通过全基因组CRISPR筛选，发现了能够促使树突状细胞产生耐受性的关键靶点

《Cell Reports》：A genome-wide CRISPR screening identifies targets that drive tolerogenic dendritic cells

**亮点**
• CD86是具有稳健表型和功能的耐受性树突状细胞（tolerogenic dendritic cells, TolDCs）标记物
• CD86表达水平低的树突状细胞（DCs）刺激T细胞反应的能力减弱
• 全基因组CRISPR筛选揭示了调控耐受性DC功能的基因

**摘要**
耐受性树突状细胞（TolDCs）在促进免疫耐受性方面发挥重要作用，并已在自身免疫疾病的早期临床研究中显示出治疗潜力。然而，驱动其分化和形成耐受性表型的关键分子途径仍不明确。本研究探讨了TolDCs在不同耐受诱导因子作用下的功能状态，发现CD86是一种在耐受状态下持续下调的可靠标记物。CD86在调控T细胞增殖和细胞因子分泌中起关键作用，这使其可作为耐受潜能的替代标志物。利用CD86表达作为读数，我们进行了全基因组CRISPR-Cas9敲除筛选，鉴定出与TolDC表型相关的基因。研究结果表明UBE2L6通过调节ISG15-USP18通路参与免疫耐受性和T细胞激活的调控。这些发现为通过靶向干预促进免疫耐受性提供了新的治疗策略。

**引言**
自身免疫疾病的发生源于免疫耐受机制的崩溃，导致机体对自身抗原产生反应，进而生成可能引发组织和器官损伤的效应细胞。对自身抗原的反应通常是由逃避中枢和周围耐受机制的淋巴细胞引起的。因此，理解耐受机制及其在免疫失调中的作用是开发旨在平衡免疫系统的关键。长期以来，自身免疫疾病的标准治疗方法主要是使用广谱免疫抑制剂和免疫调节生物制剂，但这些方法常伴随长期副作用和需要终生服药，且疗效并不稳定。此外，约30%-50的患者对现有疗法无反应。因此，恢复免疫耐受性为治疗自身免疫疾病提供了一种创新方法，不仅能减少对疾病修饰疗法的依赖，还能显著改善临床结局。树突状细胞（DCs）是免疫稳态和激活的重要调节者，既能维持中枢耐受性也能维持周围耐受性，并在先天免疫和适应性免疫之间起桥梁作用。由于耐受性DCs表达共刺激因子（如CD80、CD40和CD86）的能力降低，并能产生抗炎细胞因子（如IL-10），它们能够抑制记忆T细胞和效应T细胞的反应。因此，将DCs重新编程为TolDCs已成为治疗自身免疫疾病的潜在细胞疗法。在临床研究中，可以通过使用皮质类固醇、地塞米松（Dex）和维生素D3（VitD3）等免疫抑制剂，或针对CD40、CD80和CD86共刺激分子的 antisense寡核苷酸，或通过基因修饰来实现TolDCs的诱导。然而，不同的TolDCs具有不同的特征和性质，目前的评估方法（如表型分析和同种异体T细胞增殖测定）耗时且可靠性较低。这些局限性凸显了选择共识性TolDC生物标志物的必要性。尽管共刺激因子表达降低与TolDCs的耐受状态相关，但尚不清楚这些分子仅仅是耐受性的表型标志物，还是直接参与其功能调节的分子。本研究通过多种耐受诱导剂生成了具有功能的TolDCs，发现CD86在耐受状态下始终下调，并进一步研究了其在DC介导的免疫调节中的作用。

