IDO1通过EZH2的甲基化作用，通过改变色氨酸-犬尿喹啉代谢途径，使结直肠癌对靶向治疗产生耐药性

《Cell Reports》：IDO1 methylation by EZH2 confers resistance to its targeted therapy in colorectal cancer through tryptophan-kynurenine metabolic rewiring

亮点：
• 在体CRISPR筛选确定IDO1是EZH2抑制剂耐药性的关键中介因子
• EZH2甲基化IDO1，破坏其与USP14的相互作用并抑制其去泛素化
• EZH2抑制激活IDO1介导的色氨酸-犬尿氨酸代谢
• 针对IDO1依赖的色氨酸代谢可以克服对EZH2靶向治疗的耐药性

摘要：
阐明癌症代谢重编程机制可以识别新的靶点，以增强EZH2抑制剂的疗效。通过在CRC小鼠模型中进行体内全基因组CRISPR功能缺失筛选，我们确定IDO1是EZH2抑制剂耐药性的关键中介因子。EZH2阻断通过上调IDO1蛋白并过度激活色氨酸-犬尿氨酸途径来重塑CRC细胞的代谢。无论是遗传学还是药理学上的IDO1抑制均能在体外和体内抑制肿瘤生长并恢复EZH2抑制剂的效果。从机制上看，EZH2直接结合并甲基化IDO1，甲基化促进IDO1的泛素化及其后续降解。因此，EZH2抑制可稳定IDO1，增加色氨酸-犬尿氨酸代谢流量，最终导致治疗耐药性。总之，我们的研究将IDO1确定为EZH2甲基转移酶活性的非组蛋白底物，并验证了破坏IDO1介导的色氨酸代谢是克服癌症中EZH2靶向治疗耐药性的可行策略。

引言：
结直肠癌（CRC）是全球第三大常见癌症。尽管目前的治疗依赖于传统的手术、放疗和化疗，但仍有约30%-40%的患者在术后复发。因此，迫切需要更有效的治疗策略。Zeste同源物2（EZH2）是多梳蛋白抑制复合体2（PRC2）的核心催化亚基，它催化组蛋白3赖氨酸27位的三甲基化（H3K27me3），从而导致染色质状态的凝聚和基因沉默。EZH2经常过度表达，在肿瘤细胞的增殖、侵袭和转移中起关键作用。针对EZH2已成为一种有前景的治疗策略。然而，尽管EZH2抑制剂在某些血液系统恶性肿瘤中显示出良好的治疗效果，但在实体瘤中的抗癌活性非常有限。值得注意的是，2020年1月获批的首个EZH2抑制剂tazemetostat在2026年3月因确认性III期SYMPHONY-1试验中发现继发性血液系统恶性肿瘤的安全信号而全球自愿撤回。这一事件表明，尽管EZH2是一个关键的癌基因，但系统性地研究EZH2仍需要彻底评估。有趣的是，多项研究表明，EZH2在介导组蛋白H3K27三甲基化中的典型功能并不总是与癌症的不良预后相关。这些发现表明，非典型机制参与了肿瘤的发展。事实上，越来越多的证据表明，在胶质母细胞瘤和肝癌的发展中，EZH2可以作为甲基转移酶作用于非组蛋白，如STAT3和β-连环蛋白。目前尚不清楚EZH2依赖的非典型途径是否导致了EZH2抑制剂在CRC细胞中的疗效不佳。因此，了解EZH2如何调节CRC进展对于克服药物耐药性和扩大EZH2抑制剂在实体瘤中的应用至关重要。

代谢重编程是癌细胞的特征，表现为代谢酶的失调、调控节点的变化以及致癌信号通路的变化。氨基酸代谢影响多种细胞过程，包括氧化还原平衡、通过三羧酸（TCA）循环产生能量以及核苷酸和脂质的生物合成。肿瘤细胞表现出氨基酸代谢重编程，以支持致癌过程。氨基酸合成/分解的失调使细胞在治疗效果下存活。这可能导致各种肿瘤对抗癌治疗的适应性耐药性。目前，关于氨基酸代谢是否参与对EZH2抑制剂治疗的适应知之甚少。通过犬尿氨酸途径的色氨酸代谢通过细胞增殖、转移和免疫逃逸等机制促进肿瘤发生。值得注意的是，通过色氨酸从头合成途径合成的NAD+在胶质瘤和肺癌中赋予治疗耐药性。吲哚胺-2,3-双加氧酶1（IDO1）是催化色氨酸分解为犬尿氨酸的关键限速酶，它在多种人和小鼠组织中表达。IDO1水平升高与黑色素瘤、血液系统恶性肿瘤和结直肠癌患者的总体生存率降低有关。然而，IDO1依赖的色氨酸代谢在赋予EZH2抑制剂耐药性中的作用仍不清楚。

在这项研究中，我们调查了EZH2抑制剂耐药性背后的代谢基因和调控通路。IDO1被确定为在EZH2抑制剂治疗下维持CRC细胞生长的关键中介因子。从机制上看，EZH2与IDO1物理相互作用并介导其甲基化，这种修饰促进IDO1的泛素化和随后的蛋白酶体降解。在EZH2抑制下，这种降解过程减弱，导致IDO1蛋白稳定和色氨酸-犬尿氨酸途径活性增加。这些发现共同支持针对IDO1是克服耐药性和提高CRC中EZH2靶向治疗效果的合理策略。

结果：
• 体内CRISPR-Cas9筛选显示，在EZH2抑制下IDO1对于持续的肿瘤生长是必需的
为了识别导致CRC治疗中对EZH2抑制剂产生耐药性的基因，我们使用含有17190个针对2865个代谢相关基因的sgRNAs和5719个非靶向对照sgRNAs的慢病毒敲除小鼠库（mGeCKOv2）进行了体内CRISPR功能缺失筛选。在EZH2抑制剂（EPZ6438）存在下，携带EPZ6438耐药基因的sgRNAs的细胞从突变细胞池中被清除，相应的sgRNAs也被耗尽。使用先前描述的方法通过负选择富集了与EPZ6438耐药性相关的潜在代谢驱动基因。收集细胞进行sgRNA条形码测序（图1A），并确定了一系列耗尽或富集的基因（表S1）。EPZ6438组与对照组之间的肿瘤大小和小鼠体重没有显著差异（图S1A和S1B）。

图1 体内代谢基因组CRISPR-Cas9筛选显示，在EZH2抑制下IDO1对于持续的肿瘤生长是必需的

图注：
(A–C) 通过皮下注射慢病毒转导的MC38细胞到NOD-SCID小鼠中建立肿瘤，然后用对照或EZH2抑制剂EPZ6438（100 mg/kg）处理。n = 5。
(A) 体内代谢基因组CRISPR-Cas9筛选策略示意图。
(B) 基于对照组和EPZ6438处理的小鼠肿瘤中识别出的耗尽基因的KEGG通路富集分析。
(C) 在(B)中识别出的参与辅因子生物合成的耗尽基因的RRA评分。
(D and E) MC38细胞转染scramble、si-Ido1或si-Tdo2 24小时，然后按指示用DMSO或EPZ6438（25 μM）处理。
(D) 活细胞成像分析。n = 6。
(E) MC38细胞的集落形成分析。
(F–I) 载有scramble或sh-Ido1的小鼠用载体或EPZ6438（100 mg/kg，i.p.）处理。n = 11。
(F) 肿瘤建立和处理方案示意图。
(G) 终点时切除的肿瘤代表性图像。比例尺，1 cm。
(H) 治疗期间的肿瘤生长曲线。
(I) 终点时的肿瘤重量。

数据以均值±SEM表示。统计显著性通过(D)和(I)中的单因素ANOVA后跟Tukey的多重比较测试确定，在(H)中通过双因素ANOVA后跟Tukey的多重比较测试确定。?p < 0.05。另见图S1；表S1和S2。

KEGG通路分析显示，辅因子生物合成通路（p值：7.73E-30；计数：76）在与EPZ6438耐药性相关的基因中最为显著富集。此外，碳代谢（p值：4.12E-16；计数：52）、嘌呤代谢（p值：4.29E-15；计数：55）、嘧啶代谢（p值：2.55E-13；计数：30）和氨基酸生物合成（p值：3.08E-13；计数：35）基因也可能与EPZ6438的功能相关（图1B）。在参与辅因子生物合成途径的76个基因中，吲哚胺2,3-双加氧酶1（Ido1）和色氨酸2,3-双加氧酶（Tdo2）的RRA评分最低，表明这些基因的丢失显著增强了细胞对EPZ6438治疗的敏感性（图1C；表S2）。

