《Cells》：Tumor-Driven Innervation: Neoneurogenesis, Neural Mimicry, and Neuro-Immune Crosstalk in the Tumor Microenvironment
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维得利珠单抗（vedolizumab）是一种肠道选择性整合素拮抗剂，是炎症性肠病（inflammatory bowel disease，IBD）的有效治疗方法，但治疗应答的免疫相关因素仍知之甚少。研究人员对20例接受维得利珠单抗治疗的IBD患者（15例克罗恩病
维得利珠单抗（vedolizumab）是一种肠道选择性整合素拮抗剂，是炎症性肠病（inflammatory bowel disease，IBD）的有效治疗方法，但治疗应答的免疫相关因素仍知之甚少。研究人员对20例接受维得利珠单抗治疗的IBD患者（15例克罗恩病（Crohn‘s disease，CD），5例溃疡性结肠炎（ulcerative colitis，UC））的血液和血清进行了纵向免疫分析，以表征治疗相关的免疫变化并识别与临床应答相关的基线特征。样本在基线和第14周采集。免疫细胞表型分析使用五个10色流式细胞术检测组套完成，血清蛋白质组学使用Olink? 96 Inflammation panel评估。纳入年龄和性别匹配的健康对照（healthy controls，HCs）进行比较。IBD患者与HCs的区分主要基于免疫细胞谱，而血清蛋白质组差异较不明显。维得利珠单抗治疗引起免疫细胞组成和血清蛋白的适度变化。临床应答者在第14周表现出三个免疫细胞群体的变化以及CXCL8和IL-6水平的降低。对五个基线免疫细胞群体进行无监督层次聚类将患者分为两组，大致对应治疗结局。此外，无应答者表现出IFNγ和CXCL9水平升高。然而，在校正多重检验后，这些免疫细胞群体和蛋白质未保持显著性。综上，研究人员识别了与维得利珠单抗应答相关的探索性免疫和细胞因子模式，可能支持IBD精准医学方法的发展。
研究背景：炎症性肠病（IBD）包括克罗恩病（CD）和溃疡性结肠炎（UC），是慢性免疫介导的疾病，以胃肠道复发性炎症为特征。在欧洲，IBD影响约250万至300万人，每年直接医疗费用达46亿至56亿欧元。IBD的发病机制复杂且异质，涉及遗传易感性、微生物失调、免疫调节异常和环境因素的多因素交互作用，导致治疗结局的异质性。传统治疗如氨基水杨酸类、免疫抑制剂和糖皮质激素通常作为早期IBD管理的广谱药物使用，而先进生物制剂通常用于对这些初始方法无应答的患者。在生物制剂中，靶向肿瘤坏死因子-α（TNF）的抗体仍是CD和UC最常用的一线选择。维得利珠单抗（Entyvio；Takeda Pharmaceuticals）是一种抗α4β7整合素阻断剂，通常在抗TNF治疗失败后作为二线或三线治疗使用。整合素α4β7通过与黏附分子结合促进白细胞跨内皮迁移，使白细胞迁移至肠道黏膜。然而，其具体作用机制仍仅部分被了解。尽管维得利珠单抗被认为是一种安全的治疗选择，包括从静脉给药转换为皮下给药后，但其疗效仅限于约40-50%的患者。这凸显了更好地理解与治疗应答相关因素的必要性。若干治疗前因素与无应答相关，包括既往抗TNF暴露、长病程、高疾病严重程度、瘘管型表型以及升高的炎症标志物如C反应蛋白（CRP）和低白蛋白水平。最近，血清细胞因子，特别是IL-6和IL-8，已成为维得利珠单抗应答的有前景的早期指标，尤其在UC中。此外，通过流式细胞术识别的特定免疫细胞亚群与维得利珠单抗应答相关。然而，由于敏感性和特异性有限以及需要进一步验证，临床实施仍具挑战性。这些观察结果表明，整合评估细胞和可溶性免疫特征的免疫分析方法可能更好地捕捉维得利珠单抗应答背后的复杂性。因此，研究人员开展了一项探索性研究，在20例开始维得利珠单抗治疗的IBD患者队列中整合纵向流式细胞术和血清蛋白质组学，旨在生成与一年治疗应答相关的免疫特征的假设。此外，纳入健康对照（HCs）作为参考组，以展示这种整合方法区分IBD患者与HCs的能力。
