基于DIA定量蛋白质组学的基因编辑高油酸大豆品种P16连续三代（T5–T7）种子蛋白质表达谱综合分析

《International Journal of Molecular Sciences》：Comprehensive Analysis of Protein Expression Profiles in Seeds of the Gene-Edited High Oleic Acid Soybean Variety P16

本研究采用基于数据非依赖型采集（data-independent acquisition，DIA）的定量蛋白质组学技术，系统表征了fad2-1（编码Δ-12脂肪酸脱饱和酶，催化油酸向亚油酸转化）基因编辑高油酸大豆品种P16连续三代（T₅–T₇）种子的蛋白质组动态变化。与野生型对照大豆品种ZH42相比，从P16 T₅、T₆和T₇世代大豆种子中分别筛选到不同数量（234、112和131）的差异表达蛋白（differentially expressed proteins，DEPs）。功能富集分析显示，这些DEPs显著富集于与"内质网蛋白质加工（protein processing in endoplasmic reticulum，ER）"和/或"过氧化物酶体（peroxisome）"相关的京都基因与基因组百科全书（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG）通路。此外，有8个蛋白在三个世代中均持续差异表达——以下称为持续差异表达蛋白（consistently differentially expressed proteins，coDEPs）。对coDEPs的毒性、抗营养特性和致敏性进行的初步计算机模拟评估表明，所有已鉴定的coDEPs均被预测为无毒、无致敏性且缺乏抗营养活性——但含STI1结构域的蛋白除外，该蛋白经计算预测具有致敏潜力。质谱（mass spectrometry，MS）分析表明，相对于野生型大豆品种ZH42，P16种子中FAD2-1相关肽段的丰度在三个世代中均呈现显著且持续的降低。

**研究背景与立题依据**

大豆（Glycine max）是全球重要的作物，为人类消费提供优质植物蛋白和食用油的主要来源。然而，常规大豆油的脂肪酸组成存在固有局限，约含20–25%的单不饱和脂肪酸（油酸，C18:1）和60%以上的多不饱和脂肪酸，主要为亚油酸（C18:2）和α-亚麻酸（C18:3）。多不饱和脂肪酸的高含量使油脂化学性质不稳定，在高温或长期储存条件下易发生氧化酸败，损害感官品质和货架期。因此，研究人员致力于通过降低亚油酸的过度积累来提高油酸含量。该生物合成途径受脂肪酸脱饱和酶（fatty acid desaturase，FAD）基因家族的严密调控。值得注意的是，定位于内质网、编码Δ-12脂肪酸脱饱和酶的fad2-1基因通过催化油酸向亚油酸转化而发挥关键作用。因此，靶向抑制或敲除fad2-1在理论上是一种阻断该转化、从而提高大豆油油酸水平的有效策略。

基因编辑技术是生物技术的变革性进展，自出现以来发展迅速。其在农业中的应用——包括新型作物种质创制、营养品质改良以及非生物和生物胁迫耐受性增强——已显示出巨大潜力，日益被视为保障全球粮食安全和推进可持续农业实践的关键工具。研究人员已应用基因编辑技术修饰大豆fad2-1基因，成功创制出油稳定性与营养价值改善的高油酸大豆品种。然而，与所有强大技术一样，基因编辑存在需要仔细评估的潜在风险。基因编辑生物的安全性问题日益受到关注，凸显了建立稳健且标准化的安全评估框架的迫切需求。此类评估中的一个关键关切是编辑过程中产生的预期/非预期遗传改变（如插入、缺失或替换）可能导致新蛋白和差异表达蛋白（DEPs）的出现。中国《农业用基因编辑植物安全评价指南（试行）》和《转基因植物安全评价指南》明确规定，当基因编辑导致新蛋白产生或现有蛋白表达发生显著变化时，必须对这些蛋白进行食用安全性评估。因此，本研究采用基于数据非依赖型采集（DIA）的蛋白质组学技术，系统评估大豆P16（在ZH42背景下编辑fad2-1基因）种子全球蛋白质表达谱的变化。

**关键技术方法概述**

本研究以fad2-1基因编辑大豆P16连续三代（T₅、T₆、T₇）种子及野生型对照ZH42为材料。采用PCR扩增结合测序及序列比对确认P16的A、B亚基因组编辑类型及世代稳定性。每个品种进行三次技术重复，经蛋白提取、还原烷基化及胰蛋白酶酶解后，采用Orbitrap Exploris 480质谱仪耦合UltiMate 3000 UPLC和Vanquish Neo UPLC系统以DIA模式进行质谱分析。利用DIA-MS2PEP构建项目特异性DIA谱库，基于Swiss-Prot非冗余序列数据库（补充fad2-1基因编辑推导的新ORF）进行检索，肽段和蛋白FDR均控制在≤1%。采用Median法归一化后进行主成分分析（PCA）和层次聚类。以p<0.05且倍数变化≥5.0为显著上调、≤0.20为显著下调标准筛选DEPs，利用clusterProfiler包（v4.6.0）进行KEGG通路注释与富集分析。通过NCBI ORFfinder预测基因编辑产生的新开放阅读框（ORFs），并依据中国国家标准MOA 1012-19-2026、MOA 1012-18-2026和MOA 2630-16-2017对coDEPs进行毒性、抗营养性和致敏性的初步计算机模拟评估。