IDO1和Tdo2是催化色氨酸（Trp）转化为犬尿氨酸（Kyn）的关键酶，这是犬尿氨酸途径（KP）的关键步骤。KP通过其中间代谢物促进细胞增殖，并为辅因子生物合成提供前体，包括NAD+/NADP和一碳单元，从而促进碳、嘌呤和嘧啶代谢及能量代谢。IDO1和Tdo2表现出不同的组织特异性表达模式和相关生理功能。IDO1广泛表达在肝外组织中，包括肠道，并具有更广的底物特异性，而Tdo2主要表达在肝脏中。多项研究表明，CRC细胞中的IDO1和Tdo2水平均升高。

为了评估IDO1和Tdo2在结直肠癌中的潜在作用，我们在存在或不存在EZH2抑制剂的情况下沉默了结直肠癌细胞系中的IDO1和Tdo2。首先检查了Ido1和Tdo2 siRNAs的敲低效率（图S1C）。转染了针对Ido1而非Tdo2的siRNA的MC38细胞在EZH2抑制剂处理下的细胞增殖减少，这通过Incucyte?活细胞增殖分析和集落形成分析得到了证实（图1D和1E）。这些数据表明IDO1可能在CRC细胞对EZH2抑制剂的耐药性中起重要作用。

为了测试IDO1是否影响CRC对EPZ6438的体内耐药性，使用野生型MC38细胞和Ido1缺陷型MC38细胞建立了皮下肿瘤模型（图1F和S1D）。EPZ6438单药治疗未能抑制野生型MC38肿瘤小鼠的肿瘤生长。相反，在Ido1缺陷型MC38肿瘤小鼠中观察到肿瘤大小和重量的显著减小（图1G–1I）。总体而言，这些结果表明IDO1介导了CRC细胞对EPZ6438的耐药性。

• EZH2抑制在体外触发CRC细胞的色氨酸代谢重编程
为了研究EZH2是否影响与IDO1相关的代谢过程，对用EPZ6438或DMSO处理的MC38细胞进行了非靶向代谢组学分析。共检测到337种代谢物，包括葡萄糖、氨基酸和脂肪酸。偏最小二乘判别分析（PLS-DA）显示EPZ6438和处理DMSO的细胞之间存在明显的代谢谱差异（图2A；表S3）。通过VIP评分和热图（图2B和2C）确定的主要代谢物中，脯氨酰羟基脯氨酸、山梨醇、L-色氨酸和甲基胆碱显著减少，而鸟苷、鸟嘌呤、胞苷、胞嘧啶和别嘌呤醇增加。进一步富集分析显示芳香族氨基酸（包括苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸生物合成及色氨酸代谢）的差异代谢物显著富集（图2D和2E；表S4和S5）。这些发现表明EZH2抑制改变了色氨酸代谢。

图2 EZH2抑制在体外触发CRC细胞的色氨酸代谢重编程

图注：
(A–E) 用DMSO或EZH2抑制剂EPZ6438（25 μM）处理48小时的MC38细胞的非靶向代谢组学分析。n = 4。
(A) 主成分分析（PCA）。
(B) 投影中的变量重要性（VIP）评分图。
(C) KEGG通路富集分析。
(D and E) 不同丰度代谢物的通路分析。
(F) 基于用DMSO或EPZ6438（25 μM）处理48小时的HCT116细胞的靶向代谢组学分析的色氨酸代谢示意图。
(G) 通过靶向代谢组学测量的HCT116细胞中指定代谢物的相对丰度和代谢物比率。

数据以均值±SEM表示。统计显著性通过(G)中的双尾非配对Mann-Whitney测试确定。n.s.，不显著，?p < 0.05。另见图S2，表S3、S4、S5和S6。

色氨酸主要通过犬尿氨酸途径分解，该途径处理超过95%的色氨酸生成犬尿氨酸（Kyn）、3-羟基犬尿氨酸（3-HK）、3-羟基安妥酸（3-HAA）、吡喹啉酸（PA）和NAD+等。一小部分通过色氨酸羟化酶（TPH）转化为5-羟基色氨酸（5-HTP）、5-羟基色胺（5-HT）、N-乙酰血清素（NAS）和褪黑素，或通过芳香族L-氨基酸脱羧酶（AADC）生成色胺。此外，研究还发现色氨酸-吲哚丙酮酸-吲哚-3-丙酮酸（I3P）-吲哚-3-乙酰胺（IAM）-吲哚-3-乙醛（IAld）代谢途径也存在于肿瘤细胞中，并可能具有免疫抑制作用。对HCT116细胞的靶向代谢组学分析显示，EPZ6438处理显著增加了Kyn/Trp比率并降低了PA/Kyn比率。EZH2抑制对5-HTP/Trp或TRM/Trp比率等没有显著影响（图2F和2G；表S6）。这表明CRC细胞中的色氨酸可能在EZH2抑制下被导向KP途径。这与图1B中的KEGG通路分析一致。为了进一步验证上述发现，使用液相色谱-质谱（LC-MS）测量了用EPZ6438或DMSO处理的HCT116细胞中的Trp和Kyn水平。结果显示，在EZH2抑制后Kyn/Trp比率一致增加（图S2A）。此外，非靶向代谢组学分析还显示，在MC38细胞中，接受EPZ6438处理的组与DMSO组相比，Kyn/Trp比率显著增加（图S2B）。为了将这些观察结果扩展到细胞系和小鼠模型之外，患者来源的结直肠癌类器官（PDOs）也接受了相同的药理学干预。与先前的发现一致，EZH2抑制剂显著提高了PDOs中的Kyn/Trp比率（图S2C）。总体而言，这些结果表明EZH2抑制剂将Trp的代谢途径重新定向为犬尿氨酸途径。此外，IDO1相关通路的上调有助于CRC细胞对抗EZH2抑制剂。

EZH2在K101-198和K209-257区域的多个位点与IDO1结合并对其进行甲基化。作为一种组蛋白甲基转移酶，EZH2通常催化组蛋白的三甲基化，这种修饰直接导致其靶基因的转录抑制。此外，EZH2还可以与非组蛋白底物相互作用，从而调节它们的甲基化和稳定性。为了阐明EZH2在结直肠癌中调节IDO1的机制，首先检测了EPZ6438处理后的IDO1 mRNA水平。EZH2抑制后未观察到IDO1转录水平的显著变化（图S3A），这表明EZH2可能不通过转录途径调节IDO1。相反，研究了EZH2对IDO1的翻译后修饰。共免疫沉淀（Co-IP）实验显示，在CRC细胞中无论内源性还是外源性条件下，EZH2和IDO1之间存在物理相互作用（图3A–3D）。为了研究EZH2是否直接与IDO1结合，使用纯化的重组蛋白进行了体外GST pull-down实验。GST标记的EZH2与His标记的IDO1表现出强烈的物理相互作用，而GST对照组未能沉淀IDO1，证实了EZH2和IDO1之间的特异性和直接相互作用（图3E）。与IDO1类似，TDO2也是一种关键酶，催化犬尿氨酸代谢途径的决策步骤。然而，与EZH2和IDO1之间的强烈相互作用不同，GST标记的EZH2未能沉淀TDO2，显示出EZH2和IDO1相互作用的选择性（图S3B）。随后的免疫荧光分析显示，在IFN-γ刺激的HCT116细胞中，内源性的IDO1和EZH1显著共定位，因为这些细胞中IDO1的表达被强烈诱导（图3F和3G）。由于EZH2通常在其组成的PRC2复合物（包括SUZ12和EED）内发挥甲基转移酶活性，因此研究了IDO1是否与该复合物结合。共IP实验表明，IDO1可以 reciprocally 沉淀SUZ12和EED，表明IDO1整合到了PRC2复合物中或与其接近（图S3C）。这些数据共同表明EZH2和IDO1之间存在直接相互作用。

