口蹄疫病毒O型田间分离株在ZZR-127与BHK-21细胞系中的序贯适应

《Pathogens》：Sequential Adaptation of Foot-and-Mouth Disease Virus Serotype O Field Isolates in ZZR-127 and BHK-21 Cell Lines

口蹄疫（FMD）是一种感染偶蹄动物的高度接触传染性病毒病。循环田间毒株的持续遗传变异使疫苗匹配复杂化，并凸显了对用于疫苗种子生产的高效病毒分离的需求。来自白沙瓦兽医研究所（VRI）的19份经ELISA确认的口蹄疫病毒（FMDV）O型田间分离株在ZZR-127和BHK-21细胞系中进行序贯培养。每种细胞系经历三次连续传代。培养上清液中的抗原检测（抗原捕获ELISA，阳性阈值OD ≥ 0.1，为经验性设定）和定性细胞病变效应（CPE）被用作病毒回收和增殖的指标；未对感染性病毒进行滴定。仅在BHK-21上清液上进行RT-PCR，确认FMDV基因组物质的存在。使用线性混合效应模型、线性回归和逻辑回归分析传代依赖性变化及适应成功的预测因素。在ZZR-127细胞上，第3代（P3；此处操作性地定义为"适应成功"）可检测到抗原的分离株为12/19（63.2%）。在ZZR-127各传代中观察到ELISA光密度（OD）值的非显著阳性趋势（β = +0.123，p = 0.069）；由于接种体积从0.5 mL（P1）加倍至1.0 mL（P2–P3），该趋势不能归因于适应。在一项探索性逻辑回归中，初始OD与P3阳性呈负相关（β = ?2.3769，p = 0.036），但估计不精确（OR = 0.093，95% CI 0.009–0.956；12份适应 vs. 7份未适应分离株），且对单一分离株的剔除敏感；这仅为假设生成性观察。在BHK-21细胞上，至P3时全部12份分离株（100%）均可检测到抗原，但P1时仅6/12（50%），P2时8/12（66.7%）；因此100%这一数字取决于P3作为终点的任意选择。BHK-21各传代中基于模型的OD下降（β = ?0.171，p = 0.033）反映了将ZZR-127 P3接种物读数作为"第0代"纳入；当仅限于BHK-21读数（P1–P3）时，OD随传代增加（每代β = +0.317），因此无法就减毒或抗原产量得出结论。全部12份分离株的BHK-21上清液对FMDV VP1区域RT-PCR阳性；ZZR-127上清液未检测。对ZZR-127后接BHK-21细胞的序贯使用进行了描述性考察。由于未纳入同步BHK-21-only对照、模拟感染对照、感染性测定（TCID₅₀/蚀斑测定）或测序，无法就相对于直接BHK-21分离的效率、病毒复制或适应、或疫苗种子潜力得出结论，与已发表BHK-21分离率的比较仅为指示性。这些初步数据为假设生成性，需要在受控实验中验证，包括交叉中和（r1值）、抗原稳定性和体内保护研究。

