妊娠前植入期胆碱暴露引起成年牛心脏、骨骼肌和肝脏甲基化组共享改变

《Epigenetics Reports》：Shared changes in the methylome of heart, skeletal muscle, and liver of adult cattle caused by actions of choline during the preimplantation period

胆碱对牛植入前胚胎的发育具有编程作用。研究人员检验了植入前胚胎暴露于胆碱是否会改变成年动物的甲基化组，以及甲基化组改变是否在组织间保守。采用包含43,317个CpG位点的RUMIGEN EpiChip分析来源于体外培养（培养基含赋形剂或1.8 mM氯化胆碱）的胚胎所培育的去势公牛的的心脏、骨骼肌和肝脏的差异甲基化。组织采集于平均580日龄。当采用p < 0.001且DNA甲基化变化≥|15%|的阈值时，共鉴定出60个差异甲基化胞嘧啶（DMC），包括37个高甲基化胞嘧啶和23个低甲基化胞嘧啶。当分析限于转录起始位点3 kb范围内的CpG时，共有26个DMC（16个高甲基化和10个低甲基化）。尽管各组织单独分析时显著DMC较少，但DNA甲基化变化模式呈现高度一致性。在所有组织合并分析时发现的60个显著探针中，除一个外，在分别检查心脏、骨骼肌和肝脏时均显示相似的胆碱效应。用胆碱处理牛植入前胚胎可引起持续至出生后生命阶段的甲基化组改变。

研究背景方面，植入前时期是胚胎微环境变化能够编程发育并改变出生后表型的关键窗口期，其机制推测涉及胚胎表观遗传修饰的改变，这些改变或影响后续发育事件，或被胎儿及出生后动物继承。植入前时期表观基因组经历广泛重塑，包括整体擦除及表观遗传修饰的重新建立。然而至囊胚阶段，胚胎仍处于整体低甲基化状态，牛囊胚胞嘧啶甲基化中位百分比仅为21%–22%，且该阶段大部分甲基化位于将发育为胎盘的三胚层细胞中而非发育为胎儿的內细胞团。因此，发育编程信号可能并非简单修饰植入前胚胎的甲基化组，而是通过表观基因组或其他分子特征的修饰诱导胚胎生理学的其他变化，从而在发育后期产生效应。在能够编程出生后表型的牛植入前胚胎环境因素中，多功能营养素胆碱的可利用性是重要特征之一。胆碱可被磷酸化形成磷脂、乙酰化产生乙酰胆碱，或氧化为甜菜碱参与一碳代谢，为S-腺苷甲硫氨酸提供甲基供体。胆碱还可调控包括AMPK、mTOR及烟碱型受体激活通路在内的细胞信号通路。体外生产的胚胎通常在无胆碱的培养基中培养，而向培养基中补充氯化胆碱可编程囊胚，使所产犊牛在断奶体重及约580日龄屠宰时的胴体重方面较无胆碱培养基来源的犊牛增加。胆碱可能通过调控DNA甲基化发挥编程作用：向胚胎培养基中添加胆碱可增加囊胚的整体DNA甲基化水平；此外，来源于含胆碱培养基所产囊胚的犊牛在4月龄骨骼肌和8月龄全血中均表现出DNA甲基化改变。本研究假设来源于含1.8 mM胆碱培养基培养的植入前胚胎的去势公牛相对于赋形剂对照具有差异甲基化的CpG位点，且处理引起的甲基化组改变在组织间保守。研究人员采用新近开发的牛DNA甲基化芯片评估了约580日龄去势公牛三种组织（心脏、骨骼肌和肝脏）的DNA甲基化水平，这些公牛来源于含或不含1.8 mM氯化胆碱培养基培养的胚胎。

在关键技术方法方面，研究人员采用体外生产胚胎并经胚胎移植获得Brahman去势公牛，胚胎随机分配至含0或1.8 mM氯化胆碱的培养基中培养，该胆碱浓度与产后奶牛子宫液中浓度相近；犊牛在平均239日龄断奶，平均89日龄去势，平均375日龄起饲喂生长日粮至约580日龄屠宰，采集心脏、背最长肌骨骼肌和肝脏样品液氮速冻保存。DNA甲基化分析采用RUMIGEN EpiChip芯片，经Illumina Infinium HTS Methylation Kit进行表观基因分型。数据分析采用SeSaMe包进行归一化，limma包进行差异甲基化分析，模型包含处理、组织和批次的固定效应以及个体公牛的随机效应，另对每个组织单独分析。基因本体富集分析采用ShinyGO，染色体分布采用Pearson卡方分析，处理与组织交互作用采用SAS MIXED程序分析。

