《Microorganisms》：Analysis of Metagenomic Sequencing Characteristics of Vaginal Microbiota in Vaginal Inflammatory Diseases
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阴道炎是一种影响女性的良性疾病。由于致病菌种类多样，不同类型的阴道炎各具特征及治疗方法。本研究旨在探讨不同类型阴道炎是否与女性生殖道内不同的微生物群相关，以及细菌是否可能具有特定功能。本研究为横断面研究，纳入53名受试者（阴道炎患者40例；健康女性13例），均
阴道炎是一种影响女性的良性疾病。由于致病菌种类多样，不同类型的阴道炎各具特征及治疗方法。本研究旨在探讨不同类型阴道炎是否与女性生殖道内不同的微生物群相关，以及细菌是否可能具有特定功能。本研究为横断面研究，纳入53名受试者（阴道炎患者40例；健康女性13例），均为北京大学人民医院妇科门诊就诊接受检查者。采集每名受试者的阴道分泌物，样本用于宏基因组测序。研究结果表明，各类型阴道炎患者的阴道微生物群多样性均增加。AV（需氧菌性阴道炎）患者的阴道微生物群主要由Streptococcus、Enterococcus和Prevotella组成。Mobiluncus mulieris是AV_BV（需氧菌性阴道炎合并细菌性阴道病）组患者的重要生物标志物。健康组、AV组、AV_BV组和BV组间的CARD（综合抗生素耐药数据库）分析显示，健康组中耐药基因efrB的相对丰度显著高于其他阴道炎组。健康组中免疫调节相关毒力因子LOS（脂寡糖，毒力因子，VF0044）的相对丰度显著低于AV组、AV_BV组和BV组。微生物组成分析在AV_BV组和VVC_BV（外阴阴道假丝酵母菌病合并细菌性阴道病）组中鉴定出显著的BV相关细菌组分。微生物群中的抗生素耐药基因亟需临床关注。
阴道炎是育龄期女性最常见的妇科疾病之一，超过70%的女性一生中至少经历一次阴道炎发作。健康女性下生殖道阴道微生物群以Lactobacillus（乳杆菌属）为优势菌，通过维持酸性阴道pH和产生过氧化氢等保护性代谢产物抑制条件致病菌的过度生长和侵袭，构成抵御外源性和内源性病原体感染的关键防御屏障。阴道微生态失调可破坏这一保护状态，改变包括Candida albicans（白假丝酵母菌）和Gardnerella vaginalis（阴道加德纳菌）在内的致病菌群的丰度和结构，从而引发以VVC（外阴阴道假丝酵母菌病）和BV（细菌性阴道病）为代表的常见阴道感染性疾病。AV（需氧菌性阴道炎）是另一种常见的阴道炎症性疾病，以显著的阴道微生物群失调和微生物多样性增加为特征，传统培养方法鉴定的主要致病菌谱包括B族链球菌、Escherichia coli（大肠埃希菌）和Staphylococcus aureus（金黄色葡萄球菌），临床上与早产、流产、PROM（胎膜早破）和死胎等严重不良妊娠并发症密切相关。值得注意的是，约4.44%至35.06%的阴道炎女性同时患有至少两种类型的阴道炎，即混合性阴道炎，此类患者常表现出涉及线索细胞形成和多需氧菌定植的复杂临床表现。与单一类型阴道炎相比，混合性阴道炎面临相当大的临床治疗挑战，主要由于多微生物间相互作用不明确、致病机制重叠以及微生态改变模式不一致，阻碍了精准靶向治疗和疾病复发干预。既往研究已描述了BV、AV和混合性阴道炎的临床和微生物学特征，但BV相关混合性阴道炎（AV_BV和VVC_BV）与单纯AV或BV之间在分类学组成和功能基因谱方面的差异尚不清楚。传统阴道炎临床诊断主要依赖形态学显微镜检查，可表征优势阴道微生物的表面多样性和密度，但无法检测稀有、低丰度和苛养病原体，导致对复杂混合感染的诊断准确性有限。尽管16S rRNA基因测序相比传统形态学方法推进了阴道细菌群落组成的全面分析，但基于这些数据的功能分析依赖于预测而非功能基因的直接测序。鸟枪法宏基因组测序通过同时分析微生物基因库和分类学组成拓展了该方法，使得基于序列的功能潜力分析成为可能。本研究采用探索性描述性设计，无预设因果假设或验证性统计检验，这与微生物组分析研究的探索性性质一致。同时，研究人员还专门比较了健康女性与AV、AV_BV和BV组之间抗菌药物耐药基因和毒力相关基因的二次探索性分析，以补充阴道微生物组成，评估AV_BV是否与单一疾病具有相同的功能群落特征或表现出不同特征。