研究人员开展的研究及结论：研究人员对20例IBD患者（15例CD，5例UC）在基线（维得利珠单抗启动前）和第14周采集样本，随访52周。主要关键技术方法包括：（1）使用五个10色流式细胞术检测组套（P1-P5）进行全血和PBMC免疫表型分析，结合FlowSOM无监督聚类算法和t-SNE降维进行高维数据分析；（2）使用Olink? Target 96 Inflammation panel基于邻近延伸分析（PEA）技术检测92种血清炎症蛋白；（3）采用线性混合效应模型分析纵向变化。样本来源为荷兰Radboud大学医学中心2020年1月至2023年7月纳入的患者，健康对照来自BCG疫苗接种队列。研究结论：研究人员识别了与维得利珠单抗应答相关的探索性免疫和细胞因子模式，可能支持IBD精准医学方法的发展。
研究结果：
3.1 队列和基线人口统计学：20例IBD患者（15例CD，5例UC）接受维得利珠单抗治疗并前瞻性随访52周。20例患者中12例（15例CD中7例，5例UC全部）在第52周显示临床应答。剩余8例均为原发无应答者。所有UC患者均被分类为应答者，而所有无应答者均为CD。基线时合并用药在应答者和无应答者之间无差异。在维得利珠单抗启动前三个月内使用先进治疗（抗TNF、乌司奴单抗、奥扎尼莫德（S1P）或Janus激酶抑制剂（JAKi））在无应答者中更为常见，既往乌司奴单抗暴露在该组中显著更常见（p = 0.02）。大多数应答者此前未暴露于先进治疗（58%）或仅接受过一种（33%），而大多数无应答者接受过三种既往治疗（63%；p = 0.001）。
3.2 免疫细胞分析和血清蛋白质组学区分IBD患者与HCs：FlowSOM在五个检测组套中总共识别了122个免疫细胞簇。所有簇的主成分分析（PCA）显示HCs与大多数IBD患者在第一主成分（PC1）上清晰分离（未校正p = 4.13 × 10
?13）。单变量分析识别了45个在IBD患者和HCs之间显著不同的免疫细胞簇（校正p < 0.05）。与HCs相比，IBD患者表现出CD45RA+ CD4+和CD8+初始T细胞亚群及重新表达CD45RA的效应记忆T细胞（TEMRA）的减少，以及CD194+CD195+CD196+ CD4+ T细胞的减少，而记忆和活化T细胞群体主要增加。IBD患者显示双阴性T细胞、经典单核细胞、NKdim细胞频率降低，而CD4 T细胞、调节性T细胞、B细胞总体及谱系阴性群体增加。Olink蛋白质组学分析显示大多数IBD患者与HCs在PC1上分离（p = 2.488 × 10
?7）。单变量分析识别了30种在IBD患者中显著升高的蛋白质，差异最大的是AXIN1、IL-6、SIRT2、CCL7和CCL20（校正p < 0.05）。总体而言，循环免疫细胞亚群以及程度较小的蛋白质组学分析能够区分IBD患者与HCs。
3.3 维得利珠单抗在应答者中诱导免疫群体和血清蛋白质组的有限变化：在仅限IBD患者的FlowSOM聚类中，共识别118个免疫细胞簇。在所有患者中，无论治疗结局如何，10个免疫细胞簇随时间显著变化（未校正p < 0.05）。蛋白质组学分析显示多种趋化因子和促炎细胞因子随时间降低，最显著的降低为CCL20、CCL3、CCL7、CXCL8、IL-17A、IL-6和TNF（未校正p < 0.01）。