图3 EZH2在K101–198和K209–257区域的多个残基处与IDO1结合并对其进行甲基化。

图3：EZH2在K101–198和K209–257区域的多个残基处与IDO1结合并对其进行甲基化

图注释：
(A–D) 在HCT116 (A)、MC38 (B)、HCT116 (C) 和 SW480 (D) 细胞中，对EZH2和IDO1之间的外源性或内源性相互作用进行共免疫沉淀分析。
(E) GST pull-down实验显示纯化的His-IDO1与GST-EZH2之间的直接结合。
(F 和 G) 在HCT116细胞中对EZH2和IDO1进行免疫荧光分析。左图为代表性图像（F）；右图为沿指定线条的荧光强度线性扫描分析（G）。比例尺为1 μm。
(H) 在EZH2缺乏的HCT116细胞中，对His-IDO1与Flag标记的野生型EZH2或指定的EZH2点突变体之间的相互作用进行共免疫沉淀分析。
(I) 对IDO1与GST标记的野生型EZH2或EZH2-Q28A之间的结合进行GST pull-down分析。
(J) HCT116细胞分别用DMSO或EPZ6438 (25 μM)处理48小时后，进行抗IDO1免疫沉淀，并用泛甲基-赖氨酸抗体进行免疫印迹以评估IDO1的甲基化。
(K–L) 体外甲基化实验显示EZH2依赖性的IDO1甲基化（K）以及EZH2-Q28的必要性（L）。反应使用了指定的His-IDO1、GST或GST-WT、[3H]-SAM和EPZ6438组合。上图为放射自显影；中间图为GST/GST-EZH2的免疫印迹；下图为IDO1输入物的抗His免疫印迹。
(M) IDO1赖氨酸替换突变的示意图。
(N) 使用指定的His标记的WT或His标记的IDO1赖氨酸替换突变体、GST-EZH2和[3H]-SAM进行体外甲基化谱分析。上图为放射自显影；中间图为GST/GST-EZH2的免疫印迹；下图为底物输入物的抗His免疫印迹。
(G) 中的数据以平均值±标准误差（SEM）表示。除非另有说明，否则显示至少三个独立实验的代表性数据。另见图S3；表S1、S7、S8、S9、S10和S11。

为了研究EZH2和IDO1之间的潜在分子界面，设计了针对EZH2相互作用区域内多个暴露于溶剂的残基的点突变。将带有Flag标签的野生型和突变型EZH2构建体（Flag-WT、-S21A、-Q28A、-R31A和-E147A）表达在EZH2敲低细胞中进行共IP实验。虽然Flag-R31A和Flag-E147A突变体保持与Flag-WT相当的IDO1结合能力，但Flag-Q28A替换显著破坏了EZH2和IDO1之间的相互作用，而S21A对结合具有轻微的抑制作用（图3H和S3D–S3F）。为了确定Gln28是否直接介导EZH2和IDO1的结合界面，使用纯化的重组GST标记的野生型EZH2（GST-WT）、GST标记的EZH2-Q28A突变体（GST-EZH2-Q28A）和His-IDO1进行了体外GST pull-down实验。与细胞数据一致，GST-WT强烈沉淀His-IDO1，而GST-EZH2-Q28A的IDO1结合能力降低了约50%（图3I和S3G）。这些结果表明，EZH2的Gln28是一个对EZH2和IDO1直接物理相互作用至关重要的残基。

为了研究EZH2结合IDO1的功能后果，评估了EZH2抑制剂对IDO1甲基化的影响。如图3J所示，在EZH2抑制剂存在下，IDO1的甲基化显著减少，表明EZH2负责IDO1的修饰（图3J和S3H）。一致地，使用S-腺苷-L-[甲基-3H]蛋氨酸（[3H]-SAM）作为甲基供体的体外甲基化实验表明，EZH2直接甲基化IDO1。这种修饰通过EZH2的化学抑制或EZH2 Q28A突变显著受到抑制。这些数据证实，完整的EZH2和IDO1结合界面对于有效的IDO1甲基化是必需的（图3K–3L和S3I–S3J）。

为了确定EZH2靶向的IDO1具体区域，使用[3H]-SAM对一系列His标记的野生型IDO1和四个连续的赖氨酸替换构建体（K13-74、K101-198、K209-257和K323-401（WT、K13-74R、K101-198R、K209-257R和K323-401R）进行了体外甲基化实验（图3M）。观察到K101-198R和K209-257R IDO1突变体的放射性甲基信号显著减少，而在其他突变体中保持了强烈的标记，表明这两个区域是IDO1的主要甲基化热点（图3N和S3K）。此外，进行了靶向LC-MS/MS分析以明确识别领域扫描实验所映射的IDO1甲基化位点。这些数据证实了内源性和外源表达的IDO1中K116、K135和K209的甲基化，而在CRC细胞中外源表达的IDO1中仅检测到K141、K161和K257的甲基化（表S7、S8、S9和S11）。总的来说，我们的发现表明EZH2通过Q28位点与IDO1结合，并在K101-198和K209-257区域介导IDO1的甲基化。

IDO1的甲基化破坏了其与USP14的相互作用，促进了IDO1的泛素化及其降解
IDO1的磷酸化与其蛋白质稳定性密切相关。然而，EZH2介导的甲基化在这个过程中的作用尚不清楚。因此，通过环己酰亚胺抑制CRC细胞中的蛋白质合成来检测IDO1的蛋白质稳定性。EZH2抑制剂处理显著减缓了IDO1的降解，表明蛋白质稳定性增强（图4A和S4A）。研究表明，IDO1通过蛋白酶体途径降解，并且泛素特异性蛋白酶14（USP14）通过去除其泛素链并阻止其蛋白酶体依赖性降解来稳定IDO1。因此，接下来检查了EZH2抑制剂是否影响IDO1与USP14之间的相互作用。实际上，EZH2的抑制增强了CRC细胞中IDO1与USP14之间的相互作用（图4B），并且在用蛋白酶体抑制剂MG132处理后减少了泛素化IDO1的水平（图4C和S4B）。为了验证上述表型是否由EZH2的酶功能介导，稳定化的EZH2敲低细胞过表达了全长野生型EZH2或催化失活的ΔSET突变体。结果显示，与野生型EZH2相比，表达ΔSET催化失活EZH2的细胞中IDO1的泛素化显著减少（图4D）。总之，这些遗传结果表明EZH2的催化功能控制了IDO1的泛素化。为了确定USP14是否对EZH2抑制剂诱导的IDO1积累是必需的，通过shRNA在HCT116细胞中敲低了内源性的USP14（图S4C）。值得注意的是，失去USP14可以逆转IDO1的泛素化水平降低（图4E），显著加速IDO1的周转，并完全消除EZH2抑制的稳定效果（图4F），确定USP14是介导EZH2抑制下游IDO1蛋白质稳定的关键效应因子。这些结果表明，EZH2介导的IDO1甲基化破坏了其与USP14的相互作用，从而防止了USP14介导的去泛素化并最终导致其降解。

图4：IDO1的甲基化破坏了其与USP14的相互作用，促进了IDO1的泛素化

图注释：
(A) HCT116细胞分别用DMSO或EPZ6438 (25 μM)处理48小时，然后用环己酰亚胺（CHX）处理指定的时间。左图为代表性免疫印迹；右图为剩余IDO1蛋白水平的定量。n = 3。
(B) HCT116、SW480和MC38细胞表达His-WT-IDO1，分别用DMSO或EPZ6438 (25 μM)处理48小时，然后用指定的抗体进行抗-USP14免疫沉淀和免疫印迹。
(C) HCT116细胞分别用DMSO或EPZ6438 (25 μM)处理48小时，再用MG132 (10 μM)处理6小时后再收获。通过抗IDO1免疫沉淀和抗多聚泛素免疫印迹分析IDO1的多聚泛素化。
(D) shRNA敲低EZH2的HCT116细胞用全长EZH2（FL-EZH2）或EZH2ΔSET重组后，用MG132 (10 μM)处理6小时后再收获。IDO1的多聚泛素化分析方法同(C)。
(E) 转染scramble或shUSP14的HCT116细胞分别用DMSO或EPZ6438 (25 μM)处理48小时，然后用MG132 (10 μM)处理6小时后再收获。IDO1的多聚泛素化分析方法同(C)。
(F) 转染scramble或shUSP14的HCT116细胞分别用DMSO或EPZ6438 (25 μM)处理48小时，然后用CHX处理指定的时间。左图为代表性免疫印迹；右图为剩余IDO1蛋白水平的定量。n = 3。
(G) 表达His-WT-IDO1或指定的IDO1突变体的HCT116细胞分别用DMSO或EPZ6438 (25 μM)处理48小时，然后用CHX处理指定的时间。左图为代表性免疫印迹；右图为剩余IDO1蛋白水平的定量。n = 3。
(H) 表达His-WT-IDO1或His-K257R-IDO1的HCT116细胞分别用DMSO或EPZ6438 (25 μM)处理48小时，然后用CHX处理指定的时间。左图为代表性免疫印迹；右图为剩余IDO1蛋白水平的定量。n = 3。
(I) 表达His-WT-IDO1或His-K257R-IDO1的HCT116细胞分别用DMSO或EPZ6438 (25 μM)处理48小时，然后用MG132 (10 μM)处理6小时，再进行抗-USP14免疫沉淀和免疫印迹。

