塞尔维亚官方控制中进口海产品异尖线虫及近缘蛔总科线虫的多重PCR分子谱特征——基于74份实验室分子检测记录的回顾性分析

《Foods》：Dual-Platform GC–MS and 1H NMR Metabolomics with Explainable Machine Learning for Discrimination of Six Chinese Specialty Teas

异尖线虫（anisakid nematodes）是海洋鱼类中重要的食源性危害，但塞尔维亚官方控制体系内受检进口海产品中的分子数据仍较缺乏。该研究对进口海洋鱼类及渔产品官方检查中回收的寄生虫材料中异尖线虫及相关蛔总科线虫的分子谱进行了表征。研究人员采用靶向核糖体DNA（ribosomal DNA, rDNA）内部转录间隔区（internal transcribed spacer, ITS）的多重PCR（multiplex PCR）分析了74份选定分子检测记录。55份记录（74.3%）获得特异性扩增。主要结果为A. simplex sensu lato/A. pegreffii杂合样多重PCR条带谱型（39份记录），其次为A. pegreffii（8份）、Contracaecum osculatum（6份）和Anisakis typica（2份）；Anisakis类群占阳性记录的89.1%。在具有已知鱼种身份的记录中，无须鳕（Merluccius spp.）占多数，但无须鳕与鲭鱼（Scomber spp.）的记录层面阳性率相近。在具有已知来源的记录中，西班牙占多数，而其阳性率和谱型分布与其他已知来源在描述性上相当。多重PCR条带谱型为常规寄生虫学检查提供了有用补充，并为塞尔维亚进口海产品中异尖线虫相关危害监测提供了基线描述信息；然而，该检测本身不能确认杂合基因型或寄生虫活力。上述发现描述的是选定的实验室分子检测记录，并不构成进口鱼类中异尖线虫流行率的估计。

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一、研究背景与问题
海产品国际贸易扩大及鲜品、冷藏、冷冻和最低限度加工产品消费增加，可能促进食源性人兽共患寄生虫传入和扩散。异尖线虫（anisakid nematodes）在多种商业开发海洋鱼类中分布，既可带来感染风险，也可因寄生虫源性变应原引发IgE介导的超敏反应。其生活史通常涉及甲壳类、鱼类及海洋哺乳动物等，人类为偶然宿主，可因摄入含活感染性第三阶段幼虫（L₃）的生鱼或未充分煮熟鱼体而感染。形态学鉴定对幼虫近缘种区分有限，分子方法可提高诊断分辨率，尤其适用于官方食品控制和地理来源多样产品。欧洲法规及塞尔维亚兽医卫生法规对可能含活寄生虫的渔产品规定冷冻或热处理要求。既往全球病例和风险因素综述提示，病原鉴定不完整会影响海产品与人间病例的流行病学联系。尽管欧洲海洋鱼类异尖线虫文献较多，但塞尔维亚官方控制体系内进口海产品分子数据仍少；塞尔维亚为内陆国，依赖国际贸易供应海洋鱼类，进口来源可能涉及不同海洋环境和不同异尖线虫种及基因型。因此，研究人员开展本研究，旨在表征塞尔维亚官方检查进口海洋鱼类及渔产品时回收寄生虫材料中的异尖线虫及相关蛔总科线虫分子谱，并按统一鱼类别、记录来源国和检查年份作描述性分布分析，同时明确回顾性实验室数据的局限。

二、研究开展、结论与意义
该研究为回顾性实验室记录分析。2022年10月至2024年12月，91份进口鱼及渔产品样品在官方控制体系内接受常规寄生虫学检查；随后对形态上与异尖线虫或相关蛔总科幼虫相容的选定寄生虫材料进行分子检测。幼虫为非随机选取，每个寄生虫学阳性样品最多检测2条完整L₃幼虫，约相当于所有回收幼虫的10%。实验室数据库纳入74份分子检测记录，分析单位为数据库行，不假定分子检测记录代表独立鱼体，因此结果报告为记录层面分子发现，不构成塞尔维亚进口鱼及渔产品异尖线虫流行率估计。研究结论显示，选定的形态疑似材料中分子确认比例较高，Anisakis类群占阳性记录多数，A. simplex s.l./A. pegreffii杂合样多重PCR条带谱型最常见；多重PCR条带谱型可作为常规寄生虫学检查的补充和监测基线，但该检测本身不能确认杂合基因型或寄生虫活力。其意义在于为进口海产品异尖线虫相关危害监测提供描述性基线，并强调标准化元数据和确认性方法的重要性。

