅助焦亡是肿瘤治疗新方法需要N端切割激活焦亡。该过程将冷肿瘤转为热肿瘤并促进抗肿瘤免疫。进一步增强肿瘤对抗PD-1治疗的敏感性导致肿瘤抑制。该策略提供GSDMBNT mRNA@LNPs等益处，直接杀伤肿瘤细胞并提供无需蛋白酶切割的安全抗肿瘤免疫。它递送gasdermin N端触发焦亡、逆转免疫抑制TME并与免疫检查点阻断协同加强免疫治疗。ELISA分析显示在GSDMBNT mRNA@LNPs或与aPD1联合治疗小鼠的肿瘤和血清中IL-1β、IL-18和HMGB1生成强烈上调。这表明焦亡诱导。总之这导致延长寿命、肿瘤根除和远处病变遏制。这是使用LNP和mRNA在肿瘤治疗中的杰出进展。双特异性T细胞衔接（BiTE）抗体已显示在肿瘤治疗中有效。然而制造和有限血清稳定性构成挑战。为克服这些挑战Huang等制备基于BiTE的mRNA通过编码B7H3 x CD3 BiTE并将其封装于可电离脂质纳米颗粒。他们在人黑色素瘤皮下肿瘤异种移植模型中评估LNP@BiTE-mRNA的体内抗癌活性。LNP@BiTE-mRNA对肿瘤体积和重量显示更高抑制作用。LNP@BiTE-mRNA相比BiTE（50%）显示更大肿瘤抑制（70%）。未观察到体重显著变化。进一步生物发光成像显示LNP-BiTE-mRNA治疗小鼠强度更低。详细研究显示高转染效率、肝脾靶向能力和高BiTE浓度。静脉给予BiTE mRNA-LNPs显示体内高蛋白浓度和延长半衰期。本研究具有优异临床应用潜力。Jin等研究mRNA和PD-1/PD-L1联合使用靶向LNPs的抗癌潜力。肿瘤mRNA疫苗的临床应用因缺乏有效mRNA运输系统和不足APC刺激而受限。因此他们开发靶向APCs的甘露糖修饰脂质纳米疫苗以克服这些限制。此外开发的治疗系统引发联合抗癌效果。本研究显示含ICP抑制剂的mRNA疫苗在免疫反应中发挥关键作用。脂质众所周知是mRNA递送的潜在纳米载体。然而脂质特性可能不适合递送mRNA至特定器官。因此鉴定用于特定器官递送的最佳脂质-mRNA组合需要高通量筛选以提高治疗效力。Xue等开发条形码辅助快速分析平台以评估脂质样材料的肺靶向能力。他们合成180种阳离子可降解脂质并体外筛选。然后使用条形码技术鉴定96种不同脂质用于体内DNA条形码递送。其中最佳制剂在肺癌模型中评估体内治疗潜力。这一杰出技术可基于肿瘤部位鉴定脂质潜力。该技术必须进一步探索以鉴定用于器官特异性mRNA运输的最佳脂质，如心脏、肝和脑。此外Pan等开发mRNA疗法携带未改变mRNA和TLR至脾。他们使用硬脂酸灌注LNPs、编码OVA的mRNA和MPLA（TLR4激动剂）配制疫苗sLNPs-OVA-MPLA。静脉给药后疫苗显示组织特异性mRNA表达并通过刺激各种TLRs增强佐剂活性。在预防性小鼠系统中sLNPs-OVA-MPLA疫苗阻止EG.7-OVA肿瘤生长。在小鼠肿瘤模型中显示强肿瘤预防和治愈能力。具有很大临床潜力。此外特异性递送mRNA至特定细胞的脂质纳米颗粒仍具挑战性。在此方向Melamed等研究巨噬细胞介导的mRNA运输至胰腺β细胞使用iLNP。他们开发使用脂质纳米颗粒特异性递送至胰腺的方法。他们使用辅助脂质与脂质纳米颗粒进行腹腔给药。本研究显示mRNA靶向递送至胰腺取决于腹膜巨噬细胞释放的外泌体介导的横向基因转移。他们报道核苷修饰mRNA-LNP递送至胰腺。详细研究显示EV分泌和巨噬细胞基因转移是mRNA递送至器官靶标的机制。他们还测量TNFα、IL-6、IL-2、IgG和IgM以评估胰腺定向mRNA-LNP的免疫激活。结果显示监测免疫细胞如单核细胞和巨噬细胞的极小刺激。IL-2降低支持mRNA-LNP未触发强烈T细胞依赖性反应。未报道IgG变化。IgM水平略降低并在2周后恢复基线，表明无IgM介导的体液应答。