数据以平均值±标准误差（SEM）表示。除非另有说明，否则显示至少三个独立实验的代表性数据。另见图S4；表S1、S7、S8、S9、S10和S11。

为了进一步确定控制IDO1蛋白质稳定性的精确IDO1甲基化位点，根据图3N的结果生成了分别携带K101-198R和K209-257R的His标记IDO1突变体质粒。由K209-257R突变体表达的IDO1蛋白表现出比WT显著增强的稳定性，这种现象再现了EZH2抑制剂的效果。然而，这种表型在K101-198R突变体中没有观察到（图4G）。这些数据表明，K209-257区域的甲基化促进了IDO1的蛋白酶体依赖性降解。随后在K209-257区间内进行定点突变，发现K209和K257可能是关键的甲基化残基，因为与WT和其他突变体相比，K209R和K257R突变体的放射性甲基信号显著减弱（图S4D）。然而，仅K257的突变而不影响K209显著抑制了IDO1的降解，表明K257在调节IDO1稳定性中起功能作用（图4G）。实际上，K257R突变消除了IDO1-USP14相互作用的增强效应，并消除了EZH2抑制引起的IDO1泛素化减少（图4H和4I）。总之，这些发现表明EZH2可以甲基化IDO1。IDO1的K257残基负责USP14的结合，从而调节IDO1的泛素化及其后续降解。IDO1的抑制可以对抗EPZ6438在体内和体外诱导的结直肠癌细胞的代谢重编程和药物耐药性。为了进一步研究IDO1在EPZ6438抗肿瘤作用中的作用，使用了一种有效的IDO1小分子抑制剂NLG919来阻断IDO1的活性。IDO1抑制剂NLG919与EZH2抑制剂EPZ6438联合使用显著抑制了CRC细胞的增殖（图5A和5B）。值得注意的是，NLG919选择性地靶向IDO1的酶活性，而不干扰EZH2介导的IDO1甲基化或整体H3K27me3水平（图S5A和S5B），证实了其靶点的特异性。相应地，EPZ6438单药治疗诱导了适度的细胞凋亡，而与NLG919联合使用时这种效应进一步增强（图5C、5D和S5C）。USP14的基因敲除也显示出类似的结果：暂时的USP14下调额外增强了生长抑制作用（图5E）。代谢组学分析显示，EZH2的抑制引发了特征性的IDO1依赖性代谢重编程（图S5D），增加了犬尿喹啉酸与色氨酸（Kyn/Trp）的比例并降低了细胞内的Trp水平，这些变化在NLG919联合使用时得到了逆转（图5F；表S12）。值得注意的是，联合组相对于单独使用任一抑制剂时表现出明显的NAD+积累（图5F），这一点通过独立的NAD+定量测定得到了证实（图S5E）。与上述结果一致，NLG919逆转了EZH2抑制引起的IDO1酶活性的增加（图5G和S5F）。

**图5：IDO1抑制在体外对抗EPZ6438诱导的CRC细胞代谢重编程和药物耐药性**
**图例说明：**
(A) HCT116、SW480和MC38细胞的活细胞成像分析。n = 5.
(B) 培养7天后HCT116、SW480和MC38细胞的菌落形成检测。
(C) 经过48小时处理后，使用Annexin V/PI染色并通过流式细胞术分析HCT116细胞的凋亡情况。
(D) （C）中显示的凋亡细胞的定量统计。n = 4。
(E) 在表达scramble或shUSP14的细胞中，使用DMSO或EPZ6438（25 μM）处理HCT116细胞的活细胞成像分析。n = 4。
(F) 通过靶向代谢组学测定的HCT116细胞中指定代谢物的相对丰度和代谢物比例。n = 5。
(G) HCT116细胞中的IDO1酶活性。n = 4。
(H和I) 在有无色氨酸的情况下，使用DMSO或EPZ6438（25 μM）处理CRC细胞。
(H) HCT116和MC38细胞的活细胞成像分析。n = 6。
(I) 在PBS或NMN（100 μM）存在下，使用DMSO、EPZ6438（25 μM）和/或NLG919（20 μM）处理HCT116和SW480细胞的菌落形成检测。n = 4。
数据以平均值±SEM表示。统计显著性通过双向ANOVA后进行Tukey多重比较测试确定。除非另有说明，否则显示至少三个独立实验的代表数据。n.s.表示无显著性；?p < 0.05。
(A–D和F及G) 结直肠癌（CRC）细胞分别用DMSO、EZH2抑制剂EPZ6438（25 μM）、IDO1抑制剂NLG919（20 μM）或组合处理。另见图S5；表S12。

同样，Trp的耗竭显著增强了EPZ6438对CRC增殖的抑制作用，这表明IDO1催化的Trp代谢产生的下游代谢物可能是CRC增殖的关键介质（图5H和5I）。外源性补充NMN（NAD+的前体）增强了EZH2抑制剂介导的肿瘤细胞增殖抑制作用，但未能进一步增强联合组的效果（图5J）。综合这些数据表明，NLG919对IDO1的抑制增强了EPZ6438在CRC细胞中的抗肿瘤效果。

为了评估IDO1抑制剂在体内的疗效，将MC38细胞皮下植入免疫缺陷小鼠体内。然后给小鼠注射对照组、EZH2抑制剂EPZ6438（100 mg/kg，ip.）、IDO1抑制剂NLG919（50 mg/kg，ip.）或两者组合（图6A）。与对照组或单抑制剂处理组相比，联合组的肿瘤生长显著减少（图6B、6C和S6A），而所有组的小鼠体重保持相当（图S6B）。治疗结束时采集的肿瘤样本的免疫组化（IHC）染色显示，EZH2抑制后IDO1表达上调。通过IHC在单独的肿瘤切片上评估了多个标志物（图6D）。值得注意的是，EPZ6438和NLG919联合使用显著减少了增殖的肿瘤细胞数量，并显著增加了凋亡细胞的数量（图6D）。

**图6：抑制IDO1活性可缓解CRC细胞对EPZ6438的体内耐药性**
**图例说明：**
(A–D) 通过将MC38细胞皮下接种到NOD-SCID小鼠体内建立肿瘤，随后分别用对照组、EZH2抑制剂EPZ6438（100 mg/kg，ip.）、IDO1抑制剂NLG919（50 mg/kg，ip.）或两者组合进行治疗。n = 7。
(A) 实验设计示意图。
(B) 治疗结束时的肿瘤切除图像。
(C) 治疗期间的肿瘤生长曲线。
(D) 用免疫组化染色EZH2、IDO1和Ki67，以及用免疫荧光染色TUNEL的肿瘤切片。比例尺，100 μm。
(E–H) 人CRC类器官中的联合治疗。类器官分别用DMSO、EPZ6438（25 μM）、NLG919（20 μM）或两者组合处理24–72小时。
(E) 类器官处理工作流程示意图。
(F) 类器官的明场图像。
(G) 通过ATP发光检测测量的类器官数量。n = 5。
数据以平均值±SEM表示。统计显著性通过双向ANOVA后进行Tukey多重比较测试确定（C、G和H）。?p < 0.05。另见图S6。

为了进一步评估这些发现的转化相关性，检查了EZH2和IDO1抑制剂在PDOs中的疗效。分离出十二个PDOs，进行培养并接受药物治疗（图6E）。高内涵成像结果显示，同时接受EPZ6438和NLG919处理的PDOs在第3天就出现广泛收缩并呈现坏死，而仅接受EPZ6438或NLG919处理的PDOs则没有这种变化（图6F）。与对照组和单药治疗组相比，双抑制剂处理组的类器官数量和存活率均显著降低（图6G和6H）。总体而言，这些数据表明，IDO1的抑制通过抑制增殖和促进CRC细胞凋亡来增强EPZ6438的疗效。

**图7：双重抑制IDO1和EZH2可以改善体内免疫微环境和治疗效果**
**图例说明：**
(A–D) 通过将MC38细胞皮下接种到NOD-SCID小鼠体内建立肿瘤，随后分别用对照组、EZH2抑制剂EPZ6438（100 mg/kg，ip.）、IDO1抑制剂NLG919（50 mg/kg，ip.）或两者组合进行治疗。n = 7。
(A) 实验设计示意图。
(B) 治疗结束时的肿瘤切除图像。
(C) 治疗期间的肿瘤生长曲线。
(D) 用免疫组化染色EZH2、IDO1和Ki67，以及用免疫荧光染色TUNEL的肿瘤切片。比例尺，100 μm。
(E–H) 人CRC类器官中的联合治疗。类器官分别用DMSO、EPZ6438（25 μM）、NLG919（20 μM）或两者组合处理24–72小时。
(E) 类器官处理工作流程示意图。
(F) 类器官的明场图像。
(G) 通过ATP发光检测测量的类器官存活率。n = 5。数据以平均值±SEM表示。统计显著性通过双向ANOVA后进行Tukey多重比较测试（C和H）。?p < 0.05。另见图S6。

