《Molecules》：UPLC System for the Analysis of Active Substances from Various Biological Materials
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超高效液相色谱（UPLC）是一种液相色谱技术，与其他色谱方法相比，其特点在于更短的分析时间，这源于使用粒径较小的色谱柱等因素。该技术已被广泛应用于多项科学研究，包括制药和医学研究。本文综合了关于UPLC测定生物材料中化合物的各类出版物信息。所考虑的人类和动物来
超高效液相色谱（UPLC）是一种液相色谱技术，与其他色谱方法相比，其特点在于更短的分析时间，这源于使用粒径较小的色谱柱等因素。该技术已被广泛应用于多项科学研究，包括制药和医学研究。本文综合了关于UPLC测定生物材料中化合物的各类出版物信息。所考虑的人类和动物来源生物材料包括：头发、指甲、血液（全血和血浆）、尿液、组织、唾液和胃液、脑脊液、粪便以及精浆。讨论了每种生物材料的特征以及后续检测所需的适当处理程序。所分析的物质包括来自药物、激素、生物标志物、蛋白质、酶、代谢物、脂类和毒物等基团的化合物。此外，收集的数据还包括UPLC色谱柱的类型和参数、流动相组成、流速、检测方法、总运行时间以及检测限（LOD，Limit of detection）和定量限（LOQ，Limit of quantitation）参数的值。收集的数据可协助分析人员开展广泛的实验室研究，实现对生物材料中活性药物成分浓度的监测，这在治疗学和人类健康背景下至关重要。
1. 引言
超高效液相色谱（UPLC，Ultra-performance liquid chromatography）与超高效液相色谱（UHPLC，Ultra-High-Performance Liquid Chromatography）均采用粒径小于2微米的色谱柱以实现高分辨率分离，但二者在系统设计、柱特性、分离速率及通用性方面存在差异。UPLC的分析时间较传统高效液相色谱（HPLC，High-performance liquid chromatography）可缩短近10倍，UHPLC通常缩短3至5倍。由于采用粒径小于2微米（通常为1.7微米）的填料，UPLC系统需在6000至15000 psi的压力范围内运行，并可通过升高流动相温度降低黏度以提高流速，从而获得更高效率。UPLC可采用正相色谱（RP，Reversed-Phase Chromatography）和亲水相互作用色谱（HILIC，Hydrophilic Interaction Chromatography）两种分离模式。尽管UPLC具有分离度高、分析时间短、溶剂消耗少等优势，但也存在因高压导致柱磨损加快等缺点。本文旨在收集UPLC在生物活性物质的测定数据，为复杂生物材料的方法开发提供参考。
2. UPLC分析条件在多种生物材料中
2.1 血液
血液是反映患者健康状态的重要信息来源，UPLC与高灵敏度质谱（MS，Mass Spectrometry）联用可实现其中多种化合物的准确测定。由于血液基质中含有大量蛋白质、脂类及磷脂，易引发离子抑制或增强等基质效应，因此需进行蛋白沉淀或固相萃取（SPE，Solid-Phase Extraction）等前处理。研究涉及多种治疗药物和毒物监测，如多沙唑嗪、9种精神活性物质的同步测定、22种抗癫痫药物、利奈唑胺与血红蛋白、卡路芬及其代谢产物等。干血斑（DBS，Dried Blood Spots）技术仅需数微升血液，适用于新生儿及儿科检测。
2.2 尿液