**研究结果**

**大豆品种P16基因编辑的分子确认。** 从野生型大豆品种ZH42和fad2-1基因编辑大豆品种P16连续三代（T₅–T₇）收集种子。PCR扩增后测序及序列比对确认，P16的A和B亚基因组在T₅–T₇世代均存在相同的稳定编辑。在编辑的A亚基因组中，于441–465位鉴定到精确的25 bp缺失（5'-ATTGGGTTCTCCAAGGTTGCCTTCT-3'），并伴随495和496位核苷酸间插入单个腺嘌呤（A）。在编辑的B亚基因组中，于1412–1422位检测到11 bp缺失（5'-GGCCAATCTAT-3'），以及跨越1474–1475位的二核苷酸（GA）缺失。这些双等位基因可遗传修饰在ZH42中不存在，且在T₅、T₆和T₇世代完全一致，确认了预期编辑的稳定传递。

**大豆种子全局蛋白质谱分析。** 在三次技术重复中共置信鉴定到5088个蛋白，其中4487–4726个蛋白在不同大豆基因型中被可靠定量。主成分分析（PCA）显示基因型组间清晰分离且组内重现性高，PC1和PC2分别解释总方差的37.20%和20.60%。基于定量蛋白丰度谱的层次聚类进一步表明，野生型品种ZH42与P16 T₆世代（P16T₆）在全球蛋白质组组成上 pairwise 相似性最高；P16T₅和P16T₇彼此紧密聚类并与P16T₆聚在一起。

**差异表达蛋白（DEPs）的鉴定与方向性。** 各比较组相对于野生型对照ZH42的DEPs数量及方向性调控总结如下：在P16T₅/ZH42比较中鉴定到234个DEPs（121个上调，113个下调）；在P16T₆/ZH42中检测到112个DEPs（34个上调，78个下调）；在P16T₇/ZH42中鉴定到131个DEPs（67个上调，64个下调）。

**P16种子DEPs的KEGG通路富集分析。** KEGG通路富集分析显示，三个P16/ZH42比较中鉴定的DEPs主要富集于"内质网蛋白质加工"和/或"过氧化物酶体"。具体而言，在P16T₅/ZH42和P16T₇/ZH42比较中，DEPs显著富集于"碳代谢"；而在P16T₆/ZH42比较中，观察到显著富集于"半乳糖代谢"。

**持续差异表达蛋白（coDEPs）毒性、抗营养特性及致敏性的初步计算机模拟评估。** 8个蛋白在三个P16/ZH42比较中均持续差异表达，本文称为coDEPs。依据中华人民共和国国家标准进行的初步计算机模拟评估表明，仅含STI1结构域的蛋白表现出潜在致敏性，同时被预测为无毒且无抗营养活性。其余7个coDEPs均被一致预测为无毒、无致敏性且缺乏抗营养特性。

**研究大豆P16种子中预测的新ORFs。** 在fad2-1基因编辑产生的假设新开放阅读框（ORFs）中，仅有两个——即预测的FAD2-1a ORF A1和FAD2-1b ORF B3——被质谱（MS）鉴定到。两者均编码编辑基因组位点紧邻上游的相同N端肽段序列（VPNTKPPFTVGQLK）。定量MS分析进一步表明，FAD2-1相关肽段的累积丰度在ZH42种子中显著高于编辑株系P16T₅、P16T₆和P16T₇。

**讨论与结论**

大豆是全球粮食和营养安全的基础作物，提供人类膳食必需的高品质植物蛋白和食用油。靶向编辑大豆fad2-1基因成功改善了大豆油的脂肪酸组成——具体通过提高油酸水平并伴随降低多不饱和脂肪酸——从而改善了油脂的氧化稳定性、货架期和营养特性。然而，与转基因生物（GMOs）类似，基因编辑作物在生物安全评估和监管方面日益受到关注。鉴于种子储藏蛋白是大豆种子中主要的氮素储备，且是农艺性能（如种子活力、萌发效率）和终端利用品质（如蛋白质消化率、致敏性、功能特性）的关键决定因素，其表达谱的细微变化也值得严格表征。

为此，研究人员采用定量蛋白质组学——一种广泛用于转基因作物成分和安全评估的方法——系统表征了FAD2-1编辑大豆品种P16连续三个种子世代（T₅、T₆和T₇）的蛋白丰度。与同源野生型对照ZH42（由单一代种子材料代表）相比，T₅、T₆和T₇中鉴定的差异表达蛋白（DEPs）数量分别为234、112和131。在P16 T₅–T₇世代中鉴定到8个coDEPs。毒性、抗营养特性和致敏性的初步计算机模拟评估表明，仅含STI1结构域的蛋白表现出潜在致敏性。然而，该蛋白并不对应于文献中已充分表征的任何大豆过敏原。为严格评估其致敏潜力，需要额外的实验验证——包括热稳定性试验、模拟胃液消化试验和体内动物研究。基于MS的蛋白质组分析在对照品种ZH42和P16株系中均检测到FAD2-1相关肽段。然而，其在P16种子连续三个世代中的丰度显著下调。值得注意的是，本研究受样本量限制；因此，观察到的含STI1结构域蛋白上调或FAD2-1相关肽段下调仍是初步的。未来需要采用更大规模、统计效能充分的队列研究来确定这种表达变化是否代表可重现的生物学响应而非随机离群值。

**研究结论翻译：** 本研究采用DIA定量蛋白质组学系统表征了fad2-1基因编辑高油酸大豆品种P16连续三代种子的蛋白质表达谱，鉴定到8个持续差异表达蛋白，初步计算机模拟评估显示除含STI1结构域蛋白外均无毒、无致敏性且无抗营养活性，质谱分析证实P16种子中FAD2-1相关肽段丰度较野生型显著且持续降低，为基因编辑大豆的食用安全评价提供了蛋白质组学层面的基础数据。