**研究背景与问题**

口蹄疫（Foot-and-Mouth Disease，FMD）是由口蹄疫病毒（Foot-and-Mouth Disease Virus，FMDV）引起的一种偶蹄动物高度接触传染性疾病。在巴基斯坦，O型、A型和Asia-1型为最流行的血清型，其中O型与大多数疫情相关。巴基斯坦-阿富汗边境地区牲畜频繁且不受控制的跨境流动促进了FMDV的持续传播和遗传进化，该地区大反刍动物FMDV总体血清阳性率为35.25%，O型检出率最高（66.1%）。控制地方性流行区的FMD主要依赖疫苗接种，巴基斯坦常用含O、A和Asia-1型的三价灭活疫苗。然而，FMDV RNA依赖性RNA聚合酶缺乏校对能力，导致高突变率驱动持续的抗原进化，给疫苗有效性带来重大挑战。近期对巴基斯坦开伯尔-普赫图赫瓦省流行的FMDV A型毒株的分子特征分析显示，田间分离株与疫苗株A22/Iraq/64在遗传上不同，抗原关系分析显示低r1值（<0.39），表明抗原匹配差且疫苗效力可能降低。从田间样品中分离和增殖FMDV对于疫苗开发、分子分析和抗原匹配至关重要。虽然原代细胞培养对病毒分离高度敏感，但难以维持且很少在常规诊断实验室中使用。因此，连续细胞系通常用于病毒培养。BHK-21细胞系因其稳定性和适合大规模培养而广泛用于疫苗生产，但FMDV田间分离株往往对BHK-21细胞适应性差，阻碍了其直接应用于疫苗种子生产。高敏感连续细胞系可促进病毒在生产细胞系上增殖前的初步回收。例如，胎山羊舌细胞系（ZZR-127）对FMDV感染高度敏感，支持高效病毒复制并表现出快速细胞病变效应。在细胞培养适应过程中，病毒衣壳蛋白（VP1、VP2和VP3）的突变可改变受体使用，使病毒能够结合替代受体如硫酸乙酰肝素，这些受体通常存在于包括BHK-21在内的实验室细胞系上。鉴于O型血清型的流行病学意义，有效分离和培养O型田间分离株对疫苗开发和流行病学监测至关重要。因此，本研究旨在描述FMDV O型田间分离株的回收和传代（以抗原检测为指标），采用敏感ZZR-127细胞系后接BHK-21细胞系的序贯细胞培养策略。但必须强调，本研究未纳入同步BHK-21-only对照组、模拟感染对照、感染性测定（TCID₅₀/PFU）或基因组测序，因此无法就分离效率、病毒适应或疫苗种子潜力得出确定性结论。ZZR-127细胞系对FMDV分离表现出高敏感性，显著高于已建立的BHK-21和IB-RS-2细胞系，接近原代牛甲状腺（BTY）细胞。本研究并非声称引入新方法，而是应用这一已建立的方法来表征巴基斯坦O型田间分离株的适应动态。本研究为初步描述性报告：传代依赖性抗原检测的统计分析以及初始抗原载量作为分离成功可能相关因素的统计分析均为探索性和假设生成性。在本手稿中，"适应"和"适应成功"操作性地表示ZZR-127细胞P3时ELISA可检测抗原，"在BHK-21细胞上的增殖"表示抗原检测；这些术语均不意味着已证明的遗传或表型适应、病毒复制或感染性病毒产量。

**关键技术方法**

本研究使用2021至2022年间从巴基斯坦开伯尔-普赫图赫瓦省各地区临床 affected 牲畜采集的存档上皮组织样本，所有样本来自表现FMD特征性临床症状动物的水疱病变（上皮组织），经抗原捕获夹心ELISA（IZSLER，Brescia，Italy）重新确认O型阳性后纳入。使用胎山羊舌细胞系（ZZR-127，第76–78代，来自德国Friedrich-Loeffler-Institut，经签署材料转让协议获得）和BHK-21细胞系（第45–50代，来自VRI白沙瓦FMD疫苗研究实验室）。19份O型阳性样品经10%（w/v）组织悬液制备、匀浆、离心澄清和0.45 μm过滤后接种ZZR-127单层，连续传代三次，P1接种0.5 mL，P2–P3接种1.0 mL。适应ZZR-127的分离株随后转移至BHK-21细胞进行三代传代。通过抗原捕获夹心ELISA检测培养上清液中的抗原（阳性阈值OD ≥ 0.1），定性观察细胞病变效应（CPE）。仅对BHK-21上清液进行RT-PCR检测FMDV VP1区域，使用靶向VP3和2B区域的引物扩增整个VP1编码区。统计分析使用R version 4.2.3，包括线性混合效应模型（lme4包）、线性回归和逻辑回归，以及Python version 3.11.4进行事后敏感性分析。

**研究结果**

**3.1 FMDV O型在ZZR-127细胞系上的分离与适应**

在ZZR-127细胞系初次传代中，19份接种样品中有6份经ELISA检测阳性，确认初步病毒回收成功。样品V-29表现出最高光密度（OD = 1.2216），其次为V-43（OD = 0.7057）。其余阳性分离株（V-36、V-38、V-42和V-48）OD值较低，范围为0.125至0.2406。需注意ELISA OD值测量总抗原含量而非感染性病毒滴度。在ZZR-127细胞上连续传代后，第二传代中另有6份分离株经ELISA可检测，阳性分离株总数增至12份。大多数分离株P2时OD值高于P1，但由于接种体积在P1和P2之间加倍（0.5 mL至1.0 mL），此增加不能归因于适应或复制增加。第三传代中，另有一份分离株（V-34）转为阳性，而P1和P2阳性的V-36转为不可检测；12份分离株（63.2%）在P3阳性并被归类为"适应"（操作性定义），19份中13份（68.4%）至少一次阳性。ZZR-127细胞各传代阳性率分别为P1 6/19（31.6%）、P2 12/19（63.2%）和P3 12/19（63.2%）。最高OD记录为V-43（2.190），其次为V-29（1.9073）和V-40（1.8954）。大多数分离株P3时OD值高于P2（12份P3阳性分离株中11份；V-38差异可忽略），包括P2至P3步骤中接种体积相同（1.0 mL）的情况。然而，两份分离株表现非典型行为：V-36在P2阳性（OD = 0.4431）但在P3不可检测，V-48 OD从1.5986降至0.576。V-36（初始OD = 1.600）尽管P1（0.1907）和P2（0.4431）阳性，至P3不可检测，提示原始样品可能含有非感染性抗原而非活病毒，或病毒在传代中丢失。该异常值凸显了使用ELISA OD作为感染性病毒滴度替代指标的局限性。V-48等分离株的OD波动可能反映缺陷干扰颗粒、抗原携带差异、测定变异性或交叉污染；这些解释均未经测试。V-36和V-48是对简单单调"适应"解释和初始OD作为预测因素使用的直接反例。