尿液是药物代谢物、激素、毒物及疾病生物标志物分析的重要基质。其基质复杂，含高浓度盐类、蛋白质及尿素，易造成离子抑制、色谱柱污染及质谱毛细管堵塞。样品前处理通常包括稀释、SPE及稳定同位素标记内标的使用以补偿基质效应。研究案例涵盖28种挥发性有机化合物代谢物、类固醇激素II期代谢物、双酚A及其代谢物、乙酰肉碱（鉴定数量达355种）、抗肿瘤药物代谢物、甜味剂、人参皂苷、橙皮素及其对映体、慢性肾衰竭生物标志物、多种毒物（如百草枯、敌草快）、吗啡-3-O-硫酸酯（M3S）、吗啡-6-O-硫酸酯（M6S）、乌地那非及其活性代谢物、多种精氨酸衍生物、摇头丸相关物质、淫羊藿成分、积雪草代谢物、尼古丁、肌肽、双歧杆菌代谢物、氨基酸等。
2.3 组织
生物组织是UPLC分析中最复杂的基质之一，含有大量蛋白质、脂类、磷脂及盐类。组织样品前处理通常需经过均质化、SPE或蛋白沉淀。研究涉及甲状腺激素及其代谢物在Wistar大鼠肝、心、下丘脑及人甲状腺组织中的测定；禽类组织中抗病毒药物（金刚烷胺、扎那米韦、奥司他韦、阿昔洛韦）的筛查；13种氨基糖苷类抗生素在猪、鱼和牛肉肝肾中的定量；13种合成生长促进剂（如地塞米松、甲基boldenone、己烯雌酚）在牛肉肌肉中的检测；脑组织中18种磷脂的鉴定用于神经解剖区域识别；UPLC-MS用于正电子发射断层扫描（PET，Positron Emission Tomography）组织中放射性示踪剂的定量；反式阿魏酸-4-β-葡萄糖苷酶（FAG）在大鼠肝和血浆中的测定；sigma-1受体配体MCI-77在小鼠血浆和脑匀浆中的药代动力学研究；磷和硫代谢物在大鼠肝、血浆、尿、胆汁中的分析；9种致痛药在人尿和全血中的测定；未衍生化氨基酸在人血浆和尿中的定量等。
2.4 头发
头发分析的优势在于可评估长期药物暴露（可达数年），且采集、运输和保存方便。头发主要成分为角蛋白，另含脂类、黑色素和矿物质，前处理需经过清洗、去脂、粉碎（通常至约50微米粒径）及SPE。研究涉及65种药物和毒品（包括阿普唑仑、阿米替林、苯丙胺、苯甲酰芽子碱、氯胺酮等）的筛查，检测限低至0.01至0.1纳克/毫克；氯胺酮及其代谢物去甲氯胺酮在2分钟内完成分离；头发中乙基葡萄糖醛酸（EtG，Ethyl Glucuronide）作为长期饮酒标志物；γ-羟基丁酸（GHB，Gamma-Hydroxybutyric Acid）的分离检测。
2.5 指甲
指甲为高度角化组织，需采用液氮低温研磨破坏角质结构以提高提取效率。其采样无创、安全且化合物稳定性高，适用于死后采样。研究涉及晚期糖基化终产物（AGEs，Advanced Glycation End Products）中间体的测定用于糖尿病并发症诊断；人指甲中紫外线滤光剂的检测；地西泮及其3-O-葡萄糖醛酸结合物在指印残留物中的UPLC-MS-MS分析，采用Waters C18色谱柱及特定流动相梯度洗脱程序。
2.6 唾液、泪液和胃液
唾液和胃液均为高复杂度基质，直接进样会导致严重的离子抑制。唾液含高浓度盐、粘蛋白、胆汁酸和蛋白质；胃液pH极低且含胃蛋白酶等消化酶，可致化学不稳定化合物降解。有效的前处理手段包括SPE和蛋白沉淀。研究涵盖唾液中29种非法物质的同步检测，采用200微升唾液样品经稀释、SPE后以UPLC-MS-MS分析；口服给药曲尼司特后胃液中的药代动力学研究，用于确定吸收时间、最大浓度（C
max）及达峰时间（T
max）。
2.7 脑脊液
脑脊液分析在神经系统疾病的诊断、研究和治疗监测中发挥重要作用。UPLC-MS-MS已成功用于脑脊液中组胺及其主要代谢物tele-甲基组胺的测定，检测限达12.5皮摩尔。研究还涉及阿尔茨海默病相关生物标志物，如β-淀粉样蛋白、磷酸化tau蛋白等。Lame等采用混合固相萃取联用UPLC-MS-MS方法实现了人脑脊液中淀粉样蛋白β肽的高效定量，其灵敏度与酶学分析相当，但通量更高且成本更低。此外，UPLC-MS-MS方法可用于通过腰椎穿刺采集的人脑脊液中维生素B6的定量，经三氯乙酸蛋白沉淀及稳定同位素标记维生素B6化合物处理后，可检测吡哆醛和吡哆醛-5-磷酸的降低浓度。
2.8 粪便