总之表明mRNA-LNPs不产生强烈全身免疫活性。小鼠和人间胰岛框架、腺泡和导管组织结构不同必须探索。近期Hyayamares等报道94种化学 distinct纳米颗粒将核酸递送至头颈部鳞状细胞癌（HNSCC）终末期实体瘤体内的通量分析以克服LNP-mRNA运输在终末期实体瘤HNSCC中的限制。他们评估含4种不同PEG-脂质在1%至15%摩尔浓度的LNPs。每种LNP运输其各自DNA条形码。体内研究显示减少脱靶递送。然而主要限制是递送特征在人类中可能与小鼠模型不同。分子机制需进一步研究。同时关注组织/细胞选择性和减少脱靶效应非常重要。在此方向全球若干知名研究组开始设计和合成可生物降解可电离脂质的组合库并进行高通量筛选以鉴定和进一步体外和体内分析组织特异性LNP-mRNA治疗潜力。Chen等也设计合成可生物降解可电离脂质库并鉴定iso-A11B5C1为肌肉特异性mRNA递送脂质。显示最小化靶向肝和脾。肌内递送后强烈触发细胞免疫应答。在黑色素瘤系统中显示治疗活性。这些设计脂质库并鉴定组织特异性递送潜力的高通量研究鼓励重新思考mRNA疫苗设计原则。此外Chen和同事开发用于淋巴结（LN）靶向mRNA治疗的脂质纳米颗粒触发强CD8+ T细胞活性。如上所述靶向递送至所需器官和组织近年来在基于脂质纳米颗粒的mRNA治疗中获得极大关注。研究显示LNP 113-O12B相比ALC-0315增强LN中表达。载有TRP-2肽编码mRNA的LNP 113-O12B显示肿瘤预防潜力。治疗小鼠显示长期免疫记忆并阻碍肺中肿瘤转移结节。这可能成为下一代mRNA疫苗开发的标准平台。该方法需进一步研究以开发组织特异性个性化LNP-mRNA治疗剂。然而成本仍是问题。这可通过脂质化学结构库、不同遗传信息编码mRNA库的理论分析及调整LNP中各组件比例来克服；掺入肽、蛋白、胆固醇和维生素等额外分子的影响需评估，可合成最佳制剂。这可节省大量时间、化学品、人力和昂贵试错实验。
5 mRNA在肿瘤治疗中的临床应用。信使核糖核酸（mRNA）技术已革新肿瘤治疗，提供对抗不同恶性肿瘤的新颖且有前景的方法。基于mRNA的疫苗作为对抗包括肿瘤在内的众多疾病的强大武器已获大量关注并快速发展。在肿瘤治疗中mRNA用于开发靶向特定肿瘤细胞的疫苗旨在个性化和极成功治疗。mRNA技术已成为肿瘤治疗的可行策略，提供靶向和治疗各种类型肿瘤的新途径。mRNA疫苗是相对新型疫苗已在广泛传染病和肿瘤免疫治疗中显示强大前景。肿瘤疫苗主要包括溶瘤病毒疫苗、细胞疫苗、肽疫苗和核酸疫苗。数十年研究过程中溶瘤病毒疫苗T-VEC、细胞疫苗（sipuleucel-T）、各种肽疫苗和靶向HPV阳性宫颈癌的DNA疫苗已为肿瘤治疗带来鼓舞性成果。mRNA的结构和功能自1961年首次发现以来一直被持续研究。1969年首次成功的体外mRNA翻译使研究人员能够在实验室产生特定蛋白。此外脂质体封装mRNA递送系统的开发允许调节靶细胞内蛋白表达。该过程扩展至COVID-19 mRNA疫苗加速了mRNA治疗的全球进展，尤其在肿瘤疫苗研究中。与传统肿瘤疫苗相比mRNA疫苗提供多种益处，包括有效产生保护性免疫应答、可忽略的不良反应和较低购置成本。肿瘤学研究随着基于mRNA疫苗的进展已感知实质性进步，展示肿瘤免疫治疗中的创新策略。这些疫苗利用mRNA的多功能性通过产生肿瘤抗原诱导有效免疫应答。该策略通过展示表达的抗原刺激免疫系统识别和消除恶性细胞。因为mRNA可无细胞生产，任何抗原基因序列可视为潜在mRNA疫苗候选并可在细胞培养和动物模型中高效、快速和成本有效地测试和评估。选择靶抗原序列后与DNA载体重组。随后进行体外转录并纯化合成mRNA。纯化mRNA经封装制备可被内吞高效摄取的疫苗。靶mRNA释放至细胞质由核糖体翻译为蛋白。细胞质中蛋白酶体复合物将新合成蛋白降解为抗原肽表位。