《International Journal of Molecular Sciences》：Dendritic Cells Undergo Cytoskeletal, Adhesive, and Inflammatory Remodeling During Productive Infection with Vaccinia Virus Western Reserve
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树突状细胞（DCs）是调节先天性和适应性免疫关键环节的专职抗原提呈细胞（APCs）。其功能依赖于动态的细胞骨架重塑和特化的黏附结构，包括足小体（podosomes）和黏着斑（FAs），这些结构协调细胞-基质相互作用、抗原采样以及向淋巴器官的迁移，DCs在淋巴器
树突状细胞（DCs）是调节先天性和适应性免疫关键环节的专职抗原提呈细胞（APCs）。其功能依赖于动态的细胞骨架重塑和特化的黏附结构，包括足小体（podosomes）和黏着斑（FAs），这些结构协调细胞-基质相互作用、抗原采样以及向淋巴器官的迁移，DCs在淋巴器官中启动T细胞应答。非致病性或减毒牛痘病毒（VACV）株虽在DCs中经历顿挫性感染，仍可调节DC功能。然而，VACV Western Reserve株（VACV-WR）——一种在鼠模型中具有显著致病性的高鼠适应性致病株——能否生产性感染DCs及其对DC细胞骨架组织、黏附特性和免疫功能的影响，目前尚不清楚。本研究表明，VACV-WR在鼠粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子（GM-CSF）诱导的骨髓来源树突状细胞（BMDCs）中完成其复制周期并产生感染性子代病毒颗粒。此种生产性感染促进BMDCs的表型成熟，伴随有限的促炎反应，并诱导足小体快速解体，同时伴有FA数量和长度增加。因此，感染细胞中足小体依赖性细胞外基质（ECM）降解被消除。尽管发生了显著的形态学和黏附重塑，VACV-WR感染在二维实验中并未显著改变BMDC的平均迁移距离或速度，但延时分析揭示静止细胞比例显著增加。这些发现表明，VACV-WR诱导BMDCs协调的细胞骨架、黏附和免疫重编程，其功能后果体现在ECM重塑而非基础运动性方面。
**研究背景与问题提出**
树突状细胞（DCs）作为专职抗原提呈细胞（APCs），在先天性和适应性免疫应答的启动与调控中发挥核心作用。DCs通过持续采样微环境检测入侵病原体，并经历伴随细胞形态、细胞骨架组织、黏附、内吞活性、抗原提呈及炎症信号协调变化的动态成熟过程。在此过程中，肌动蛋白细胞骨架和细胞-基质黏附结构的快速重塑改变细胞形态和运动性，而内吞活性的变化逐步使DCs从高效抗原捕获转向抗原加工和提呈。同时，趋化因子受体表达的改变（尤其是CCR7的获得）促进DCs从组织驻留抗原监视向定向迁移至引流淋巴结转变。
DCs中特化的黏附结构包括足小体（podosomes）和黏着斑（FAs），二者协调细胞-基质相互作用与细胞骨架组织及细胞迁移。足小体是富含肌动蛋白的动态多组分结构，主要存在于单核细胞谱系细胞中，其F-actin核心含有WASp、cortactin和Arp2/3复合物等细胞骨架调节因子，周围环绕talin、paxillin和vinculin等黏附相关蛋白。足小体可单独存在或形成簇和玫瑰结，通过基质金属蛋白酶（MMPs）等蛋白水解酶活性实现基质黏附和局部ECM重塑。在DCs中，足小体通过富集模式识别受体（PRRs）促进环境感知和抗原摄取。FAs则由整合素及talin、vinculin、paxillin和黏着斑激酶（FAK）等蛋白组成的多蛋白复合物构成，连接肌动蛋白骨架与ECM，其形成、成熟和解体受肌动蛋白聚合、肌球蛋白II活性和机械力调控。
正痘病毒（OPXVs）进化出多种机制操纵先天性和适应性免疫应答中的重要过程。OPXV在DCs中的感染结局因病毒株和细胞环境而异，从顿挫性感染（如CPXV及VACV的NYCBH、Lister和MVA株）到更广泛的生产性复制（如MPXV和ECTV）。VACV各株间毒力差异与其调节宿主免疫应答的能力相关，高毒力WR株表现出比减毒Lister和MVA株更强的免疫调节活性。然而，尽管VACV-WR作为高毒力鼠适应株已被广泛表征，其能否在DCs中生产性复制及其对DC细胞骨架和黏附组织的影响仍不清楚。因此，本研究探讨VACV-WR感染对小鼠BMDCs的影响，首先评估VACV-WR是否在BMDCs中生产性复制并表征肌动蛋白和微管细胞骨架的重塑，进一步检查感染相关的DC成熟、细胞因子产生和炎症基因表达变化，特别关注足小体和FAs的组织，并通过足小体相关ECM降解和BMDC迁移评估这些结构重塑的功能后果。