**3.2 ZZR-127适应的FMDV O型在BHK-21细胞系上的增殖**

**3.2.1 第一传代（P1）**：12份ZZR-127适应分离株随后在BHK-21细胞上增殖。第一传代中6份分离株经ELISA检测阳性。V-48显示最高OD（0.7115），其他阳性分离株（V-37、V-40、V-42、V-43和V-45）OD值较低，范围为0.118至0.4087，表明BHK-21 P1时6/12（50%）分离株抗原检测阳性。BHK-21 P1接种物为ZZR-127 P3上清液，大多数分离株抗原含量高，因此P1读数可能包括携带的抗原。

**3.2.2 第二传代（P2）**：连续传代后，另有两份分离株（V-29和V-30）在第二传代经ELISA检测阳性，可检测分离株总数增至8份。最高OD记录为V-45（1.3112），其次为V-42（1.1807）和V-48（0.9346）。结果表明P2时8/12（66.7%）分离株抗原检测阳性；但这不表明对BHK-21细胞的适应。

**3.2.3 第三传代（P3）**：第三传代中，另有4份分离株经ELISA检测阳性，导致BHK-21细胞P3时全部12份分离株（100%）可检测到抗原。前几代阳性率较低（P1 6/12，50%；P2 8/12，66.7%），因此100%这一数字特定于P3这一任意选择的终点：若研究止于P2，相应数字将为66.7%，P3之后的结果未确定。最高OD值为V-45（2.0865），其次为V-39（1.658）和V-30（1.2059）。虽然大多数分离株经ELISA仍可检测，但OD值各传代间有变化，可能反映抗原携带差异、测定变异性或接种物中感染性病毒量的差异；这些可能性无法区分。包括V-31、V-34、V-38和V-39在内的几份分离株仅在BHK-21细胞第三传代显示可检测ELISA OD。在BHK-21增殖的分离株中，V-45各传代OD值最高（P1: 0.118 → P2: 1.3112 → P3: 2.0865），表明该分离株在BHK-21细胞上抗原信号更高。三份分离株（V-29、V-30和V-45）显示OD跨传代持续增加。V-45在BHK-21细胞上OD值最高；在缺乏r1值、免疫原性或攻毒数据的情况下，不对疫苗适用性作推断，该分离株可能值得后续测序和抗原分析。

**3.3 逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）**

全部12份分离株的BHK-21培养上清液经RT-PCR检测VP1区域阳性，确认FMDV基因组物质的存在。未对ZZR-127上清液（初步分离步骤）进行RT-PCR，因此初步回收仅由ELISA和CPE支持。终点RT-PCR检测病毒RNA（包括残留输入RNA），不提供复制效率、适应或抗原性信息；其作用仅限于排除假阳性ELISA结果。