**早期临床研究**
早期临床研究表明，体外生成的TolDCs在1型糖尿病和类风湿性关节炎等自身免疫疾病中具有可行性和安全性。这些研究中，从患者体内分离出DC前体，在体外处理后生成TolDCs，再将其回输患者体内。然而，由于耐受机制尚未明确，TolDCs的广泛应用受到限制。当前CRISPR技术为利用全基因组文库进行全面生物学 pathway 分析提供了机会。然而，这些方法需要准确反映生物学过程的稳健生物标志物作为有效的表型读数。早期筛选的技术限制通常将分析范围限制在部分关键基因上，或依赖永生化细胞系。此前基于CRISPR的筛选主要集中在促进常规DCs免疫原性功能的靶点上。我们开发了一种通过评估CD86表达来筛选增强TolDCs耐受功能的靶点的方法。CD86是公认的T细胞激活共刺激信号分子，其表达降低与TolDC表型相关，沉默CD86可在DCs中诱导免疫耐受性。我们的研究发现了一个UBE2L6-ISG15-USP18调控轴，该轴控制CD86表达并调节T细胞激活。转录后修饰途径（如ISGylation）对先天免疫信号和抗原呈递细胞功能具有重要调节作用。总体而言，我们的研究为增强TolDC功能的调控因子提供了全面了解，深化了将TolDCs作为恢复免疫耐受性治疗策略的认识。

**结果**
1. **CD86表达下调**
我们使用三种成熟的耐受诱导剂（VitD3、Dex和雷帕霉素（Rapa）生成了TolDCs，并通过与人单核细胞来源的DCs（moDCs）或小鼠骨髓来源的DCs（BMDCs）的功能实验评估了其抑制T细胞增殖和炎性细胞因子产生的能力。在所有条件下，TolDCs在诱导T细胞增殖方面的能力均低于对照组的免疫原性DCs。Carboxyfluorescein succinimidyl ester（CFSE）稀释实验显示，与VitD3、Dex或Rapa诱导的TolDCs共培养后，CD4+和CD8+ T细胞的增殖频率显著降低（图S1A–S1D），同时Treg细胞数量增加（图S1E）。细胞因子分析表明，TolDCs产生的T细胞因子（包括IL-2、IFN-γ和TNF-α）水平显著较低（图S1F）。这一现象在小鼠BMDCs中同样存在（图S2）。这些数据证实，无论使用何种药物诱导的TolDCs，其在人类和小鼠实验中均表现为T细胞激活和炎性细胞因子产生的减弱。

2. **CD86在多种诱导剂诱导的TolDCs中的共性调控**
尽管VitD3、Dex和Rapa通过不同机制诱导TolDCs，但我们假设这些细胞具有共同的转录和表型特征。为了识别共识性耐受标志物，我们比较了不同诱导剂生成的TolDCs的表型特征。检测了包括CD40、CD86、IDO-1、MHC-II和HLA-DR在内的多个候选标志物。流式细胞术分析显示，与对照组相比，CD86在VitD3、Dex和Rapa诱导的TolDCs中均显著下调（图1）。其他标志物的表达在不同耐受条件下变化较大。总体而言，CD86在不同耐受条件下表现出一致的调控模式。

3. **CD86对TolDC功能的贡献**
我们通过CRISPR knockout敲除人类moDCs中的CD86，并将其与同种异体T细胞共培养，验证了CD86对DC功能的贡献。结果发现，CD86敲除后T细胞的增殖和炎性细胞因子产生显著减少（图2A和S3A）。细胞因子分析显示，CD86缺陷的moDCs产生的IL-10水平升高，而共刺激因子和促炎细胞因子（如TNF-α、IL-6、IL-8和IL-12p70）的表达未改变（图2C和S3B）。进一步分析表明，CD86敲除后TolDCs显著抑制T细胞增殖和多种细胞因子的产生（图2D–2F和S3D）。这些结果表明，CD86在调节DC介导的T细胞激活中起主导作用。