研究结果方面，第一，所有出生后组织合并分析时胆碱对DNA甲基化的影响：采用RUMIGEN Epichip评估了37,134个CpG位点的DNA甲基化，主成分分析显示样品按组织类型聚类但赋形剂与胆碱处理样品未分离。采用FDR < 0.05且Δβ ≥ |15%|阈值时鉴定出33个DMC，包括22个高甲基化和11个低甲基化胞嘧啶；采用p < 0.001且Δβ ≥ |15%|阈值时鉴定出60个DMC，包括37个高甲基化和23个低甲基化胞嘧啶。ShinyGO基因本体分析未发现显著通路。染色体分布分析显示DMC分布并非随机而是随染色体变化（p < 0.001），BTA7、BTA11和BTA13频率最高，BTA4、5、8、12、20、28和29无DMC。基因组特征注释显示DMC分布与预期分布无偏差（p = 0.456）。第二，启动子附近CpG的胆碱效应：当分析限于转录起始位点3 kb范围内的CpG时，采用FDR < 0.05且Δβ ≥ |15%|阈值时有16个显著DMC（9个高甲基化和7个低甲基化）；采用p < 0.001且Δβ ≥ |15%|阈值时有26个DMC（16个高甲基化和10个低甲基化）。ShinyGO分析显示Curated Reactome通路包括FGFR2b信号（4个基因）、硫酸角质素降解（7个基因）和RUNX3调控p14-ARF（3个基因），Curated Wiki通路包括软骨内骨化（42个基因）和心脏肥大反应（26个基因）。第三，各组织单独分析鉴定DMC：采用FDR < 0.05且Δβ ≥ |15%|阈值时，心脏有1个DMC（高甲基化），肌肉有0个DMC，肝脏有1个DMC（高甲基化）；采用p < 0.001且Δβ ≥ |15%|阈值时，心脏有9个DMC（6个低甲基化和3个高甲基化），肌肉有4个DMC（3个低甲基化和1个高甲基化），肝脏有15个DMC（6个低甲基化和9个高甲基化）。第四，所有组织分析鉴定的DMC与各组织Δβ值之间的一致性：在所有组织合并分析时确定的60个显著探针中，37个显著高甲基化位点在心脏、骨骼肌和肝脏各组织中均呈同方向高甲基化，尽管多数差异不显著；23个低甲基化位点中，心脏、骨骼肌和肝脏分别有23、22和22个基因呈同方向低甲基化。方差分析显示60个DMC中有49个CpG也受胆碱处理显著影响（p < 0.05），其中34个CpG为高甲基化（13个位于启动子），15个CpG为低甲基化（6个位于启动子）；仅存在3个显著的胆碱与组织类型交互作用，均反映Δβ值幅度在组织间存在差异，无交互作用表现为胆碱在某些组织中引起甲基化增加而在其他组织中引起降低或无效应。

讨论部分总结：这些结果支持先前发现，即牛植入前胚胎经胆碱处理可导致所产犊牛甲基化组改变并持续至出生后生命阶段。先前实验在4月龄和8月龄观察到DNA甲基化改变，分别代表胚胎暴露于胆碱后13–17个月；本研究将植入前胆碱处理影响DNA甲基化的时间窗口延伸至580日龄成年期。根据差异甲基化定义阈值不同，DMC数量范围为33–60个，占所检测CpG的0.08%–0.16%。在相同动物的先前报道中，8月龄血液细胞差异甲基化DNA片段比例为0.4%。因此，本研究结果证实胆碱作用于植入前胚胎以改变出生后时期的DNA甲基化，并证明部分改变在成年期仍然存在。当前结果的重要性不仅在于证明了胆碱对植入前胚胎表观遗传后果的长期性，还在于探讨了这些改变在发育过程中何时被诱导的问题。关键发现是，在所有组织合并分析时鉴定的大多数DMC在三个特定组织中均呈同方向差异甲基化，尽管多数CpG在各组织单独分析时不显著，这很可能由于样本量较小，但胆碱对DNA甲基化效应的方向是保守的。对此结果有两种可能解释：其一，胆碱在心脏、骨骼肌和肝脏前体细胞分化之前某一点引起DNA甲基化改变，且这些改变持续至成年期；心脏和骨骼肌主要来源于中胚层，肝脏主要来源于内胚层，若此解释正确，DNA甲基化改变可能发生在妊娠17–18天原条形成之前，甚至早至囊胚阶段。其二，各组织DNA甲基化改变发生得更晚，甚至可能在出生后时期，因为胆碱的编程作用改变后续生理功能从而影响多种组织的DNA甲基化。一个可能的例子是HDAC4高甲基化，在所有组织合并分析时显著，在肝脏中也显著高甲基化，而在心脏和骨骼肌中呈同方向甲基化。DMC缺乏基因本体术语可能仅反映DMC数量较少，或者DNA甲基化改变至少相对于基因功能而言是随机的。染色体间差异甲基化CpG百分比存在变异，可能由于早期发育过程中基因组某些部分可及性不同。当所有组织分析缺乏基因本体术语促使研究人员仅研究启动子相关探针，Curated Reactome数据库搜索富集于FGFR信号通路，该通路是赋予胚胎下胚层身份的必要通路；其他通路包括硫酸角质素降解和RUNX3调控p14-ARF，后者参与爪蟾神经元发育并被认为参与染色质动态。研究存在一些局限性：处理引起的DNA甲基化表观差异可能代表组织构成的差异，例如一种处理的组织中某种细胞类型多于另一种处理；选择研究心脏、肝脏和骨骼肌是因为这些组织在特定细胞类型上较其他器官异质性更低；也不能排除胆碱处理引起的DNA甲基化改变并非源于囊胚期建立的表观遗传标记的继承，而是胆碱对出生前或出生后生长或代谢的长期效应。总之，这些数据表明胆碱作用于牛植入前胚胎发挥功能从而导致成年期表观遗传改变，组织类型间的保守性提示表观遗传改变或发生在谱系特化之前，或是胆碱编程生理功能的下游后果。研究结论翻译：用胆碱处理牛植入前胚胎可引起持续至出生后生命阶段的甲基化组改变。