三、关键技术方法
样本队列来源于塞尔维亚兽医研究所食品和饲料安全部门官方控制期间提交的进口海洋鱼及渔产品，研究期为2022年10月至2024年12月，共91份样品，最终分析74份分子检测记录。关键技术为针对核糖体DNA（rDNA）内部转录间隔区（ITS）的多重PCR（multiplex PCR），采用欧洲联盟寄生虫参考实验室（EURL-P）MI-10方法相关引物组合和热循环条件；以参考DNA作阳性对照、无模板对照监测污染；PCR产物经琼脂糖凝胶电泳按诊断性条带大小判读；比例及双侧95%置信区间（confidence interval, CI）用Wilson评分法作描述性计算。未进行测序或多位点基因分型。

四、主要结果
原文结果部分未设二级小标题，按内容归纳如下。分子确认与谱型分布方面，74份记录中55份获得特异性扩增，分子确认比例为74.3%（95% CI：63.3–82.9%），19份（25.7%）无特异性扩增；A. simplex s.l./A. pegreffii杂合样谱型39份，占PCR阳性记录的70.9%（95% Wilson CI：57.9–81.2%），占全部74份记录的52.7%；A. pegreffii相容谱型8份（全部记录的10.8%，阳性记录的14.5%；95% Wilson CI：7.6–26.2%），C. osculatum相容谱型6份（8.1%；10.9%；95% Wilson CI：5.1–21.8%），A. typica相容谱型2份（2.7%；3.6%；95% Wilson CI：1.0–12.3%）；Anisakis相容谱型合计49/55份阳性记录（89.1%；95% Wilson CI：78.2–94.9%）。按检查年份，有检查日期记录61份，2022年4份、2023年54份、2024年3份，特异性扩增分别为4、40、3份；因分布不均且记录有限，仅作描述，未作统计比较或时间趋势结论。按鱼类别，鱼种身份可获56/74份记录，其中无须鳕（Merluccius spp.）47/56份（83.9%）、鲭鱼（Scomber spp.）8/56份（14.3%）、银鲑（Oncorhynchus kisutch）1/56份（1.8%），其余18份未记录鱼种身份；记录层面阳性率无须鳕为36/47（76.6%；95% CI：62.8–86.4%），鲭鱼为6/8（75.0%；95% CI：40.9–92.9%）；唯一银鲑记录为C. osculatum阳性；36份阳性无须鳕记录中，杂合样谱型27份（75.0%）、A. pegreffii 5份（13.9%）、C. osculatum 4份（11.1%），未检出A. typica；6份阳性鲭鱼记录均为杂合样谱型。无须鳕与鲭鱼记录层面阳性率相近，提示无须鳕阳性绝对数较高主要反映其记录占多数，不能解释为种特异性流行率。按来源，来源可获56/74份记录，西班牙44/56份（78.6%），其余已知来源为英国4份、苏格兰4份、阿根廷1份、美国1份、俄罗斯1份、南美洲1份，18份无来源信息；西班牙记录阳性33/44（75.0%；95% Wilson CI：60.6–85.4%），其他已知来源合计10/12（83.3%；95% Wilson CI：55.2–95.3%）；在已知来源阳性记录中，杂合样谱型在西班牙为25/33（75.8%；95% Wilson CI：59.0–87.2%），其他已知来源为8/10（80.0%；95% Wilson CI：49.0–94.3%）；A. pegreffii分别占12.1%和10.0%，C. osculatum分别占12.1%和10.0%；两份A. typica记录均无来源信息；因其他来源记录少，比较仅作描述。无特异性扩增记录方面，19/74份（25.7%；95% Wilson CI：17.1–36.7%）虽此前形态学分类与异尖线虫或相关蛔总科幼虫相容，但未获特异性PCR扩增；其中无须鳕11份、鲭鱼2份，西班牙11份、英国2份，有检查年份记录者均为2023年（14份）；这些发现为描述性，不能确定无扩增原因。