4. **全基因组CRISPR-Cas9筛选**
我们利用CD86作为全基因组筛选的读数，识别出调控TolDCs的基因。我们通过使用低感染复数（MOI = 0.1）并最大化细胞扩增来优化BMDCs中的筛选条件，以保持文库的代表性和完整性（见图S5A和S5B）。在这些条件下，我们使用含有80,600个单导向RNA（sgRNAs）的慢病毒文库进行了全基因组CRISPR-Cas9筛选，这些sgRNAs针对21,300个已注释的蛋白质编码基因，并在容许性（tolerogenic）背景下进行实验。随后，根据CD86表面表达的高低对TolDCs进行分选，并通过深度测序测量每个群体中sgRNAs的富集和耗竭情况（见图4A、4B、S5C和S5D）。我们成功实现了高效的基因敲除，并鉴定了450个TolDC表型的潜在正调节因子和345个负调节因子。在正调节因子中包括先前报道的参与NF-κB、MAPK或JAK-STAT信号通路的基因，如MAP3K14、NFKB1、TRAF6和IFNAR1；而负调节因子包括SOCS6和PPM1D（见图4C–4E）。京都基因与基因组百科全书（KEGG）通路分析进一步确认并揭示了几条已建立的免疫调节通路，如Toll样受体、IL-17、MAPK和NF-κB信号通路，以及代谢通路（见图4F）。基因本体论富集分析显示了多个与免疫相关的通路，包括TNF受体结合、MAPK活性、维生素跨膜转运蛋白激活和整合素结合。此外，我们还识别了泛素结合和泛素样蛋白质连接酶活性等相关通路（见图S5E和S5F）。

图4 全基因组CRISPR-Cas9筛选识别出能够诱导容许性巨噬细胞的靶点
图注：
(A) 小鼠BMDC中全基因组CRISPR-Cas9筛选的示意图。
(B) 在下一代测序之前，对CD86高表达和CD86低表达样本的流式细胞术结果。
(C) 和 (D) 筛选结果的火山图。x轴表示每个基因的所有sgRNAs的对数2倍数变化（LFC），y轴表示?log10（p值）。通过使用稳健的排名聚合（RRA）方法，结合阈值|median LFC| ≥ 0.585，将对差异排序的sgRNAs进行统计分析，以确定具有显著性的基因。CD86的正调节因子用红色表示，负调节因子用蓝色表示。
(E) CD86高表达细胞与CD86低表达细胞中选定靶点的sgRNAs的对数2倍数变化分布。
(F) 按?log2（p值）对DC86正调节因子（红色）和负调节因子（蓝色）富集的KEGG通路进行排序。

CRISPR筛选结果与免疫介导疾病的遗传关联
CRISPR筛选可以识别功能上调控免疫细胞激活或耐受性的基因，而通路富集分析将这些基因分组到生物学通路中，以探究潜在机制并确定关键调节网络。将通过全基因组关联研究（GWASs）与常见免疫介导疾病的筛选结果进一步整合，以阐明因果机制并识别潜在的治疗靶点。在这里，我们利用Open Targets Platform的“位点到基因”（L2G）模型系统地评估了调节CD86表达和TolDC活性的CRISPR筛选结果与人类疾病的遗传关联。通过整合来自129项病例对照GWAS的结果，以及FinnGen和UK Biobank的数据集（涵盖28种协调的自身免疫和炎症表型），我们发现53个筛选基因与疾病风险相关（见图5和S6）。重要的是，这些关联涵盖了多种自身免疫性疾病，表明改变的巨噬细胞共刺激信号通路和耐受性通路可能是许多免疫介导疾病的共同病理机制。我们的发现将TolDC表型的分子调节因子与免疫介导疾病的遗传风险因素联系起来，为未来的功能性和机制性研究提供了线索和有希望的靶点。

图5 CRISPR筛选结果与免疫介导疾病的遗传关联
图注：
(A) Open Targets Genetics提供的基因-疾病对的位点到基因（L2G）得分。CRISPR筛选中鉴定的正调节因子与GWAS中的各种免疫介导疾病相关联，关联程度的信心由L2G得分确定。
(B) CRISPR筛选中鉴定的负调节因子与GWAS中的各种免疫介导疾病相关联，关联程度的信心由L2G得分确定。
在两个图中，L2G得分高于0.5的都被显示出来。