粪便作为代谢组学研究对象具有高度异质性，取样重现性差。UPLC-Q-TOF-MS已用于监测肠道移植排斥反应，通过回肠造口术液或粪便样品分析11例排斥和45例非排斥患者的代谢谱；亦用于健康人及肝硬化、肝细胞癌患者的粪便代谢组学研究，样品经甲醇处理、离心、过滤后直接上样。前处理策略包括均质化、蛋白和脂类沉淀、离心去除大颗粒及沉淀脂类。
2.9 精浆
精浆分析可用于男性不育症的潜在异常识别及相关科学研究。Wang等建立了UPLC-MS-MS方法用于检测人精浆中整体DNA甲基化，采用特定流动相（5.0%甲醇和95%含0.1%甲酸的水相），流速0.3 mL/min，为男性不育表观遗传机制研究提供了工具。尿苷含量分析采用HSS T3色谱柱（100 × 2.1 mm，1.7微米）及含0.1%甲酸的乙腈-水梯度洗脱。
3. 总结
UPLC与其他色谱技术相比表现出更高的效率和可靠性。较高的工作压力带来更快流速，结合短色谱柱缩短保留时间，且溶剂消耗更少，环境更友好。生物样品（全血、组织、血浆、头发、指甲、尿液等）含有蛋白质、脂类、磷脂和盐类，在UPLC-MS-MS分析中可与分析物竞争电离，导致离子抑制、离子增强，降低定量灵敏度与准确度。因此需采用SPE、蛋白沉淀等先进样品制备技术，并使用同位素标记内标以最小化基质效应。生物分析方法的验证需符合监管指南（如ICH M10），评估选择性、基质效应、校准曲线线性、回收率、稳定性、精密度和准确度。定量下限（LLOQ，Lower limit of quantification）应满足准确度在±20%以内、精密度（CV，Coefficient of Variation）不超过20%。不同生物材料的处理难度各异：全血因红细胞、高蛋白含量和高黏度极具挑战；组织需均质化及多步纯化；血浆因白蛋白、球蛋白和磷脂浓度高，常需蛋白沉淀或SPE；尿液蛋白质含量较低，处理相对简单。UPLC-MS-MS结合高灵敏度检测器显著降低了样品需求量（常规HPLC-UV常需0.5–2 mL，而LC-MS-MS/UPLC-MS-MS仅需10–100微升血清或数毫米干血斑），推动了从毫升级到微升级分析的转变，对儿科、新生儿科等样品量受限场景具有革命性意义。在色谱柱选择方面，BEH C18柱因适用于中等及低极性化合物而应用最广；HSS T3柱更适用于高极性代谢物；HILIC柱则用于保留能力不足的强极性化合物。检测方式上，电喷雾电离（ESI，Electrospray Ionization）源应用最广泛，三重四极杆质谱用于靶向定量分析，而四极杆-飞行时间质谱（QTOF，Quadrupole Time-of-Flight）等非靶向仪器多用于代谢组学和生物标志物发现。
4. 实际建议
基于综述文献，可提出UPLC生物分析方法开发的实用决策框架。对于低极性至中等极性化合物（包括大多数药物、脂类、异生物素及其代谢物），BEH C18柱仍是首选固定相；对于极性较大且在反相条件下保留不足的分析物，HSS T3柱可在保持反相优势的同时增强保留；对于极性极强且无法在RP条件下有效保留的分析物（如氨基酸、核苷、糖类及内源性代谢物），HILIC柱提供更佳的分离选择。样品制备策略应根据分析目标和基质复杂度确定：蛋白沉淀适用于快速、高通量分析，而SPE更适合需要更高灵敏度、选择性和降低基质效应的痕量定量场景；组织分析通常需要均质化、提取及额外纯化，尿液则常仅需稀释、过滤或SPE。检测方式的选择应反映研究目的：MS/MS是靶向定量分析的首选；高分辨率质谱（QTOF/TOF-MS）最适用于非靶向分析和代谢组学应用；紫外（UV，Ultraviolet）、光电二极管阵列（PDA，Diode Array Detector）、二极管阵列检测器（DAD）或荧光检测器成本较低、仪器简单，适用于常规已知分析物的分析。该决策框架有助于研究者针对特定分析物、基质和分析目标更合理地选择色谱条件。