**3.4 ZZR-127细胞系上的适应**

线性混合效应模型显示ELISA OD值呈阳性传代依赖性增加（β = +0.123，p = 0.069），但该效应未达统计学显著性，不解释为适应证据。然而，这些结果须谨慎解释，因为接种体积从P1的0.5 mL增加至P2和P3的1.0 mL。起始抗原质量的增加混淆了ELISA OD值跨传代的纵向比较。线性回归分析确认类似阳性趋势（β = +0.121，p = 0.077，R² = 0.065）。这些模型包含n = 49个观察值（19个基线读数和来自19份分离株的30个P1–P3阳性读数）；估计随机截距方差约为零（奇异拟合；ICC ≈ 0；随机效应似然比检验p = 0.50），因此混合模型实际上等同于普通线性回归，残差未偏离正态性（Shapiro–Wilk p = 0.28）。传代仅解释OD变异的6.5%（R² = 0.065），限制了任何传代依赖性趋势的解释力。在探索性逻辑回归中（12份适应和7份未适应分离株），初始OD与P3阳性呈负相关（似然比p = 0.036，McFadden pseudo-R² = 0.176；β = ?2.3769）。点估计对应初始OD每增加一个单位的比值比为0.093（每0.1 OD单位约0.79），但95%置信区间宽（0.009–0.956，下限接近0，上限接近1），与从非常大到小的比值比降低均兼容。仅7份未适应分离株（每变量事件数 = 7），估计不稳定，不应解读为精确的90.7%成功比值比降低。初始OD与适应结果的散点图显示适应和未适应分离株之间有相当大的重叠。未适应分离株分布在整个OD范围内，包括研究中最高初始OD值（V-46: 2.054）和另一个高OD样品（V-47: 1.663）。这表明初始OD与适应成功之间的关系非单调，显著的逻辑回归结果可能受少数未能适应的高OD样品（V-36、V-46和V-47）影响。逻辑回归结果（β = ?2.3769，OR = 0.093，p = 0.036）表明，在此小数据集中，较高初始OD值与较低P3阳性比值比相关。初始OD ≥ 0.5在12份适应分离株中9份和7份未适应分离株中6份；初始OD最高的三份分离株（V-46、V-47和V-36）均未适应，唯一低初始OD的未适应分离株为V-33（0.138），其影响较大（剔除后β = ?4.98）。该关联不稳健：剔除八份分离株（V-30、V-36、V-38、V-40、V-41、V-43、V-46或V-47）中任一份均使似然比p值升至0.05以上。无法从该数据集建立OD截断值，该发现为需要在更大规模受控数据集中检验的假设。

**3.5 BHK-21细胞系上的增殖**

按原始设定（n = 38：12个基线读数和26个P1–P3阳性读数）的BHK-21数据模型给出负传代效应（线性混合效应模型β = ?0.171，p = 0.033；线性回归β = ?0.170，p = 0.043，R² = 0.109；随机截距方差≈0，ICC≈0，随机效应似然比检验p = 0.50；Shapiro–Wilk p = 0.23）。传代因此仅解释约11%的变异。此外，这些模型中的基线（第0代）值是作为接种物使用的ZZR-127 P3上清液的OD，并非BHK-21培养测量值，且非检测值被排除。负斜率因此主要反映高OD接种物与较低OD BHK-21上清液之间的比较，而非跨BHK-21传代的变化，不解释为减毒或抗原产量降低的证据。当仅限于BHK-21 P1–P3读数（n = 36；非检测值设为0）时，OD跨传代增加（线性混合效应模型每代β = +0.317，95% CI 0.146–0.487；随机截距方差0.031，残差方差0.182，ICC = 0.14；随机效应似然比检验p = 0.23；线性回归R² = 0.25），主要反映阳性分离株数量上升（6/12、8/12、12/12）；残差偏离正态性（Shapiro–Wilk p = 0.010）由于大量零值，因此该估计为描述性。BHK-21细胞上增殖成功的逻辑回归因完美分离而无法估计，因为P3时全部12份分离株（100%）均可检测到抗原。

**3.6 事后敏感性和稳定性分析**

由于无模拟感染对照，ELISA阳性阈值（OD ≥ 0.1）无法验证。应用更严格阈值（OD ≥ 0.2），ZZR-127细胞各传代阳性率为P1 3/19（15.8%）、P2 10/19（52.6%）和P3 11/19（57.9%）（V-34在P3低于阈值），BHK-21细胞为P1 3/12（25.0%）、P2 6/12（50.0%）和P3 11/12（91.7%）（V-38在P3低于阈值）。因此主要比率（63.2%和100%）对阈值敏感。对于ZZR-127细胞P2至P3步骤（接种体积相同），12份P3阳性分离株中11份P3时OD高于P2（Wilcoxon符号秩p = 0.012，P2非检测值设为0）；这不受P1/P2体积变化影响，但仍不能区分复制与抗原积累或携带。逻辑回归不稳定。从数据重新计算的Wald 95% CI为0.007–1.25（Wald p = 0.073），轮廓似然95% CI为0.004–0.87。留一法β估计范围为?4.98至?2.04，剔除八份分离株中任一份给出似然比p值在0.051至0.108之间。将V-36分类为阳性（任一代阳性）给出OR = 0.22（Wald 95% CI 0.02–2.03；似然比p = 0.16），剔除V-36和V-48给出OR = 0.12（Wald 95% CI 0.009–1.72；似然比p = 0.075）。因此初始OD与P3阳性之间的关联应视为方向 and 幅度不确定的假设生成性观察。