抗原表位进一步加载至内质网中MHC I类分子。接着MHC I类分子将抗原肽呈递至CD8+ T淋巴细胞。随后蛋白产物分泌、被抗原呈递细胞摄取并在内体中降解。抗原片段随后由MHC II类分子呈递至TH细胞。随后TH细胞激发B细胞产生中和抗体。（MHC主要组织相容性复合体；BCR B细胞受体；TCR T细胞受体；Th细胞辅助T细胞）。RNA疫苗比传统疫苗开发更快成本更低，因体外转录（IVT）反应产生大量RNA。工业mRNA合成的进步已大幅降低制造成本。早期研究表明mRNA疫苗在健康个体中诱导强免疫应答且耐受性良好。mRNA可同时编码多种抗原。这些抗原与MHC I和MHC II结合促进针对肿瘤的体液和细胞适应性免疫应答。与DNA疫苗不同mRNA疫苗非整合且缺乏插入突变潜力。尽管如此临床前试验必须谨慎进行以防止任何不良效应。即使在获批后对这些治疗剂的长期安全性和有效性的持续评估至关重要。此外国际组织间合作可确保mRNA疫苗研究的持续资助。
6 局限性与挑战。研究人员在基于mRNA的COVID-19疫苗成功后对基于mRNA的治疗更加乐观。但在采用mRNA作为肿瘤治疗剂之前必须评估免疫原性、稳定性和有效递送策略等关键挑战。解决这些挑战不仅确保安全性还防止患者罕见过敏反应。在此方向研究人员应探索核苷修饰、序列工程和基于AI的优化等选项以减少免疫应答。此外靶向肿瘤治疗可极大受益于信使RNA（mRNA）疗法但免疫抑制性肿瘤微环境和全身脱靶效应限制其潜力。为解决此问题Dong等开发肿瘤可定制mRNA纳米医学平台整合肿瘤可定制可电离脂质（TIs）和肿瘤特异性非翻译区（TURs）以增强肿瘤选择性mRNA递送和表达。此外Liu等通过将最佳量带负电肽-脂质缀合物掺入常规LNP以防止聚集创建称为CAS-LNP（LNP电荷辅助稳定）的LNP制剂。吸入后CAS-LNP显著增加mRNA运输有效性并在雾化过程中表现优异稳定性。此外保持持续低温用于mRNA稳定性也构成巨大挑战尤其在发展中地区。因此研究应集中于热稳定递送机制。此外肌内或静脉给予基于mRNA的治疗需要专业医务人员。因此应探索替代给药方法如鼻内、口服和基于微针的递送。
7 结论。脂质纳米颗粒（LNP）介导的mRNA递送已成为肿瘤免疫治疗的变革性平台。其临床基础由基于LNP的siRNA治疗剂的监管批准和mRNA疫苗的成功所证明，确认该系统在多种组织中安全封装、保护和细胞摄取mRNA的能力。然而应用于肿瘤管理和肿瘤学仍主要处于研究阶段。尽管临床前模型在抗原呈递、免疫激活和肿瘤控制方面显示令人鼓舞的结果，但在实现有效肝外递送、最小化脱靶蓄积和确保异质性肿瘤微环境中一致治疗效力方面挑战持续存在。免疫原性、脂质毒性和可变内体逃逸的潜在问题进一步突显实验前景与临床可靠性之间的差距。在广泛批准之前需要若干关键进展。这些包括精炼可电离脂质和配制参数以改善靶向特异性和生物可降解性、全面评估不同患者队列中的长期安全性以及稳健研究最佳给药、联合方案和治疗获益。可扩展制造和成本考虑也必须解决。此外继续努力用更生物相容的脂质组件替代潜在危险组件预期将改善患者安全性和耐受性。为充分实现这些技术的临床潜力，必须提高递送效率并消除任何剩余技术障碍。LNP-mRNA平台能否显著改善肿瘤治疗最终将取决于这些领域当前和未来研究的结果。
8 未来展望。基于LNP的mRNA递送可显著改善患者结局。此外通过修饰调控区进行mRNA工程可增加体内mRNA翻译效率。为将LNP mRNA递送至细胞必须了解阻止内吞的屏障。通过理解LNPs的理化特性并进行适当修饰科学家可确保安全靶向mRNA递送。在设计药物前评估组织微环境和LNP mRNA分布特征也至关重要。因此为有效肿瘤治疗LNP mRNA平台应提供灵活性、加速生产、改善安全性和强效免疫激活。