阵列筛选验证的TolDC调节因子
为了进一步验证筛选结果并评估其在人类系统中的转化相关性，我们在人类moDCs中验证了选定的靶点。鉴于增强自身免疫疾病中免疫耐受性的治疗潜力，我们将下游分析重点放在了这些正调节因子上。敲除这些候选基因一致显著降低了CD86表达（见图6A和6B）。大多数靶点还降低了HLA-DR表达，同时对CD80和CD83的影响很小。此外，这些扰动并未影响巨噬细胞分化，这通过DC-SIGN表达进行了测量（见图6C、6D、S7A和S7B）。小鼠BMDC筛选中的其他几个靶点在人类细胞中不显著，也没有调节CD86或其他测试供体中的标记物（见图S7C）。EditCo ICE分析平台（Inference of CRISPR Edits [ICE]）验证了有效敲除，证实了插入或缺失的形成以及较高的敲除得分（见图S7D）。这些结果共同表明，所鉴定的调节因子特异性地控制CD86表达，而不会广泛损害巨噬细胞分化，支持它们在调节与TolDC程序相关通路中的潜在作用。

图6 在人类moDCs中验证筛选结果
图注：
(A) 人类moDCs中CRISPR-Cas9阵列筛选的示意图。
(B) CRISPR敲除基因后moDCs中CD86表达的流式细胞术分析（蓝色为敲除组，红色为非靶对照组）。
(C) CRISPR敲除基因后moDCs中HLA-DR表达的流式细胞术分析。
(D) 在CRISPR RNP介导的敲除后moDCs中DC-SIGN表达的流式细胞术分析。展示了来自一位供体的代表性流式细胞术分析结果。
候选因子的优先级是基于来自3位独立供体的结果确定的。数据以平均值±标准误差（SEM）呈现。统计显著性通过单因素方差分析（one-way ANOVA）后进行Dunnett的多重比较测试确定，以+LPS对照组作为参考。差异在p < 0.05时被认为具有显著性。?p < 0.05；??p < 0.01；???p < 0.001；???p < 0.0001。

UBE2L6是巨噬细胞介导的T细胞激活的关键调节因子
筛选鉴定了大量TolDC调节因子，暗示了控制巨噬细胞介导的耐受性的机制，其中包括几个参与蛋白质降解和泛素通路的基因。其中，UBE2L6（也称为UbcH8）是一种干扰素刺激的双功能连接酶，对于ISGylation和泛素化通路都是必需的。为了研究UBE2L6缺失导致CD86表达降低的机制，我们在基础条件和脂多糖（LPS）刺激条件下对DCs进行了定量质谱分析，包括非靶对照组（NTC）和UBE2L6敲除的moDCs（见图7A和7B）。在对照细胞中，LPS刺激导致与炎症信号和巨噬细胞成熟相关的蛋白质丰度增加，如IL-1B、IL-6、TNF、PTGS2、NFKB1、NFKB2和CXCL10。这些分子是TLR信号通路、MAPK通路、JAK-STAT通路、干扰素信号通路和NF-κB信号通路的关键组成部分。UBE2L6表达在LPS刺激下显著升高，表明其可能参与炎症（见图7B–7D）。全局分析显示，大多数泛素-蛋白酶体通路组件，包括E3连接酶、去泛素酶（DUBs）、泛素适配器和蛋白酶体亚基，在UBE2L6丢失后蛋白水平上基本保持不变。UBE2L6敲除导致ISG15（一种参与ISGylation的泛素样修饰因子）及其去连接酶DUB USP18的特异性上调，DUB USP18是已知的I型干扰素信号的负调节因子。鉴于USP18先前被报道为先天免疫信号的负调节因子，接下来我们检查了与巨噬细胞激活相关的下游信号通路。与NF-κB活性减弱一致，UBE2L6敲除细胞中观察到IκB蛋白水平和NF-kb报告基因活性的适度改变，表明NF-κB信号可能减弱（见图7E和S8A）。此外，UBE2L6缺陷细胞中几种转录调节因子和信号分子也减少，包括细胞因子亚单位IL-12B、转录因子KLF4、TNF受体超家族成员RELT和转录共激活因子CREBBP（见图7E和7F）。功能上，UBE2L6缺陷的巨噬细胞表现出促进T细胞反应的能力降低。UBE2L6敲除的巨噬细胞与T细胞共培养后，T细胞增殖和炎性细胞因子的产生显著减少，包括IFN-γ和TNF-α，与NTC moDCs相比（见图7G和7H），对Tregs的影响很小（见图S8B）。为了评估USP18是否介导UBE2L6缺失对CD86表达的影响，我们发现USP18过表达足以降低CD86表达，重现了UBE2L6敲除的效果（见图7I、S8C和S8D）。相反，在UBE2L6缺陷的THP-1细胞中敲除USP18（UBE2L6/USP18双敲除[DKO]）显著恢复了CD86表达，表明USP18对于UBE2L6导致的CD86表达降低是必需的。与通过质谱测量的moDCs的蛋白质组学分析一致，UBE2L6敲除在THP-1细胞中导致USP18蛋白表达增加（见图7J）。这些增益和丢失功能的研究表明，UBE2L6是调节CD86表达的关键下游介质。总之，这些发现表明UBE2L6的丢失与ISG15和USP18表达的增加有关，同时抑制CD86表达，损害巨噬细胞激活，并减少巨噬细胞介导的T细胞启动和炎性细胞因子的产生。我们的数据支持UBE2L6通过涉及ISG15和USP18的通路调节巨噬细胞免疫原性的模型，尽管ISGylation的确切贡献仍有待明确。这些结果确立UBE2L6作为巨噬细胞免疫原性的调节因子，并表明调节ISG15-USP18信号可能有助于诱导TolDC状态。