**讨论部分总结**

疫苗接种仍是地方性流行区FMD控制的基石。尽管疫苗接种结合扑杀策略已成功在欧洲和南美洲大部分地区消除FMD，但地方性流行国家仍面临多种血清型循环和抗原变异株持续出现的重大挑战。这些动态需要定期监测和高效回收循环田间分离株，以确保疫苗株保持抗原相关性。本研究以抗原检测为读数描述性考察了序贯细胞培养策略；统计建模为探索性，不提供适应动态的定量见解。在ZZR-127细胞系初次传代中，19份田间分离株中12份（63.2%）在P3可检测到抗原（按上述操作性定义的"适应成功"）。线性混合效应模型显示ELISA光密度跨传代呈阳性但非显著趋势（β = +0.123，p = 0.069），受接种体积从P1的0.5 mL增加至P2和P3的1.0 mL以及原始设定中纳入基线组织读数作为第0代的混淆。传代仅解释6.5%的变异（R² = 0.065），因此传代依赖性趋势解释力小，不应过度解读。从12/19份分离株回收抗原阳性培养物与ZZR-127适合田间毒株初步回收相兼容，但在缺乏BHK-21-only对照、模拟感染对照或感染性测定情况下，不能证明优越的回收或适应。近期研究同样报道敏感细胞系显著提高田间FMDV分离株的病毒分离率 compared to 传统细胞系如BHK-21（本研究因缺乏BHK-21-only对照无法进行比较）。分离株间OD变异可能反映相对较小的样本量或田间分离株固有的生物学变异。其他细胞系统也用于FMDV分离，本数据无法将ZZR-127与其他系统排名。原代牛甲状腺细胞被认为是最敏感基质但难以来源和制备；连续系ZZ-R 127（ZZR-127）和LFBK-αvβ6（表达牛αvβ6整合素的猪肾系）据报道高度敏感且与原发性甲状腺细胞敏感性无显著差异，而BHK-21和IB-RS-2细胞通常较不敏感。由于这些系统中无一与ZZR-127在同一样品上平行测试，无法确定回收的12份或未回收的7份分离株在LFBK-αvβ6或原代细胞上行为是否不同。在多种细胞系统上平行分离是合理的下一步。在探索性逻辑回归中，初始OD与P3阳性呈负相关（β = ?2.3769，OR = 0.093，p = 0.036）。该估计非常不精确（报告95% CI 0.009–0.956；重新计算的Wald和轮廓似然区间0.007–1.25和0.004–0.87），仅基于7份未适应分离株（每变量事件数 = 7），且对单一分离株剔除不稳健；应解读为可能效应的范围，而非精确的90.7%比值比降低。反向关联出乎意料，因为较高初始抗原载量可能预期有利于回收。可能解释如高OD样品主要含非感染性抗原、抑制剂或样品质量差为事后推测：未进行样品稀释系列、总蛋白或核酸测量或重复测定。两份表现非典型的分离株V-36（初始OD 1.600；P1和P2阳性但P3不可检测）和V-48（P1 0.2406，P2 1.5986，P3 0.576）表明初始OD和基于P3的成功定义均不能捕捉每份分离株的传代行为；未通过重复检测或有限稀释克隆跟进。目前该观察仅可作为更大数据集的假设提出，不提议初始OD作为样品优先排序工具。病毒分离本质上也是可变的。原则上，单个感染性病毒粒子进入易感细胞即可启动生产性感染，因此分离取决于是否至少一个活粒子到达细胞，而非样品中总抗原或病毒RNA量。样品可给出高ELISA OD但在培养中失败（如果大多数抗原为非感染性颗粒），而抗原少的样品可成功（如果含少数感染性颗粒）；低粒子数时的随机效应、组织储存和冻融历史、匀浆和过滤损失以及组织悬液的抑制性或细胞毒性成分增加进一步变异。这可帮助解释散点图中高初始OD分离株（V-36、V-46和V-47）未回收而一些低初始OD（V-30和V-38）回收的重叠、无可用OD阈值以及V-36在P3的丢失。该解释与数据一致但未经感染性滴度测量证明。未对原始样品或培养物进行实时RT-PCR，因此无法在本数据集中将RNA载量与分离成功关联。在世界口蹄疫参考实验室的比较中，所有病毒分离阳性的样品实时RT-PCR也阳性，与RNA检测比分离更敏感一致，因为其也检测非感染性和降解基因组。合理预期较高RNA载量（较低Ct值）的样品更可能含感染性颗粒从而产生分离株，但关系是概率性的，且由于上述原因，没有单一Ct值能完全区分可分离与不可分离样品。