**关键技术方法**
研究人员采用GM-CSF诱导的小鼠骨髓来源树突状细胞（BMDCs）培养体系，经CD11c
+ MACS磁珠富集后以MOI=1感染VACV-WR（ATCC VR-1354），在4、8、12和18 hpi进行荧光显微镜分析病毒抗原、F-actin、vinculin、α-tubulin和乙酰化α-tubulin的分布；采用细胞骨架抑制剂（cytochalasin D、nocodazole、taxol）处理结合蚀斑实验评估细胞骨架动态对病毒感染的影响；通过流式细胞术检测MHC II类分子、CD80、CD86表达及细胞内TNF-α、IL-12、CCL3产生；ELISA测定培养上清中TNF-α、IL-12p70和IL-10分泌；RT-qPCR分析M1/M2样极化相关基因表达；采用FITC-纤连蛋白包被的ECM降解实验评估足小体蛋白水解活性；通过划痕实验和延时显微成像分析BMDC迁移。BMDCs来源于8–12周龄雄性BALB/c小鼠。
**研究结果**
**BMDCs支持VACV-WR复制并需要肌动蛋白和微管细胞骨架重塑以实现生产性感染。** 荧光显微镜显示感染后4至18 hpi细胞内病毒抗原逐渐增加，4 hpi可见规则病毒工厂，12–18 hpi出现大型病毒工厂及大量子代病毒颗粒。病毒工厂面积和子代病毒颗粒数在4至12 hpi逐渐增加，12至18 hpi无显著进一步增加。18 hpi近100%细胞显示生产性感染特征。感染细胞发生显著形态重塑，形成长短不一的细胞突起，F-actin重分布并出现肌动蛋白尾，12 hpi近100%感染细胞具有肌动蛋白尾。微管骨架发生显著重排，表现为中心体微管组织中心（MTOC）丢失、MT网络重分布及向细胞周边的MT延伸，同时α-tubulin乙酰化增加。cytochalasin D对病毒复制抑制最强，nocodazole和taxol亦改变病毒分布并减少感染性子代病毒产生，表明VACV-WR在BMDCs中的高效复制依赖肌动蛋白和微管细胞骨架的正确动态调控。
**BMDCs在VACV-WR感染后发生表型成熟和差异性炎症调节。** 与模拟感染相比，VACV-WR感染显著增加MHC II类分子、CD80和CD86的平均荧光强度（MFI）（p < 0.05），诱导表型成熟状态。LPS刺激亦增加三种标志物表达，而VACV-WR感染联合LPS刺激较单独VACV感染或LPS刺激进一步增加MHC II、CD80和CD86表达。与LPS不同，单独VACV-WR感染未显著增加TNF-α、IL-12和CCL3的细胞内产生；VACV-WR感染联合LPS刺激则显著低于单独LPS刺激（p < 0.05）。ELISA检测培养上清中TNF-α、IL-12p70和IL-10呈现相似模式。RT-qPCR显示VACV感染诱导的促炎基因（Ccl5、Cxcl1、Nos2、Il12a、Ifng、Il6、Il1b）变化显著弱于LPS，虽改变部分M2相关基因（Mrc1、Bcl2、Cd36）表达，但未指示连贯的M2样转录程序激活。总体表明VACV-WR诱导BMDCs表型成熟而不触发强烈促炎反应，并能在LPS刺激背景下增强成熟标志物表达同时衰减选定炎症介质。
**VACV-WR感染诱导BMDCs足小体解体和促进黏着斑形成。** 模拟感染BMDCs中足小体在整个观察期持续存在并逐渐组织为簇和玫瑰结，FAs数量相对稳定（约20个/细胞），平均长度从4 h约0.9 μm降至18 h约0.6 μm。VACV-WR感染快速且显著破坏足小体组织，4 hpi已超过75%感染细胞缺乏可检测足小体（p < 0.001），8 hpi增至约90%，整个观察期未见足小体玫瑰结。18 hpi VACV感染BMDCs平均含约46个FAs/细胞（模拟感染约18个），平均FA长度增至约1.04 μm（模拟感染约0.57 μm）（p < 0.01），FA数量和长度在18 hpi较4 hpi显著增加（p < 0.01）。LPS刺激亦促进足小体渐进性解体，但剩余足小体阳性细胞保持单个或簇状结构，FA数量从4 h约63个/细胞增至18 h约86个/细胞（p < 0.001），FA长度在4 h最大（约1.81 μm）后降至18 h约0.72 μm。