图7 UBE2L6缺乏的人类单核细胞来源的树突状细胞的蛋白质组学分析和功能评估
图注：
(A) hmoDCs中液体色谱-串联质谱（LC-MS/MS）定量蛋白组学工作流程的示意图。
(B) 在用或不用LPS处理的UBE2L6敲除和非靶对照组（NTC）hmoDCs中UBE2L6表达的代表性毛细管基自动化Western blot分析；β-actin作为加载对照。
(C) 用LPS处理的moDCs与?LPS载体对照组相比的全局蛋白组学变化的火山图。每个点代表一个蛋白质。x轴显示对数2倍数变化（log2FC），计算为+LPS组和?LPS组之间平均对数2转化蛋白强度的差异，y轴表示log10（p-adj-value）。
(D) 通过MS识别的上调和下调蛋白质的KEGG通路富集分析（见C）。
(E) UBE2L6敲除细胞与NTC细胞之间全局蛋白组学变化的火山图。
(F) 与NTC moDCs相比，UBE2L6敲除细胞中选定蛋白质的倍数变化条形图。
(G) 通过CRISPR在moDCs中敲除UBE2L6。流式细胞术分析UBE2L6表达，归一化到NTC moDCs。
(H) 通过MSD测定与moDCs共培养的T细胞上清液中的分泌IFN-γ和TNF-α蛋白水平，归一化到NTC（%）。CD86表达通过流式细胞术测定。结果代表3位供体的平均值。统计显著性通过配对双尾学生t检验确定；误差条显示平均值±标准误差；?p < 0.05；??p < 0.01；???p < 0.001；???p < 0.0001。
(I) 通过t检验计算三个独立供体的moDCs中带有载体对照或USP18过表达的CD86表达的流式细胞术分析；误差条显示平均值±标准误差；?p < 0.05；???p < 0.0001。
(J) 在带有或没有LPS处理的NTC、UBE2L6敲除（UBE2L6 KO）和UBE2L6/USP18双敲除（DKO）人类THP-1细胞中CD86表达的流式细胞术分析。通过Western blot分析在NTC、UBE2L6 KO和UBE2L6/USP18 DKO THP-1细胞中评估UBE2L6和USP18蛋白表达水平。统计显著性通过双因素方差分析（two-way ANOVA）确定；误差条显示平均值±标准误差；?p < 0.05；???p < 0.0001。