五、讨论总结与结论翻译
讨论指出，该研究在常规寄生虫学怀疑后选定的进口海产品寄生虫材料中显示较高分子确认比例；Anisakis类群占阳性记录89.1%，A. simplex s.l./A. pegreffii杂合样谱型占阳性记录70.9%。与Mercken et al.、Smagulova et al.等研究比较时，因采样框架、分析单位、标本选择和诊断方法不同，不能直接比较数值；Smagulova et al.的研究为标本层面调查并结合PCR、测序和系统发育分析，而本研究为官方检查中选定分子检测记录，未作序列确认或系统记录寄生虫负荷。Anisakis在数据集中占优势与该属在商业海洋鱼类中的广泛分布相符；A. simplex sensu stricto与A. pegreffii相对贡献存在地理差异，但进口海产品商业来源不等同于捕捞区域。无须鳕记录占多数但阳性率与鲭鱼相近，阳性无须鳕谱型范围更广，但鲭鱼记录仅8份且记录独立性不能确定，应谨慎解释。A. simplex s.l./A. pegreffii杂合样条带谱型不能等同于序列确认或多位点确认的杂合基因型；原则上可能反映真实杂合基因型、受检材料中一个以上DNA模板或检测相关模糊性，现有数据不能解决；该研究未包括测序或多位点核基因分型。A. typica既往在商业鱼中已有分子鉴定报道，但其与人间异尖线虫病的关系不如A. simplex s.s.和A. pegreffii明确，本研究检出主要提示进口海产品中异尖线虫分类多样性，不能视为同等人兽共患风险证据。C. osculatum检出具有相关性，因其幼虫在商业海洋鱼中存在且形态上难以与其他蛔总科幼虫可靠区分；Mehrdana et al.报道A. simplex与C. osculatum蛋白间存在IgE介导交叉反应。19份无特异性扩增说明形态筛查与分子鉴定结合的价值和局限；无扩增可能涉及DNA降解、模板量低、引物–靶标错配等技术限制，阴性分子结果不应自动解释为原形态分类错误；这些记录未重复PCR、未用替代引物或测序确认。分子检测本身不能证明消费时存在活感染性幼虫；冷冻和热处理可灭活活异尖线虫幼虫，欧盟法规规定非吸虫寄生虫相关渔产品通常需?20 °C不少于24 h或?35 °C不少于15 h，或核心温度至少60 °C至少1 min等处理，塞尔维亚法规亦有相应要求；本研究未评估寄生虫活力，分子阳性不得表述为已测定的消费者感染风险。EFSA再评估支持对野生捕捞海洋鱼寄生虫监测的持续相关性。未来监测应将个体分析幼虫与个体鱼和批次关联，记录捕捞区和解剖定位，并在可行时使用确认性测序或多位点标记。

结论部分翻译：该研究强调分子鉴定作为进口海洋鱼类及渔产品常规寄生虫学检查补充工具的价值。检测方法定义的分子条带谱型为形态筛查增加分类信息，但其解释仍受缺乏序列确认、多位点基因分型和活力评估的限制。同时，监测数据的解释应考虑受检材料的结构和相关流行病学元数据的完整性。因此，在鱼类别或记录地理来源之间观察到的差异应视为描述性，不应解释为宿主或来源特异性风险的证据。未来监测将受益于基于唯一样本和批次标识的标准化记录、宿主物种和FAO捕捞区的完整信息、定量寄生虫负荷以及回收幼虫的个体分子鉴定。此类方法将显著增强监测数据的流行病学价值，并为风险评估、时间趋势分析和进口渔产品中异尖线虫的针对性监测提供更稳健的基础。