VACV+LPS联合处理导致足小体几乎完全缺失（18 hpi约96%细胞缺乏足小体），FA数量显著低于单独LPS刺激（p < 0.05），但FA保持相对伸长（约1.04–1.06 μm）。总体表明VACV-WR感染深刻重塑BMDCs黏附结构。
**足小体丢失与VACV-WR感染BMDCs中蛋白水解活性降低相关。** 18 h培养后模拟感染BMDCs中足小体阳性细胞比例高，以簇（约58%）和玫瑰结（约30%）为主，这些结构与显著蛋白水解活性相关，ECM降解定位于足小体占据区域。VACV-WR感染导致足小体结构几乎完全丢失（约99%感染BMDCs缺乏可检测足小体，p < 0.001），伴随足小体相关ECM降解完全缺失。LPS刺激亦显著减少足小体形成（约83%缺乏足小体，p < 0.001），仅小部分保留簇状或玫瑰结样足小体的细胞（各约2%）保持蛋白水解活性（p < 0.001）。ECM降解始终与组织化足小体结构相关，足小体阴性BMDCs未显示可检测蛋白水解活性，表明VACV-WR诱导的足小体解体伴随足小体依赖性ECM降解功能受损。
**VACV-WR诱导的黏附重塑不伴随BMDC迁移增加。** 划痕实验中18 h后VACV感染BMDCs创面区细胞数（约65个）低于模拟感染（约100个），但差异未达统计学显著性。LPS刺激创面区细胞数较高（约145个），VACV+LPS组较低（约60个），差异亦未达显著。单细胞迁移分析显示VACV-WR感染未显著改变细胞总迁移距离（VACV约300 μm，模拟约250 μm）或平均迁移速度（分别约25和23 μm/h）。LPS刺激显著增加总迁移距离（>400 μm；p < 0.05）和平均速度（约34 μm/h；p < 0.05）。进一步延时成像追踪显示模拟感染BMDCs在整个观察期保持活跃运动，而VACV-WR感染细胞表现出运动性降低和长时间静止行为，创面区静止细胞比例显著高于模拟感染对照。总体表明VACV-WR感染单独在二维实验中未显著影响BMDC基础迁移，但延时分析揭示静止细胞比例显著增加。
**讨论与结论**
讨论部分指出，VACV-WR在BMDCs中的生产性感染伴随两大细胞骨架系统的渐进性重组，病毒颗粒沿微管向细胞周边移动并利用病毒诱导的肌动蛋白聚合实现表面运动和细胞间传播，MTOC组织改变可能是生产性OPXV感染诱导的细胞骨架重塑程序的组成部分而非非特异性形态损伤后果。细胞骨架抑制剂实验表明VACV复制周期高效进行不仅需要两种细胞骨架系统的存在，还需保持其适当动态。表型成熟与炎症激活的分离与既往报道一致，VACV可诱导DC成熟的选定特征而不完全保留其免疫功能，VACV-WR还衰减LPS诱导的炎症反应同时进一步增强成熟相关表面标志物表达，这种选择性调节可能与VACV编码的免疫调节蛋白（如A46R、A52R、E3L、K3R）相关。黏附结构重塑方面，VACV-WR诱导快速足小体丢失伴随FA数量和长度增加，与LPS效应不同，后者导致更多但更短的FAs。足小体丢失的功能后果通过ECM降解实验证实，不仅单个足小体的存在而且其高级组织结构程度可能具有功能重要性。尽管发生显著细胞骨架和黏附重塑，VACV-WR感染未显著改变二维基底上BMDC的基础运动性，表明FA数量和大小的增加并不必然转化为迁移减少；但延时分析揭示静止细胞比例显著增加，提示感染影响BMDC运动行为。与ECTV比较，尽管足小体和FA重塑相似，不同正痘病毒感染可能根据迁移分析类型和额外环境线索产生不同功能后果。
研究结论译为：研究表明VACV-WR生产性感染BMDCs，导致肌动蛋白和微管细胞骨架的多层次细胞重组，伴随黏附依赖性结构的显著改变。尽管VACV-WR感染诱导BMDCs表型成熟相关变化，但该过程未伴随同等强度的促炎反应，提示树突状细胞激活程序不同组分之间的分离。同时，足小体快速解体和黏附结构向更多更长FAs的重塑与足小体依赖性细胞外基质降解的丧失相关。重要的是，尽管细胞突起和FAs显著伸长，这些结构变化并未增强单个BMDCs的基础运动性，表明广泛的黏附和细胞骨架重塑并不必然转化为迁移能力增加。此外，尽管VACV-WR感染联合LPS刺激导致创面区平均细胞数低于单独LPS刺激，但该差异未达统计学显著性，应解释为趋势。值得注意的是，延时分析还显示VACV-WR感染培养中更大比例细胞在观察期保持静止，提示其迁移活动可能发生改变。总之，这些发现表明VACV可深刻重编程BMDCs的细胞骨架和黏附结构，同时选择性影响免疫、蛋白水解和迁移功能。