为了进一步评估这些发现的转化相关性，还检查了EZH2和IDO1抑制剂在PDOs中的疗效。分离出十二个PDOs，进行培养并接受药物治疗（图6E）。高内涵成像结果显示，同时接受EPZ6438和NLG919处理的PDOs在第3天出现广泛收缩并呈现坏死，而仅接受EPZ6438或NLG919处理的PDOs则没有这种变化（图6F）。与对照组和单药治疗组相比，双抑制剂处理组的类器官数量和存活率均显著降低（图6G和6H）。总体而言，这些数据表明，IDO1的抑制通过抑制增殖和促进CRC细胞凋亡来增强EPZ6438的疗效。

由于缺乏有效的治疗手段，CRC的预后仍然较差。然而，靶向EZH2抑制剂最近面临双重困境：血液系统恶性肿瘤的二次复发风险以及在实体瘤中的低响应性。因此，迫切需要更精细的机制解析。在这里，我们阐明了如何使EZH2抑制剂在CRC中发挥作用，从而为这种侵袭性疾病建立了一种有前景的治疗策略。我们报告说，EZH2和IDO1抑制剂在体内和体外模型中协同作用，共同抑制肿瘤生长并促进肿瘤凋亡。从机制上讲，EZH2抑制剂对IDO1甲基化的抑制增强了IDO1蛋白的稳定性，并加速了色氨酸向犬尿喹啉酸的转化。这种代谢重编程使CRC对EZH2抑制剂产生耐药性，表明IDO1是一个有希望的治疗靶点，可以提高其在实体瘤中的疗效。

先前的研究确定了参与CRC发病机制的多个代谢调节节点，包括丙酮酸、脂质和氨基酸的代谢重编程。我们还报告说，EZH2抑制剂在肿瘤中引起了广泛的代谢重编程。此外，我们之前对黑色素瘤的非靶向代谢组学分析显示，EZH2抑制剂降低了大多数氨基酸的水平，同时显著增加了细胞内的犬尿喹啉酸水平（图S7D）。IDO1和TDO2是催化色氨酸代谢转化为犬尿喹啉酸的初始和限速步骤的关键酶。它们的异常激活会导致神经退行性疾病、衰老相关疾病和癌症。与TDO2相比，IDO1在肿瘤中的表达范围更广，且研究更加深入。尽管先前的研究已经证实，在特定的CRC遗传亚型中，由TDO2介导的KP通路在肿瘤存活中起着更关键的作用，但我们发现，在CRC中是对EZH2靶向药物产生耐药性的原因是IDO1，而不是TDO2。这种差异可能源于Ido1或Tdo2缺乏的结肠癌细胞对体内肿瘤微环境的适应方式不同。我们提出，在这种情况下IDO1的优势源于其在CRC中的较高基础表达，并且其通过EZH2的特异性调控进一步放大。此外，Ido1缺乏和Tdo2缺乏的克隆对肿瘤微环境的补偿性适应可能有所不同。这些因素共同解释了IDO1在介导对EZH2抑制的耐药性中的特定作用。此外，EZH2的抑制触发了显著的色氨酸-犬尿喹啉酸代谢途径。这一发现意味着这种EZH2靶点耐药机制可能在不同类型的肿瘤中普遍存在。

已经鉴定出了IDO1的几种翻译后修饰，包括磷酸化、乙酰化、硝化和泛素化。小鼠中Tyr115和Tyr253的磷酸化在IDO1与细胞因子信号抑制剂3（SOCS3）的相互作用以及随后的蛋白酶体依赖性降解中起重要作用。IDO1中Tyr15、Tyr345和Tyr353的硝化抑制了IDO1的酶活性，但不影响IDO1的蛋白水平。在CRC中，USP14使IDO1去泛素化，从而抑制了TRIM21（一种E3泛素连接酶）介导的IDO1降解。在这项研究中，我们发现甲基化是IDO1的一种新的翻译后修饰。具体来说，K257残基的突变改变了IDO1的蛋白酶体依赖性降解，这表明K257相关的甲基化可能调节IDO1的周转。然而，我们目前缺乏证据表明EZH2会在K257位点修饰内源性IDO1。此外，IDO1甲基化是否还调节其他翻译后修饰仍有待阐明。

已知EZH2通过催化H3K27的三甲基化来介导基因沉默。EZH2在多种癌症中过度表达，许多研究集中在PRC2介导的肿瘤抑制因子的抑制作为EZH2的主要致癌机制上。最近的研究表明，EZH2还可能修饰非组蛋白蛋白，如转录因子NF-κB、c-Myc、β-catenin、deleted in liver cancer 1（DLC1）和STAT3。我们的数据显示，IDO1在结肠癌细胞中与EZH2发生物理相互作用。还需要进一步研究TDO2和IDO2是否也结合EZH2。据我们所知，IDO1可能是第一个作为EZH2靶点的氨基酸相关代谢酶。此外，通过EZH2介导的IDO1在结肠直肠癌细胞中的甲基化，证明了该基因在调节IDO1蛋白稳定性中的作用。结合使用EZH2抑制剂及其直接靶点可能会提供更有效的策略，以提高治疗效果并减少治疗各种癌症的毒性。总之，我们发现IDO1介导的色氨酸代谢重编程是结肠直肠癌对EZH2抑制剂产生抗性的关键驱动因素。存在一个非经典的甲基化调控代谢轴，在该轴中，EZH2直接结合并甲基化IDO1，从而促进其泛素化 and 降解。药理学抑制EZH2可以稳定IDO1，激活色氨酸-犬尿氨酸代谢并导致治疗抗性。重要的是，联合抑制EZH2和IDO1可以克服这种适应性反应，通过抑制肿瘤细胞活力和增强抗肿瘤免疫力来发挥抗肿瘤作用。这项研究为克服EZH2抑制剂耐药性和IDO1抑制剂在结肠直肠癌及其他实体瘤中疗效有限的问题提供了机制基础和可转化的组合策略。

尽管我们的研究表明联合抑制EZH2和IDO1可以增强患者来源的结肠直肠癌类器官的抗肿瘤效果，但这些机制见解主要来自小鼠模型，可能无法完全再现人类疾病的实际情况。因此需要在临床样本中进行进一步验证，包括直接评估患者组织中的相关通路以及研究饮食中限制色氨酸对结肠直肠癌进展的治疗潜力。此外，鉴于EZH2抑制剂tazemetostat的最近撤出，其与IDO1联合使用的疗效需要在临床上进行评估。由于我们发现IDO1甲基化是一种可被EZH2催化的新翻译后修饰，未来的研究应该探索健康个体和患者队列中IDO1功能相关残基的潜在突变及其对IDO1介导的细胞增殖和免疫抑制的影响。重要的是，虽然K257对IDO1的稳定性具有功能重要性，但尚未直接证明IDO1在K257位点的内源性甲基化。需要生成一个针对IDO1 K257位点的特异性甲基化抗体，以严格测试该位点在体内条件下的甲基化情况。从机制上讲，尽管IDO1与PRC2复合体相互作用并且可以在体外被EZH2甲基化，但其他PRC2组分与IDO1的结合是否具有功能意义仍需进一步研究。

**研究的局限性**
尽管我们的研究表明联合抑制EZH2和IDO1可以增强患者来源的结肠直肠癌类器官的抗肿瘤效果，但这些机制见解主要来自小鼠模型，可能无法完全反映人类疾病的实际情况。因此需要在临床样本中进行进一步验证，包括直接评估患者组织中的相关通路以及研究饮食中限制色氨酸对结肠直肠癌进展的治疗潜力。此外，鉴于EZH2抑制剂tazemetostat的最近撤出，其与IDO1联合使用的疗效需要在临床上进行评估。由于我们发现IDO1甲基化是一种可被EZH2催化的新翻译后修饰，未来的研究应该探索健康个体和患者队列中IDO1功能相关残基的潜在突变及其对IDO1介导的细胞增殖和免疫抑制的影响。

**作者贡献**
L.X.、P.B. 和 Z.G. 设计了研究，监督了研究并获得了资金支持。Y.T.、Z.H. 和 Y.J. 主要完成了实验。Y.G.、X.C.、R.J.、Q.Y.、J.S.、H.C. 和 X.Z. 协助了实验和数据收集。X.Z. 和 Y.J. 提供了关键资源。R.C. 和 J.Y. 参与了研究。所有作者都审阅、编辑并批准了手稿。