按应答状态分层后，应答者中三个免疫群体显著变化：初始B细胞（P3_C13）、CD25+CD194+CD195+CD196+ CD4+ T细胞（P5_C23）和中央记忆CD8+ T细胞（P5_C24）。应答者显示CXCL8和IL-6显著降低（未校正p < 0.05），第14周时CXCL8水平低于无应答者。比较应答者和无应答者之间的纵向轨迹，应答者显示双阳性T细胞（P1_C12，未校正p = 0.017）显著降低，CD4+CD25+HLA-DR+ T细胞（P1_C19，未校正p = 0.024）和记忆CD8+ T细胞（P4_C25，未校正p = 0.0027）显著增加。细胞因子方面，TNFRSF9（未校正p = 0.0092）、CCL19（未校正p = 0.017）、SLAMF1（未校正p = 0.035）、TNFSF11（未校正p = 0.037）、EIF4EBP1（未校正p = 0.043）和IL10RB（未校正p = 0.049）在应答者中随时间增加，而ARTN（未校正p = 0.017）是应答者中唯一显著降低的细胞因子。校正多重比较后，无轨迹保持统计学显著性。
3.4 基线免疫和细胞因子蛋白质组学特征与维得利珠单抗应答相关：比较CD和UC患者之间的免疫细胞和血清蛋白质组学谱，未发现显著差异。对118个免疫细胞群体的单变量分析识别了5个在应答者和无应答者之间显著不同的群体。无应答者显示CD4+CD8+ T细胞（未校正p = 0.044）和CD25+ CD4+ T细胞（未校正p = 0.039）频率较低，而效应记忆（EM）3/4 CD4+ T细胞（未校正p = 0.047）、IgD+IgM+CD24+CD38?初始B细胞（未校正p = 0.007）和初始CD197++CD45RA+ CD8+ T细胞（未校正p = 0.031）增加。然而，FDR校正后无群体保持统计学显著性。研究人员还发现无应答者血清中CCL19（CD197的配体之一）呈增加趋势。使用仅这5个群体的频率进行层次聚类，将同一数据集中的患者分为两个主要组：第1组富集无应答者，第2组富集应答者。血清蛋白质组学单变量分析识别CXCL9（未校正p = 0.01）和IFNγ（未校正p = 0.004）在应答者和无应答者之间显著不同。将细胞群体与血清蛋白质组学标志物结合时，IFNγ和CXCL9分别在200次bootstrap重采样中的90%和78%中被选中。将这两个细胞因子加入逻辑回归模型未改善区分度：仅免疫细胞群体的乐观校正AUC为0.76（2.5th-97.5th bootstrap百分位数0.51-1.00），加入细胞因子后为0.76（0.51-0.99）。仅限生物制剂经治患者的亚组分析（n = 13；8例无应答者和5例应答者）显示，初始B细胞（P3_C15）在无应答者中显著增加（未校正p = 0.006），CXCL9（未校正p = 0.03）亦如此。此外，CXCL1（未校正p = 0.003）、CCL23（未校正p = 0.006）和CXCL11（未校正p = 0.045）在无应答者中升高。
讨论部分总结：在这项探索性研究中，研究人员应用全面的全血流式细胞术分析与血清蛋白质组学比较HCs和20例维得利珠单抗治疗的IBD患者。纵向追踪免疫细胞亚群和血清蛋白，并探索与治疗应答的可能关联。流式细胞术分析识别了与临床结局相关的基线免疫特征。同时，CXCL9和IFNγ在无应答者中显著升高。然而，这些免疫细胞群体和蛋白质在校正多重检验后未保持显著性。重要的是，当分析仅限于生物制剂经治患者时，CXCL9和特定初始B细胞亚群（IgD+IgM+CD24+CD38?）在无应答者中仍升高，表明这些关联并非仅由既往生物制剂暴露驱动。尽管存在基线差异，但观察到有限的纵向变化，反映了维得利珠单抗的温和免疫调节效应。除治疗应答外，IBD患者与HCs相比在免疫细胞组成和血清蛋白质组方面表现出显著差异。