原始组织悬液和传代上清液的Ct值将允许在未来工作中直接检验。BHK-21细胞上全部12份ZZR-127阳性分离株至P3可检测到抗原，但P1和P2仅6/12和8/12，应用更严格阈值（OD ≥ 0.2）时为11/12。因此"100%"数字特定于P3终点（任意）和宽松检测阈值。由于同一样品未直接接种BHK-21细胞，数据不能表明ZZR-127预传代克服田间分离株对BHK-21的差初步适应（FMDV疫苗生产中的已知限制）；仅表明ZZR-127传代后在BHK-21细胞上可检测到抗原。BHK-21传代中基于模型的OD下降（β = ?0.171，p = 0.033）在分析仅限于BHK-21培养读数时不支持：负斜率源于原始模型中第0代值为高抗原ZZR-127 P3接种物的OD以及非检测值被排除。在BHK-21 P1–P3读数中，OD随传代增加（β = +0.317），主要因为更多分离株变为抗原阳性（6/12、8/12、12/12）。因此撤回先前关于减毒、表位丢失或免疫原性降低的解释，无法就BHK-21细胞上抗原产量或抗原稳定性得出结论。任何两种细胞系间抗原检测差异的机制解释纯属推测。田间FMDV分离株通常使用RGD依赖性整合素进入细胞，细胞培养传代已报道选择结合硫酸乙酰肝素的变异株；适应相关替换已定位至衣壳区域如VP1 GH环和五重对称轴。本研究未进行测序、肝素结合测定或抗原分析，因此这些机制均不能与观察结果关联；仅作为未来测序研究的假设注明。本研究中ZZR-127细胞上63.2%的适应成功率与使用该细胞系进行田间FMDV分离株初步回收相兼容，尽管其相对于其他细胞系的效用未经测试。先前研究同样报道ZZR-127适合从临床标本初步分离FMDV。然而，承认无法从数据直接比较BHK-21-only分离率，因为未纳入BHK-21-only对照组。关于该比率的可接受性，先前研究报道田间FMDV分离株在BHK-21细胞上的适应成功率可变，通常范围为20–40%。本研究在ZZR-127上达到的63.2%在数值上高于这些数字，尽管直接比较受限于缺乏BHK-21-only对照组。尽管如此，该比率表明ZZR-127可能是田间FMDV分离株初步回收的实用选择。先前在巴基斯坦-阿富汗边境地区的研究已记录O型为最流行血清型（66.1%），与本研究的O型分离株重点一致。ZZR-127传代后BHK-21细胞P3时100%的比率在数值上高于其他研究报告的直接BHK-21接种成功率，但如上所述，其特定于P3终点和OD ≥ 0.1阈值，且在缺乏直接BHK-21对照情况下不能确认两步策略的价值。此处观察到的关联方向（较高初始OD时P3阳性比值比更低）与先前报道的较高病毒载量样品更可能产生分离株的预期相反。因此不认为初始OD是样品优先排序的基础；通过抗原或病毒载量进行样品分诊在监测项目中是否有用需要在更大规模受控数据集中验证。ZZR-127细胞上表面更早的CPE与该细胞系对FMDV高敏感性的报道一致，但由于CPE未评分、计时或拍照且无模拟感染对照，这仍是主观印象。同样，BHK-21细胞上表面较慢的CPE在缺乏定量或摄影数据情况下无法解释。BHK-21上清液RT-PCR检测全部12份分离株FMDV基因组物质。这排除了该阶段的假阳性ELISA结果，但未对ZZR-127上清液进行RT-PCR，因此初步分离仅由ELISA和CPE支持；此外，终点RT-PCR检测病毒RNA（包括残留输入RNA），不提供复制、感染性、抗原产量或抗原性信息。因此RT-PCR数据不支持关于病毒复制或OD变异原因的陈述。本研究的序贯细胞培养方法可能对地方性流行区FMD控制规划有潜在意义，但以下各点均未由本数据确立，尤其是在多种血清型循环且疫苗匹配仍具挑战性的巴基斯坦。关于观察到的回收率，ZZR-127细胞上63.2%的适应率与先前报道的田间FMDV分离株在BHK-21细胞上的某些比率（通常20–40%）相当或更高。然而，由于本研究未纳入同步BHK-21-only对照组，无法直接比较分离效率。观察到的比率可能反映ZZR-127细胞的敏感性、样品特征或其他因素。20–40%文献范围源自不同样品、年份、操作者和ELISA批次，仅作背景引用；并非有效比较器。