**利益声明**
作者声明没有竞争利益。

**在本文准备过程中使用生成式AI和AI辅助技术**
在准备本文时，作者使用了ChatGPT（OpenAI）来帮助提高文本的可读性、语法和清晰度。使用该工具/服务后，作者根据需要审查并编辑了内容，并对发表文章的内容负全责。

**方法**
**关键资源表**
| 抗体 | 来源 | RRID |
|------------|------------------|-------------------|
| 兔多克隆抗IDO1 | Proteintech | Cat# 13268-1-AP; RRID: AB_2123444 |
| 兔多克隆抗IDO1 | Cell Signaling Technology | Cat# 86630; RRID: AB_2636818 |
| 小鼠多克隆抗IDO1 | Abcam | Cat# Ab156787 |
| 兔单克隆抗EZH2 | Cell Signaling Technology | Cat# 5246: RRID: AB_10694683 |
| 兔单克隆抗H3K27me3 | Cell Signaling Technology | Cat# 9733S: RRID: AB_2616029 |
| 兔多克隆抗泛甲基赖氨酸 | Abcam | Cat# Ab7315 |
| 兔多克隆抗USP14 | Proteintech | Cat# 14517-1-AP |
| 小鼠单克隆抗GAPDH | Applygene | Cat# C1312 |
| 小鼠单克隆抗α-微管蛋白 | Bioss | Cat# BSM-33034 |
| 兔多克隆抗α-微管蛋白 | Bioss | Cat# 4511 |
| 兔多克隆抗GST | Proteintech | Cat# 10000-0-AP; RRID: AB_11042316 |
| 兔多克隆抗His标签 | Proteintech | Cat# 66005-1-Ig; RRID: AB_1123259 |
| 兔单克隆抗DYKD | Proteintech | Cat# 80801-2-RR; RRID: AB_3670488 |
| 兔多克隆抗泛素 | Cell Signaling Technology | Cat# 58395S |
| 兔单克隆抗Ki67 | Cell Signaling Technology | Cat# 12202 |
| 兔多克隆抗TDO2 | Proteintech | Cat# 15880-1-AP |
| 兔单克隆抗CD8 | Cell Signaling Technology | Cat# 98941 |
| 兔单克隆抗GZMB | Cell Signaling Technology | Cat# 44153 |
| ISG15抗体 | Proteintech | Cat# 15981-1-AP |
| 兔单克隆抗FoxP3 | Cell Signaling Technology | Cat# 12653 |
| 小鼠单克隆抗IgG | Immunoway | Cat# VN0005 |
| 兔单克隆抗IgG | Proteintech | Cat# 30000-0-AP; RRID: AB_2819035 |
| HRP标记的山羊抗兔IgG | ZSGB-BIO | Cat# ZB-2301: RRID: AB_274741 |
| HRP标记的山羊抗鼠IgG | ZSGB-BIO | Cat# ZB-2305: AB_274741 |
| AF488标记的山羊抗兔IgG | Yeasen | Cat# 33106 |
| ES60AF594标记的山羊抗鼠IgG | Yeasen | Cat# 33212 |
| AF488标记的山羊抗鼠IgG | ZSGB-BIO | Cat# ZF-0512 |
| AF488标记的山羊抗兔IgG | ZSGB-BIO | Cat# ZF-0513 |

**资源可用性**
如需更多信息、资源和试剂，请联系负责人Lixiang Xue（[e-mail]）。

**材料可用性**
本研究未生成新的材料。

**数据和代码可用性**
- CRISPR-Cas9筛选的测序数据已存储在Sequence Read Archive (SRA) 中：PRJNA1529753（访问编号列在关键资源表中）。
- 本文报告的原始代谢组学数据已存储在中国国家生物信息中心（CNCB）的OMIX中：CNCB: OMIX020719, OMIX020795（访问编号列在关键资源表中）。
- 如需重新分析本文所述的数据，可向负责人索取更多信息。

**致谢**
本研究得到了国家重点研发计划（2022YFA1104001）、国家自然科学基金青年项目（82303225和82303801）、国家自然科学基金一般项目（82272745、81972966和82373173）、北京大学第三医院临床重点项目（BYSYZD2023010）、北京大学医学Plus X试点项目-平台建设项目（2024YXXLHPT011）以及宁夏重点研发计划（2026BEG02030）的支持。

**作者贡献**
L.X.、P.B. 和 Z.G. 设计了研究，监督了研究并获得了资金支持。Y.T.、Z.H. 和 Y.J. 主要完成了实验。Y.G.、X.C.、R.J.、Q.Y.、J.S.、H.C. 和 X.Z. 协助了实验和数据收集。X.Z. 和 Y.J. 提供了关键资源。R.C. 和 J.Y. 参与了研究。L.X.、Y.T. 和 Z.H. 撰写了初稿。所有作者都审阅、编辑并批准了手稿。