流式细胞术分析中基线最显著的差异是无应答者中表达高水平CD197的初始CD8+ T细胞和缺乏CD38的初始B细胞的增加，据研究人员所知，这些在维得利珠单抗应答背景下此前未被报道。研究人员假设这些表达高水平CD197的初始CD8+ T细胞优先被招募至表达高水平CD197配体CCL19和CCL21的三级淋巴结构（TLS）。TLS通常响应慢性炎症而形成，允许淋巴细胞独立于α4β7进入。与此一致，CCL19转录水平在应答者活检中随时间降低但在无应答者中保持升高，而循环CCL19显示相反模式。组织和血液中观察到的相反轨迹表明局部肠道和全身免疫反应可能受维得利珠单抗的不同影响。尽管如此，这些发现可能指向一种维得利珠单抗非依赖性运输途径，使初始T细胞被招募至TLS，在那里它们可进行局部致敏并促进持续性肠道炎症。虽然推测性的，研究人员识别的初始B细胞可能代表从静息CD38+初始状态向更活化的CD38?表型的转变。这些提出的机制仍是推测性的，因为本研究未直接评估TLS形成或肠道运输途径，因此需要在基于组织的研究中验证。解释这些关联时的一个重要考虑是，在本队列中所有UC患者被分类为应答者，而所有无应答者均为CD。尽管两个疾病组之间未检测到显著的基线免疫或蛋白质组差异，且应答者组包括UC和CD患者，但UC病例数量有限限制了区分疾病特异性效应与治疗应答相关效应的能力。因此，不能排除疾病相关混杂。大多数既往维得利珠单抗相关流式细胞术研究关注α4、β7或α4β7整合素表达，而未像本研究这样检查更广泛的免疫亚群。一些研究报告应答者中α4β7+ T细胞水平较高，而另一些发现应答者中T细胞、B细胞或NK细胞上α4β7表达较低。Boden等人未观察到应答者和无应答者之间淋巴细胞频率的主要差异，尽管他们使用传统组套和缺乏无监督聚类可能限制了检测细胞群体差异的能力。Coletta等人报告应答者中循环TH1细胞（CD183+CD196?）升高，研究人员未复制这一发现。有趣的是，研究人员反而观察到应答者基线时血清IFNγ（TH1细胞的标志性细胞因子）名义上降低。这一差异表明循环IFNγ可能不单纯反映TH1细胞活性。它也可能来源于其他亚群，如结肠CD4+ T细胞或特定肠道驻留γδ T细胞，两者均已知在慢性炎症组织中分泌高水平IFNγ。先天免疫细胞，特别是单核细胞和巨噬细胞，也与维得利珠单抗应答相关，并可响应IFNγ产生CXCL9。若干临床变量此前与UC和CD患者的维得利珠单抗应答相关。在CD中，有利因素包括短病程、无既往肠切除或抗TNF暴露以及较低的CRP和较高的白蛋白水平。在UC中，这些包括中度内镜活动、无抗TNF使用史和低白蛋白水平。在本队列中，既往先进治疗暴露在应答者和无应答者之间显著不同，大多数无应答者接受过抗TNF药物，支持治疗史在塑造维得利珠单抗应答中的重要性。尽管肠切除和CRP的差异未达到统计学显著性，应答者倾向于较少手术和较低CRP。这些发现与两项先前研究一致，这些研究将高基线CRP与降低的应答相关联。在本研究中，IBD患者的免疫细胞组成和血清蛋白质组与HCs显著不同。更具体地，患者显示初始T细胞、经典单核细胞和NKdim细胞频率较低，而B细胞及记忆和活化T细胞增加。一项大型免疫分析研究报告了相当的细胞群体差异，包括NK细胞减少和特定CD变化如效应记忆T细胞增加和初始T细胞及经典单核细胞减少。虽然这些发现与研究人员的结果广泛一致，但该研究观察到B细胞频率降低而非增加。这一差异可能反映队列组成（如CD vs. UC）、既往治疗或样本量的差异。此外，研究人员研究中的血清蛋白质组学清晰地将大多数IBD患者与HCs分离，患者中通常观察到较高的蛋白质水平。与此一致，一项纳入300多例IBD患者的Olink蛋白质组学研究识别IL12B、CD6、CXCL9、IFNγ和IL-18与IBD强烈相关。