本研究聚焦于微生物组特征与阴道炎亚型之间的描述性关联分析，所得发现可作为初步微生态证据，为阐明亚型特异性微生物特征及支持阴道炎精准临床诊断和治疗策略的开发提供依据。研究人员开展了一项横断面观察性研究，纳入2025年8月至10月间北京大学人民医院妇科门诊就诊的53名参与者（阴道炎患者40例，健康女性13例），分为VVC（n=12）、VVC_BV（n=8）、AV（n=10）、AV_BV（n=3）、BV（n=7）和健康组（n=13）六组。研究得出以下结论：各类型阴道炎患者阴道微生物群多样性增加；AV组以Streptococcus为标志属；AV_BV组中Mobiluncus mulieris为重要生物标志物；健康组efrB耐药基因相对丰度显著高于各阴道炎组；健康组LOS相关毒力因子相对丰度显著低于AV、AV_BV和BV组；AV_BV和VVC_BV组中鉴定出显著的BV相关细菌组分。这些发现加深了对阴道炎阴道微生物群独特特征的理解，并为治疗改进提供了依据。研究的重要意义在于，通过宏基因组测序系统表征了不同阴道炎亚型与健康对照之间独特的耐药组和毒力组特征，为理解不同类型阴道炎的微生态失调提供了初步的假设生成性基因组证据，支持阴道炎精准临床诊断和治疗策略的开发。
研究人员采用的主要关键技术方法包括：于受试者黄体期采集阴道侧壁上三分之一处阴道分泌物，提取总DNA后经Covaris S220随机片段化至350 bp进行双端文库构建，在Illumina NovaSeq? X Plus平台开展鸟枪法宏基因组测序；原始reads经fastp质控、BWA去除人源序列后，使用Prodigal预测ORFs，CD-HIT构建非冗余基因集，SOAPaligner估算基因丰度；通过DIAMOND比对NCBI NR蛋白数据库进行分类学注释，并比对CARD（综合抗生素耐药数据库）和VFDB（毒力因子数据库）进行ARG（抗生素耐药基因）和VF（毒力因子）功能注释；采用Kruskal-Wallis秩和检验进行多组比较，LEfSe（线性判别分析效应量）筛选组间差异微生物生物标志物。样本队列来源为北京大学人民医院妇科门诊。
研究结果如下：3.1 健康女性与阴道炎患者阴道微生物群多样性分析——通过对40例阴道炎患者和13例健康女性样本进行宏基因组测序，获得1763.45 Gb原始数据和119.10 Gb干净数据，阴道微生物群分类为77个门、1308个属和4095个种。基于Ace指数，BV组微生物丰富度显著高于健康组和VVC组；基于Shannon指数，健康组与BV和AV_BV组间、VVC组与AV_BV组间存在显著差异，表明AV_BV和BV亚组群落均匀度改变；基于Chao指数，AV和AV_BV组α多样性高于健康女性。β多样性分析显示健康组与AV、BV、VVC、AV_BV和VVC_BV组间阴道微生物群多样性存在显著差异（R=0.568，p=0.001）。3.2 阴道微生物群组成分析——健康组属水平以Lactobacillus（91.5%）为最高丰度，显著高于其他组；BV组以Gardnerella（57.8%）为主；AV_BV组以Gardnerella（34.58%）最丰富，Fannyhessea（15.72%）和Mobiluncus（12.86%）次之；AV组以Streptococcus（39.82%）丰度最高；VVC组以Lactobacillus（83.87%）为主；VVC_BV组以Gardnerella（58.71%）为主。种水平上，健康组Lactobacillus crispatus（46.05%）和Lactobacillus iners（26.81%）最丰富；AV组Streptococcus sp.（29.11%）最丰富。AV组Streptococcus相对丰度显著高于其他各组，为AV的标志属；AV_BV组Mobiluncus属和Mobiluncus mulieris种相对丰度显著高于其他所有组（均p<0.001）。3.3 LEfSe差异分析——健康组与AV组间11种微生物存在显著变化（LDA>4），AV组中Streptococcus sp.、Enterococcus sp.、Prevotella bivia等显著富集，健康组中Lactobacillus crispatus、Lactobacillus iners等显著富集；健康组与AV_BV组间10种微生物存在显著变化，AV_BV组中Mobiluncus mulieris、Fannyhessea vaginae、Gardnerella vaginalis等显著富集；AV_BV与AV组间12种微生物存在显著差异，AV组中Streptococcus sp.