**利益声明**
作者声明没有竞争利益。

**在本文准备过程中使用生成式AI和AI辅助技术**
在准备本文时，作者使用了ChatGPT（OpenAI）来帮助提高文本的可读性、语法和清晰度。使用该工具/服务后，作者根据需要审查并编辑了内容，并对发表文章的内容负全责。细胞在转染后24-72小时被收集，用于后续的qPCR或Western blot分析。生成稳定的Ido1敲低细胞：通过用scramble或Ido1靶向（sh-Ido1）慢病毒以感染复数（MOI）为10-30的比例转导大约50%融合度的细胞来生成稳定的Ido1敲低MC38细胞系。转导后48-72小时开始嘌呤霉素选择（5 μg/mL；Solarbio，#P8230）。未感染的细胞用嘌呤霉素处理作为选择效率的对照。经过两周的连续选择后获得了多克隆群体。小鼠肿瘤模型及其处理：从北京动物中心购买了6-8周大的雌性NOD-SCID、BALB/c-nu和C57BL/6J小鼠。对于图1A中的实验，雌性NOD-SCID小鼠被皮下注射慢病毒转导的MC38细胞（每只小鼠5×10^5个细胞）。在图1F中，雌性BALB/c-nu小鼠被皮下注射MC38-scramble或MC38-sh-Ido1细胞（每只小鼠5×10^5个细胞）。从第5天开始，小鼠每隔一天接受腹腔注射，注射物为对照组（5% DMSO、40% PEG300、5% Tween 80、50% H2O）或EZH2抑制剂EPZ6438（#S7128，Selleck；100 mg/kg，稀释在2% DMSO、30% PEG300、2% Tween 80、40% H2O中）。实验持续了19天。对于图6和图7中的实验，雌性NOD-SCID/C57BL/6J小鼠被皮下植入MC38细胞（每只小鼠5×10^5个细胞）。小鼠每隔一天接受腹腔注射：对照组（5% DMSO、40% PEG300、5% Tween 80、50% H2O）；EZH2抑制剂EPZ6438（100 mg/kg在2% DMSO、30% PEG300、2% Tween 80、40% H2O中）；IDO1抑制剂NLG919（#S7111，Selleck；每天50 mg/kg在5% DMSO、40% PEG300、5% Tween 80、50% H2O中）；EPZ6438+NLG919（组合）。肿瘤体积用数字卡尺测量，并计算为（长度×宽度^2）×0.5。如果肿瘤显示坏死或达到约1000 mm^3的体积，则根据国家标准（GB/T 35892-2018）对小鼠进行安乐死。体内CRISPR筛选：体内CRISPR筛选按照先前的描述进行。简而言之，将用小鼠CRISPR代谢基因敲除慢病毒文库转导的MC38细胞皮下注射到NOD-SCID小鼠体内（每只小鼠5×10^5个细胞）。小鼠被随机分配在接种后第5、7、9、11、13、15、17和19天接受腹腔注射，注射物为对照组（10% DMSO、45% PEG300、5% Tween 80、40% H2O）或EZH2抑制剂EPZ6438（#S7128，Selleck；100 mg/kg在2% DMSO、30% PEG300、2% Tween 80、40% H2O中）。实验结束时时对小鼠进行安乐死。收集肿瘤并分离基因组DNA。通过PCR扩增sgRNA序列，并使用下一代测序技术（Tsingke Biotechnology，北京，中国）进行定量。非靶向代谢组学分析：用DMSO或25 μM EPZ6438处理48小时的MC38细胞用冷生理盐水清洗，加入胰蛋白酶处理后制成沉淀。在4°C（1500 rpm，30分钟）下用80%水性甲醇和涡旋抽取代谢物，然后离心（12,000 rpm，10分钟，4°C）。上清液通过真空离心浓缩并在5%乙腈中复溶。LC-MS分析使用超高-performance liquid chromatography系统（Agilent 1290II）与高分辨率TripleTOF 5600 Plus质量谱仪（AB Sciex）结合进行。色谱和电离设置采用先前描述的方法。在正负模式下应用电喷雾电离，参数如下：帘幕气体35；离子喷注电压±5500/-4500 V；温度500°C；离子源气体1和2，50；质量范围m/z 60–700。使用碰撞能量30 ± 15 eV进行全扫描MS1和信息依赖性采集（IDA）的MS2光谱以收集数据。原始数据使用MarkerView 1.3处理，经同位素峰过滤后生成特征表。通过将MS/MS光谱与AB Sciex Metabolite Database和HMDB匹配来鉴定代谢物。使用以下同位素标记的标准品（Cambridge Isotope Laboratories）进行定量：L-色氨酸-D5、L-亮氨酸-D10、丙酮酸-d3和L-甲硫氨酸-D3。内源性代谢物峰通过结构匹配的内部标准品进行归一化；没有匹配标准品的代谢物使用变分最小化算法进行定量。统计分析使用MetaboAnalyst网络服务器进行。靶向代谢组学分析：用DMSO或EZH2抑制剂EPZ6438（25 μM）处理48小时的HCT116细胞用冷生理盐水清洗，加入胰蛋白酶处理后制成沉淀。细胞沉淀在-70°C下保存直至提取代谢物。样品在组织研磨机中使用钢珠以55 Hz，每次1分钟在100 μL 80%甲醇中匀浆。加入900 μL 10%甲醇后，重复匀浆两次。上清液通过离心（12,000 rpm，5分钟，4°C）收集，并用10%甲醇稀释5倍。取100 μL样品与100 μL 20 ppb Trp-d5混合，然后对150 μL混合物进行LC-MS分析。色谱分离在ACQUITY UPLC? HSS T3柱（2.1 × 150 mm，1.8 μm）上进行，柱温维持在40°C，注射体积为5 μL。流动相由0.1%甲酸水溶液（A）和甲醇（B）组成，流速为0.25 mL/min，梯度如下：0–0.5分钟，10% B；0.5–2分钟，10–30% B；2–3分钟，60% B；3–6分钟，60–98% B；6–7.5分钟，98% B；7.5–7.51分钟，98-10% B；7.51–9分钟，10% B。质量谱条件与先前描述的非靶向代谢组学方法一致。色氨酸使用稳定的同位素标记内部标准品（Trp-d5）进行定量。校准曲线由在50%甲醇中制备的系列稀释色氨酸标准品制成，并用10%甲醇稀释而成。所有曲线显示出极好的线性（r > 0.99）。样品浓度通过与标准曲线的比较来确定。色氨酸和犬尿氨酸的测量：用DMSO或EZH2抑制剂EPZ6438（25 μM）处理48小时的细胞用冷生理盐水快速清洗，加入预冷却的80%甲醇（-70°C）在避光条件下处理20分钟，然后在-70°C下孵育。细胞在冰上刮下，收集提取物。再加入0.5 mL 80%甲醇清洗后，将混合提取物在4°C下以14,000×g离心5分钟。对于中等样本，取200 μL样品与800 μL甲醇混合，涡旋5分钟，在-70°C下保存20分钟，然后按上述方法离心。所有上清液通过真空离心浓缩，在100 μL去离子水中复溶，然后以18,000 × g（4°C，10分钟）离心后进行LC-MS分析。色谱分离在Amide XBridge柱（3.5 μm，4.6 × 100 mm；Waters）上进行，柱温为40°C，注射体积为20 μL。流动相由5 mM醋酸铵水溶液（A）和甲醇（B）组成，流速为500 μL/min，梯度如下：0–0.5分钟，10% B；0.5–2分钟，10–30% B；2–3分钟，60% B；3–6分钟，60–98% B；6–7.5分钟，98% B；7.5–7.51分钟，98-10% B。质量谱检测在配备电喷雾离子源的QTRAP 5500系统上进行，操作模式为负模式。关键参数包括离子喷注电压-5500 V，源温度475°C，帘幕气体25 psi，离子源气体1和2为33 psi，碰撞能量-10 eV。分析采用多重反应监测模式，使用特定的Q1/Q3跃迁。代谢物通过将MS/MS光谱与AB Sciex Metabolite Database和HMDB中的参考标准品匹配来进行鉴定。峰积分使用Multiquanta 4.0软件（MQ4算法）进行，峰面积在统计分析前归一化至内部标准品。RNA提取和定量实时PCR（qRT-PCR）：使用Trizol试剂（Applygen，#R1030）从培养细胞中提取总RNA，并使用M-MLV逆转录酶系统（Promega，#M1705）逆转录为cDNA。使用2×RealStar Power SYBR Mixture（Genestar，#A311-10）在CFX96 Real-Time System（Bio-Rad Laboratories）上进行定量实时PCR。基因表达水平通过2^(-ΔΔCt)方法归一化至GAPDH。免疫沉淀（IP）和共免疫沉淀（Co-IP）检测：对于共免疫沉淀（Co-IP）检测，细胞用冰冷PBS清洗并用RIPA缓冲液（50 mmol/L Tris-HCl（pH 7.4），150 mmol/L NaCl，1% NP-40，0.5% sodium deoxycholate，1 mmol/L EDTA）裂解。裂解液在4°C下与2 μg指定抗体或对照IgG孵育过夜，然后用protein A/G Sepharose beads捕获3小时。免疫沉淀物清洗后，用SDS loading buffer洗脱，并通过免疫印迹进行分析。为了分析IDO1的甲基化，根据制造商说明使用Neofect转染试剂将细胞转染相关质粒。细胞裂解液用anti-IDO1或anti-His抗体进行免疫沉淀，然后用anti-pan Methyl Lysine进行免疫印迹。对于质谱分析，IDO1免疫沉淀物通过SDS-PAGE分离并用Coomassie blue染色。特定条带被切割并通过LC-MS/MS鉴定。Western blot分析：使用bicinchoninic acid（BCA）测定蛋白质浓度。蛋白质通过SDS-PAGE分离并转移到PVDF膜上。膜在4°C下与指示的一抗孵育过夜。与相应的HRP conjugated二抗孵育后，使用增强化学发光系统可视化信号。使用ImageJ软件（v1.42q，NIH）对峰强度进行量化，并将蛋白质水平归一化至肌动蛋白或GAPDH作为负载对照。谷胱甘肽-S-转移酶（GST） pull-down：使用GST Pull-Down Kit（Abmart，#A10024T）分析蛋白质-蛋白质相互作用。等摩尔量的纯化GST（Sino Biological，#11213-HNAE）、GST标记的EZH2（Sino Biological，#E396）、His标记的IDO1（Sino Biological，#11650-H07E）或His标记的TDO2（Cusabio Technology LLC，#YP023351HU）蛋白质在4°C下孵育过夜。然后将混合物与40 μL谷胱甘肽Sepharose beads在室温下孵育3小时。四次洗涤后，用2×SDS loading buffer洗脱结合的蛋白质，通过15% SDS-PAGE分离，并用anti-GST（Proteintech，10000-0-AP）、anti-IDO1（Proteintech，66008-3-Ig）和anti-TDO2（Proteintech，15880-1-AP）进行免疫印迹。蛋白质相互作用接口的预测：从UniProt数据库中检索EZH2（UniProt: Q15910-1）和IDO1（UniProt: P14902）的氨基酸序列。使用AlphaFold3（https://alphafoldserver.com）预测EZH2–IDO1相互作用复合物，该工具结合序列和结构特征生成具有置信度的复合物结构。使用PyMOL（http://pymol.org）进一步可视化和分析所得模型，以确定假定的相互作用接口和结合方向。IDO1甲基化位点的质谱分析：为了识别IDO1上的甲基化位点，细胞裂解液用anti-IDO1或anti-His抗体在4°C下免疫沉淀过夜，然后用protein A/G Sepharose beads孵育3小时。珠子用缓冲液（150 mM NaCl，10 mM HEPES（pH 7.4），0.1% NP-40）彻底清洗。免疫沉淀的蛋白质洗脱后，通过15% SDS-PAGE分离，并用anti-IDO1抗体进行免疫印迹。对应于IDO1的蛋白条带在Coomassie blue染色后切割并用于质谱分析。IDO1活性测定：在用DMSO或EZH2抑制剂EPZ6438（25 μM）处理48小时的HCT116和MC38细胞中，使用商业Indoleamine 2,3-Dioxygenase 1活性测定试剂盒（Abcam，#ab235936）测量IDO1酶活性。细胞（5×10^6）在500 μL冰冷测定缓冲液中匀浆并在4°C下以10,000×g离心15分钟。上清液与50 μL Reaction Premix和10 μL 1 mM底物在96孔板中混合。在黑暗中37°C孵育45分钟后，加入50 μL Fluorogenic Developer Solution，然后在黑暗中45°C孵育3小时。在冷却至室温后，分别在402/488 nm的激发/发射波长下测量荧光。IDO1特异性活性（μU/mg）计算为B/(ΔT×P)，其中B代表从标准曲线（pmol）确定的N-甲酰犬尿氨酸（NFK）的量，ΔT是反应时间（45分钟），P是总蛋白含量（mg）。细胞增殖测定：使用Incucyte? Proliferation Assay系统进行活细胞成像分析。细胞以每孔2.5×10^4个细胞的密度接种在96孔板中，每3小时监测一次。使用Basic Analyzer处理模块分析相对于0小时的相位融合值。数据代表三次重复孔的平均值±SEM。在图1D中：MC38细胞在播种前24小时被转染scramble、si-Ido1或si-Tdo2。在图5D中：HCT116、SW480和MC38细胞被DMSO、EZH2抑制剂EPZ6438（25 μM）、IDO1抑制剂NLG919（25 μM）或其组合处理。在图5G中：细胞在含有或不含色氨酸的培养基中被DMSO或EZH2抑制剂EPZ6438（25 μM）处理。菌落形成测定：结直肠癌细胞在12孔板（每孔500个细胞）或6孔板（每孔1000个细胞）中接种并培养1-2周。然后用4% paraformaldehyde固定30分钟，用PBS清洗，用0.1% crystal violet染色10分钟。经过清洗和风干后，使用显微镜手动计数了由50个以上细胞组成的菌落。