研究人员同样发现这些蛋白质在HCs和患者之间的血清水平存在显著差异，除CD6仅显示趋势外。总之，这些发现表明流式细胞术和Olink蛋白质组学均可区分HCs和IBD患者之间的免疫谱，且这些互补方法可有效应用于探索维得利珠单抗应答者和无应答者之间的生物学差异。研究人员还研究了维得利珠单抗随时间的影响，比较基线和第14周的免疫谱和血清蛋白质组。总体而言，观察到的变化是温和的，反映了维得利珠单抗的温和免疫调节效应。血清蛋白质组学显示应答者在维得利珠单抗治疗14周后CXCL8（参与中性粒细胞运输的趋化因子）和IL-6显著降低。虽然基线CXCL8水平在应答者和无应答者之间相当，但应答者随时间显示明显更陡的下降，导致第14周时水平低于无应答者。维得利珠单抗治疗最初几周内CXCL8的降低此前与应答相关，与研究人员的发现一致。此外，IL-6被报告在CD患者中无论应答如何均降低，而在UC中，这种降低仅在应答者中于维得利珠单抗治疗后10周观察到。研究人员的发现与这一报告的IL-6模式广泛一致。研究人员观察到的免疫细胞群体和蛋白质（TNFRSF9、SLAMF1、TNFSF11、EIF4EBP1、IL10RB和ARTN）的轨迹差异据研究人员所知尚未在文献中与维得利珠单抗应答相关联报道。本研究存在若干局限性。首先，这一真实世界三级护理队列在疾病特征和既往治疗暴露方面具有异质性。既往治疗可能对免疫系统产生独立于维得利珠单抗应答的持久影响。由于既往生物制剂暴露与应答相关，研究人员无法可靠地校正这一因素。合并或既往使用的药物（包括硫嘌呤和糖皮质激素）的效果同样无法完全评估。因此，在本数据集中，识别的与应答相关的免疫和蛋白质组学特征无法与疾病特异性或既往治疗相关的免疫特征区分。另一个局限性与结局评估有关。应答分类由经验丰富的胃肠病学家使用所有可用的临床、生化和内镜信息进行审查。然而，内镜评估未在队列中系统进行。因此，治疗应答基于临床评估和可用的生化标志物而非统一的内镜评估。尽管UC和CD之间未观察到外周免疫谱的统计学显著差异，但研究未有力排除疾病特异性免疫差异。由于亚组规模有限，进一步按疾病表型（如结肠型 vs. 回结肠型）分层不可行。总体而言，本研究的小样本量限制了亚组分析。未来在更大的独立队列中验证，理想情况下包括更多生物制剂初治患者，对于更好地区分治疗相关免疫改变与特异性与维得利珠单抗应答相关的免疫特征将很重要。第三，相对于测量的免疫特征数量，样本量较小，从而限制了统计功效和分析的复杂性。尽管研究人员探索了多变量方法包括弹性网回归，但模型收敛不稳定且预测性能无法可靠建立，可能反映样本量相对于数据集维度的限制。因此，研究人员在此探索性设置中聚焦于单变量分析以降低过拟合风险。第四，本研究应用的免疫组套设计用于广泛免疫表型分析，未优化以捕捉直接与维得利珠单抗作用机制相关的标志物，如α4β7整合素和CCR9表达。因此，识别的特征无法直接与维得利珠单抗靶向的分子通路相关联，限制了研究人员的发现的机制解释。未来研究应整合运输特异性标志物与广泛免疫表型分析，以更直接地将生物学测量与药物作用机制对齐。最后，由于探索性分析未校正多重检验，不能排除I型错误的风险。因此，这些发现应被解释为假设生成性的，需要在更大的独立队列中应用适当校正和建模策略进行验证。尽管存在这些局限性，研究人员观察到维得利珠单抗应答者和无应答者之间免疫表型和血清蛋白质组学谱的差异。未来工作应基于研究人员的发现，考虑纳入先天免疫标志物、α4β7和CCR9染色以及关键临床变量（如既往先进生物制剂暴露、CRP和FCP）。需要在更大的独立队列中对研究人员的結果进行前瞻性验证，以评估此类方法是否可有助于未来的精准医学策略。
研究结论翻译：综上，研究人员识别了与维得利珠单抗应答相关的探索性免疫和细胞因子模式，可能支持IBD精准医学方法的发展。