因此，优越分离效率的主张不受本数据支持。关于BHK-21细胞上的增殖，全部12份ZZR-127阳性分离株（100%）在BHK-21细胞P3时可检测到抗原（P1 6/12，P2 8/12）。由于无直接BHK-21比较，这不能证明敏感细胞系预传代促进BHK-21细胞上的增殖，也不能确立这些分离株适合疫苗种子候选。本研究未进行标准疫苗匹配评估——包括交叉中和测定以确定针对参考株的r1值、抗原稳定性评估和体内保护研究。因此，这些分离株的疫苗种子潜力仍未证实，需要进一步研究。关于样品优先排序（数据不支持），初始OD与P3阳性之间的关联为反向、不精确且不稳健；这是未来检验的假设，不支持使用初始OD分诊样品。关于监测和疫苗匹配，田间毒株的高效分离是抗原表征和疫苗匹配的前提。然而，本研究未进行抗原表征或疫苗匹配；因此，这些分离株用于疫苗匹配的实际效用仍有待证明。此处描述的方法可能通过改善下游分析所需田间分离株的可及性来支持监测工作，但这需要在未来研究中确认。近期FMD控制全球倡议（包括FAO/WOAH全球FMD控制策略）强调需要区域特异性疫苗开发和高效田间分离株回收。本初步数据本身不推进这些战略优先事项，但可能为未来受控研究提供信息。应承认若干局限性。第一，19份分离株的样本量可能限制对其他地区或血清型的推广性。第二，研究仅关注O型；需要对A型和Asia-1型进一步研究。第三，初始ELISA OD值反映总抗原量而非感染性病毒滴度。高OD样品可能主要含非感染性颗粒，而低OD样品可能含高感染性病毒但总抗原低。此外，本研究使用的商业夹心ELISA试剂盒制造和验证用于检测水疱组织匀浆，而非细胞培养上清液。其应用于细胞培养上清液未经过该基质的正式诊断资格认证。阳性检测阈值（OD ≥ 0.1）为经验性选择，未通过接受者操作特征（ROC）曲线分析或通过计算广泛未感染细胞培养对照组的平均OD加三倍标准差正式验证。此外，未进行标准感染性测定如TCID₅₀或蚀斑测定。无这些数据，研究无法确认活动性病毒复制、区分真正适应与被动抗原持续或定量感染性病毒产量。初始OD与适应成功之间的关系应因此极其谨慎解释。第四，未进行适应病毒的遗传表征以鉴定适应相关突变。未对传代前或传代后分离株进行Sanger或下一代测序。因此，未产生核苷酸序列数据，未将序列数据存入NCBI GenBank等公共数据库。无登录号可用。适应后病毒身份和遗传完整性未在序列水平确认。所有关于受体转换、硫酸乙酰肝素结合和衣壳蛋白（VP1、VP2、VP3）特定氨基酸替换的提议机制仍完全为假设且未经经验证据证实。第五，研究未纳入将19份田间标本在相同条件下直接接种BHK-21细胞的同步对照组。无此直接并排比较，序贯ZZR-127→BHK-21策略提供优于直接BHK-21分离的分离效率的结论无法验证。与文献历史分离率的比较受选择和歷史偏差影响。第六，病毒分离和传代过程中省略了模拟感染对照。无未感染细胞培养对照，ELISA基线背景吸光度无法正式定义，自发宿主细胞脱落无法与病毒诱导CPE区分，非特异性细胞病变效应或交叉污染无法排除。这损害了细胞观察和ELISA吸光度值的基线可靠性。第七，接种体积从初次传代（P1）0.5 mL增加至后续传代（P2和P3）1.0 mL是显著混杂因素。此变化将更高总基线病毒抗原质量引入培养系统。因此， later passages中观察到的ELISA光密度值纵向增加不能可靠归因于增强的病毒适应或更高复制效率，因为值受增加起始体积混杂。未来研究应在所有传代中使用一致接种体积。第八，细胞病变效应（CPE）定性监测，无标准化评分系统、时程测量或与病毒拷贝数或TCID₅₀值的定量关联。此外，未收集比较感染和模拟感染单层的照片记录。无标准化评分、定量验证或图像文档，基于细胞培养动力学的病毒适应主张仍为主观。第九，RT-PCR仅在BHK-21适应培养上清液上进行，ZZR-127适应上清液省略。因此，ZZR-127细胞初步分离期间的病毒存在仅由ELISA和CPE确认，而非分子水平。此不一致分析设计使初步分离在分子水平未经确认。此外，BHK-21适应病毒的RT-PCR确认除ELISA阳性外未提供额外信息，因为其不涉及适应、复制效率或抗原性。