**凋亡检测**
为了分析凋亡，使用非EDTA胰蛋白酶收集结直肠癌细胞，用冰冻PBS洗涤两次（800×g，5分钟），然后重新悬浮在Binding Buffer中，细胞密度为每500 μL 1–5×10^5个细胞。将单细胞悬浮液在室温下黑暗条件下用5 μL Annexin V-FITC和5 μL propidium iodide (PI)染色5–10分钟。使用流式细胞仪进行分析，通过FL1通道（488 nm/530 nm）检测Annexin V-FITC荧光，通过FL2或FL3通道（488 nm/≥630 nm）检测PI荧光。

**免疫组化及TUNEL检测**
小鼠模型中的肿瘤组织用10%中性缓冲福尔马林固定过夜，进行石蜡包埋，并切成5 μm厚的切片。按照标准协议进行免疫组化处理，染色后的切片使用Vectra Polaris扫描仪（Akoya Biosciences）在20倍放大倍数下扫描。TUNEL染色按照制造商说明书使用商业试剂盒（Proteintech，货号PF00009）进行。脱蜡和复水后，将切片在37°C下黑暗条件下与TUNEL反应混合物孵育2小时，然后用PBS洗涤，加入含5 mg/mL BSA的0.1% Triton X-100进行封闭处理，最后用DAPI复染。切片脱水，用二甲苯清洗，装入抗褪色介质中，并使用共聚焦显微镜成像。

**免疫荧光染色**
石蜡包埋的人类组织切片（5 μm）进行脱蜡、复水，并按照标准程序进行抗原修复。切片用含5 mg/mL BSA的0.1% Triton X-100封闭，然后在4°C下用小鼠多克隆anti-IDO1抗体（Abcam，货号ab156787）和兔单克隆anti-EZH2抗体（Cell Signaling Technology，货号5246）孵育过夜。洗涤后，切片与AF594标记的山羊抗小鼠IgG（Yeasen，货号33212ES60）和AF488标记的山羊抗兔IgG（Yeasen，货号33106ES60）孵育，用DAPI复染，装入抗褪色介质中，并使用共聚焦显微镜成像。

**类器官培养**
新鲜结直肠癌组织在Gentle Cell Dissociation Reagent中以40 rpm转速消化30分钟。细胞离心（290×g，5分钟），重新悬浮在含有1% BSA的DMEM/F12培养基中，通过70 μm滤网过滤，然后与Matrigel?按1:1比例混合。每孔接种50 μL培养液于24孔板中，固化10分钟后覆盖培养基。类器官在37°C下培养，每2–3天更换培养基。

**传代**
第7天时，使用相同的方法解离类器官。对于图S2和S6，解离后的类器官接种在96孔板中，并加入DMSO、25 μM EPZ6438、25 μM NLG919或它们的组合进行处理。通过高内涵成像监测生长情况，并使用CellTiter-Lumi?检测试剂（Beyotime，#C0061S）在微孔板读数仪上进行荧光测量以评估存活率。

**体外甲基化检测**
在进行体外甲基化检测时，将纯化的His标记IDO1或指示的His标记IDO1突变蛋白与重组GST-EZH2或催化功能受损的突变GST-EZH2-Q28A一起在甲基化缓冲液（50 mM Tris-HCl，pH 9.0，0.5 mM DTT，1 mM PMSF）中孵育，溶液中添加1 μCi [3H]-S-腺苷-L-甲硫氨酸 ([3H]-SAM；Revvity Health Sciences Inc.）。反应混合物在30°C下孵育3小时。将样品煮沸后放入SDSloading缓冲液中，通过SDS-PAGE分离，并进行放射自显影以观察甲基化信号。如有需要，进一步使用适当的抗体通过免疫印迹技术分析蛋白质。

**NAD+/NADH检测**
细胞内NAD+/NADH水平使用NAD+/NADH检测试剂盒（WST-8方法，E2033；Applygen）根据制造商说明书进行测定。简要步骤如下：细胞在4°C下以300 g离心5分钟，然后在冰上用200 μL裂解缓冲液裂解30分钟。在4°C下以10,000 g离心10分钟后，收集上清液进行分析。对于组织样本，将20–50 mg组织在0.5 mL裂解缓冲液中匀浆，之后在4°C下以10,000 g离心10分钟，收集上清液用于测定。为了测定NADH，将裂解液样品在60°C下孵育30分钟以分解NAD+。总NAD直接从未处理的裂解液中测定，NAD+通过从总NAD中减去NADH来计算。测定时，将50 μL标准品或样品与50 μL freshly prepared reaction working solution混合后置于透明96孔板中，在室温下孵育10–30分钟。使用微孔板读数仪在450 nm处测量吸光度，并根据提供的NADH标准曲线计算浓度。

**定量与统计分析**
统计分析使用GraphPad PRISM软件版本8.2.1进行。所有数据以平均值±SEM表示。对于多组间的比较，采用单因素或双因素方差分析（ANOVA），随后进行Tukey事后检验。如果数据不符合正态性或方差相等假设，或者在样本量较少的情况下，使用非参数检验：两组使用Mann-Whitney检验，单因素多组使用Kruskal-Wallis检验及其Dunn检验；对于双因素设计，根据需要使用Friedman检验或其他适当的非参数方法。除非另有说明，统计显著性定义为?p < 0.05。样本量（n）表示来自独立实验的个别生物样本的数量。每个实验的所有统计详细信息均在相应的图例中提供。

**补充信息（15）**
- 下载全部内容：PDF（1.30 MB）
- 文档S1：图S1–S5
- 电子表格（1.72 MB）：CRISPR-Cas9筛选后的基因富集或缺失情况（DMSO vs. EZH2抑制剂）
- 电子表格（46.42 KB）：CRISPR-Cas9筛选后的基因KEGG通路富集分析（DMSO vs. EZH2抑制剂）
- 电子表格（76.44 KB）：MC38细胞的非靶向代谢组学分析（DMSO vs. EZH2抑制剂）
- 电子表格（11.99 KB）：非靶向分析中的差异代谢物KEGG分析（DMSO vs. EZH2抑制剂）
- 电子表格（12.43 KB）：非靶向分析中的差异代谢物通路分析（DMSO vs. EZH2抑制剂）
- 电子表格（17.60 KB）：HCT116细胞靶向代谢组学中差异代谢物的通路分析（DMSO vs. EZH2抑制剂）
- 电子表格（11.15 KB）：通过质谱法鉴定和绘制IDO1上的甲基化位点（与图3相关）
- 电子表格（4.00 MB）：DMSO和EZH2抑制剂处理下内源性IDO1的甲基化情况（通过质谱法）
- 电子表格（2.56 MB）：DMSO和EZH2抑制剂处理下外源性IDO1的甲基化情况（通过质谱法）
- 电子表格（1.01 MB）：DMSO和EZH2抑制剂处理下外源性IDO1的甲基化情况（通过质谱法）
- 电子表格（145.79 KB）：通过质谱法鉴定和绘制IDO1上的甲基化位点
- 电子表格（13.89 KB）：HCT116细胞的靶向代谢组学（DMSO, EZH2i, IDO1i, 组合）
- 电子表格（9.80 KB）：CRC患者的类器官培养相关信息

**文档S2：文章及补充信息**