等显著富集，AV_BV组中Gardnerella vaginalis、Fannyhessea vaginae、Mobiluncus mulieris等显著富集。3.4 毒力因子和抗生素耐药功能潜力差异——健康组efrB基因相对丰度显著高于AV、AV_BV和BV组（均p<0.01）；健康组novA、tetB(60)和tetA(46)基因相对丰度显著高于BV组（p<0.01）；AV_BV组macB、msbA和TaeA相对丰度显著高于健康组；BV组macB、mlaF、msbA和patB相对丰度显著高于健康组；AV组macB和RanA相对丰度显著高于健康组。健康组免疫调节相关毒力因子LOS（VF0044）相对丰度显著低于AV、AV_BV和BV组（均p<0.001）；健康组营养/代谢因子相关毒力因子MgtBC（VF0106）相对丰度显著高于AV、AV_BV和BV组（均p<0.001）。
讨论部分总结：本研究通过宏基因组测序表征了53名参与者（健康对照和五个单一或混合性阴道炎组）的阴道微生物组成，并重点对健康对照与AV、BV和AV_BV组进行了探索性耐药和毒力相关基因分析。Lactobacillus是正常阴道微生物群的主要细菌，其特定菌种的优越性和相对丰度对维持阴道生理状态至关重要。阴道微生物群失衡可能导致包括AV和BV在内的多种阴道疾病。本研究中AV组Streptococcus丰度最高，其次为Enterococcus和Prevotella；AV组Streptococcus相对丰度显著高于AV_BV、BV、健康、VVC和VVC_BV组。混合性阴道炎指同时存在至少两种类型的阴道炎，导致阴道环境异常。本研究中AV_BV组α多样性高于健康女性，Gardnerella最丰富，其次为Fannyhessea和Mobiluncus；VVC_BV组Gardnerella、Lactobacillus和Fannyhessea为前三位优势属。AV_BV和VVC_BV两种混合性阴道炎共享常见BV相关细菌群落组分，但仍存在描述性组成差异。AV和混合性阴道炎治疗过程中阴道Lactobacillus丰度增加可能有助于减少疾病复发。抗菌药物耐药是阴道炎症治疗失败的最大威胁之一，携带ARG的细菌可能成为优势病原体。ABC型药物外排泵macB高度保守且广泛分布于细菌物种中，与健康对照相比，macB基因相对丰度在多个阴道炎亚组中显著升高；AV_BV混合感染组表现出macB和msbA基因的一致富集模式，表明混合性阴道炎微生物群落具有不同于健康微生态的独特耐药组谱。健康参与者中efrB、novA、tetB(60)和tetA(46)的较高相对丰度应在阴道耐药组背景下解读，阴道健康并不意味着缺乏耐药决定因子；DNA检测鉴定的是推定耐药潜力而非基因表达、转运体活性或表型抗生素耐药。LOS作为革兰阴性菌的关键结构组分，通过TLR4/NF-κB信号通路介导宿主免疫激活和炎症反应，本研究中AV、AV_BV和BV组LOS相关毒力基因特征相对丰度显著高于健康对照，表明富集的LOS相关基因组毒力潜力与阴道微生态失调和阴道炎发生密切相关；微生态保护因子MgtBC在健康个体中显示显著更高的基因组丰度，提示其在维持阴道微生态稳态中的潜在作用。本研究存在若干局限性：第一，为单中心横断面研究，结果最直接适用于相似的育龄期门诊女性人群；第二，样本量小，尤其是混合性阴道炎亚组（AV_BV，n=3；VVC_BV，n=8），亚组特异性观察应仅作为初步和假设生成性结果解读；第三，功能分析仅基于宏基因组基因注释，未进行表型耐药检测、转录组验证或功能实验，观察到的ARG和VF丰度差异反映遗传潜力而非表达的表型耐药或毒力。
研究结论部分翻译：在本横断面研究中，研究人员利用宏基因组测序表征了AV、BV、VVC和两种混合性阴道炎女性的阴道微生物群组成和功能基因谱，特别关注AV、AV_BV和BV。物种组成分析鉴定出AV中以Streptococcus为主的组成以及AV_BV中显著的BV相关细菌组分。健康、AV、AV_BV和BV组间的比较进一步鉴定出所选抗生素耐药和毒力因子注释的差异，将物种组成分析拓展至基因组功能潜力；这些发现为初步结果，代表推断的功能潜力而非确认的临床耐药性或致病活性。未来需要更大规模的多中心研究结合表型验证来确认这些初步关联并评估其潜在临床相关性。