其仅作为确认步骤纳入以排除假阳性ELISA结果。第十，选择第3代作为停止点是任意的，尽管与病毒适应的标准实验室实践一致。继续传代至第4代或更远可能产生不同结果，本研究中观察到的100%增殖率依赖于该终点。P1和P2时仅6/12和8/12分离株检测到抗原，因此止于P2将给出66.7%；P4时结果未知。未来研究应确定每份分离株的最佳传代数。第十一，横断面设计不允许评估时间趋势。第十二，关键的是，本研究未进行交叉中和测定以确定针对参考疫苗株的r1值、抗原稳定性评估或目标动物体内保护研究。因此，无法就这些分离株作为疫苗种子候选的适用性得出结论。第十三，原始模型报告的BHK-21传代中OD下降（β = ?0.171，p = 0.033）反映将ZZR-127 P3接种物读数作为第0代纳入和非检测值排除；不应解释为减毒、复制效率降低或表位丢失。当仅限于BHK-21 P1–P3读数时，OD随传代增加。第十四，初始OD的逻辑回归（β = ?2.3769，OR = 0.093，95% CI 0.009–0.956，p = 0.036）基于19份分离株仅7份未适应，给出对单一分离株敏感的不精确估计，为探索性。不应表达为成功比值比的精确百分比降低，初始OD作为样品优先排序工具的使用不受这些数据支持。第十五，细胞系未检测外来病毒（如牛病毒性腹泻病毒、呼肠孤病毒），支原体监测细节有限。对于可能作为疫苗种子材料来源的细胞，这是实质性缺陷：在培养物检测外来因子之前，此处产生的分离株不应被视为适合种子库存。第十六，统计分析有限：传代模型使用基线读数作为第0代并将非检测值视为缺失；随机截距方差估计约为零；传代仅解释线性回归中6.5%和10.9%的变异；限制模型残差因零值非正态；逻辑回归（7份未适应分离株）不稳定。原始模型观察数（49和38）在第2.11节解释。最后，未评估适应病毒在目标动物中的免疫原性。传代过程中缺乏模拟感染对照和缺乏同步BHK-21-only对照组是主要局限性，阻止就分离效率和基线ELISA/CPE观察得出确定性结论。这些缺陷无法仅通过文本编辑解决，需要重复实验并设适当对照。缺乏标准感染性测定（TCID₅₀或蚀斑测定）也是主要局限性，阻止确认活动性病毒复制。接种体积从P1 0.5 mL增加至P2和P3 1.0 mL是显著混杂因素，阻止将ELISA信号增加可靠归因于病毒适应。未来研究必须纳入适当对照、感染性测定、一致接种体积和基因组测序以验证本研究发现。未来研究应关注：（i）适应前后病毒的基因组分析以鉴定适应相关衣壳突变；（ii）抗原表征包括针对当前疫苗株的R值确定；（iii）目标动物免疫原性和保护效力评估；（iv）每种细胞系传代数的优化；（v）资源有限环境中序贯方法的成本效益分析；（vi）ZZR-127→BHK-21序贯适应与BHK-21-only适应的直接比较研究以确定性确立该方法优越性。还应包括在其他敏感系统（如LFBK-αvβ6或原代细胞）上的平行分离以及原始样品和传代物的实时RT-PCR（Ct）。新兴技术如基于CRISPR的遗传表征和反向遗传学系统可能为理解和优化FMDV细胞培养适应提供额外工具。

**结论翻译**

这项初步描述性研究发现，在ZZR-127后接BHK-21细胞序贯传代后，19份O型田间分离株中12份（63.2%）在ZZR-127 P3时经ELISA可检测到抗原，全部12份（100%）在BHK-21细胞P3时可检测到（P1和P2分别为6/12和8/12），且BHK-21上清液FMDV RT-PCR阳性。这些数字特定于任意P3终点和经验性设定的ELISA阈值，在无BHK-21-only对照、模拟感染对照、感染性测定或测序且P1和P2之间接种体积变化的情况下获得；因此不能作为病毒复制、适应或优越分离效率的证据。初始OD与P3阳性呈反向但不精确关联（OR = 0.093，95% CI 0.009–0.956）；该探索性观察需要确认。原始模型报告的BHK-21传代中OD下降反映模型设定，不解释为减毒。该方法对疫苗种子或紧急疫苗生产的适用性在缺乏进一步证据（r1值、抗原稳定性、免疫原性、体内保护、测序和外来因子检测）情况下仍未证实。