讨论
在这项研究中，我们建立了一种方法，可以通过调节TolDCs的功能来识别促进免疫耐受性的机制和治疗靶点。TolDCs的特点是它们能够调节免疫反应、抑制效应T细胞活性并促进Tregs的生成。这一领域的进展受到表型异质性和缺乏共识TolDC标记物的限制，以及将大规模功能基因组学方法（包括基于CRISPR的筛选）应用于增殖能力有限的初级巨噬细胞的技术难度。为了解决这些限制并研究与TolDCs相关的基因，我们开发了针对TolDC功能的全基因组CRISPR筛选，并在初级TolDCs中功能验证了选定的靶点。这些发现确定了可能有助于促进免疫介导的炎症性疾病中免疫耐受性的途径和分子靶点。CRISPR筛选长期以来一直是评估基因功能和识别调控免疫反应的治疗靶点的强大工具。pooling CRISPR筛选使得在细胞系中进行无偏见的整个基因组功能比较成为可能，这有助于发现各种扰动下的重要途径和生物学机制。到目前为止，很少有研究报道在树突状细胞（DCs）中进行的全基因组功能筛选。之前的CRISPR筛选研究使用TNF-α的产生作为DC炎症或激活的读数。虽然TNF-α是已知的促炎反应标志物，但它并不能完全反映TolDCs的功能状态，也不能预测DCs调节下游T细胞反应的能力。其他研究仅限于与异体T细胞共培养的低通量阵列筛选。因此，具体调控TolDC程序的遗传结构在很大程度上尚未被探索。在这项研究中，我们开发了一种针对TolDC功能的整个基因组CRISPR筛选方法。先前的研究表明，由不同药物或细胞因子诱导的TolDCs表现出异质性的转录程序，但这些多样化的程序最终都汇聚于免疫耐受性。通过比较不同TolDC诱导条件（如VitD3、Rapa和Dex）下的转录组分析，我们发现了转录程序的重叠和差异，并揭示了一组共同的调控节点，这表明尽管上游信号不同，但仍存在共享的调控机制。这给使用单一标志物来定义TolDCs带来了挑战。我们的策略是从识别与TolDC功能相关的固有生物标志物开始的，因为目前没有特定于TolDC谱系的标志物，而TolDC表型的评估主要依赖于转录组特征。关于VitD3处理的DCs的先前研究也表明，某些标志物的表达可能仅有轻微变化。特别是Piemonti等人报告称，在LPS或CD40L刺激后，VitD3处理的DCs未能充分上调CD86及相关成熟标志物，并显示出较低的T细胞刺激能力，这与免疫耐受性功能状态一致，表明更具有信息量的特征是炎症刺激后未能适当上调CD86。为了应对这些挑战，我们使用流式细胞术检测了几种共刺激分子或潜在的共识标志物，包括CD40、CD86、CD80、IDO-1、MHCII或HLA-DR，在人源和小鼠来源的TolDCs中进行了测试。尽管其他DC成熟分子（如CD80和MHC-II）在免疫耐受条件下也会发生改变，但CD86在多种免疫耐受刺激和DC系统中显示出最一致且调节最稳健的标志物（图1）。研究发现CD86是调节Treg稳态和存活以及调控CD4+ T细胞反应的主要共刺激分子，使用该标志物的筛选表明它是临床评估TolDC功能的可靠方法。与这些发现一致，我们发现通过抗体阻断或CRISPR-Cas9编辑使CD86失活可以降低DC介导的T细胞激活。CD86 KO细胞与药物诱导的TolDCs并不完全相同：CD86 KO moDCs保留了CD80和CD40的表达，并产生与对照moDCs相似的TNF-α水平，而药物诱导的TolDCs则表现出更广泛的共刺激分子和炎症细胞因子的抑制。然而，无论是CD86 KO DCs还是药物诱导的TolDCs，在人和小鼠系统中都表现出T细胞增殖减少、炎症细胞因子产生降低以及Treg诱导增加（图2和S1）。尽管CD86被认为是干扰素和toll受体刺激的基因，但我们的结果使我们假设CD86标记了一个更广泛的免疫抑制程序。CD86表达较低可能是免疫耐受性表型的一个潜在功能标志物，仅凭这一点不足以定义免疫耐受性。进一步的功能验证表明，CD86主要反映并控制DC的T细胞刺激能力，支持将其作为DC免疫耐受潜力的可靠替代标志物，证实了它是一个与TolDC功能紧密相关的稳健且多功能的标志物（图2和3）。由于调控TolDCs的基因大多未知，我们在原代DCs中进行了无偏见的整个基因组CRISPR-Cas9筛选，以全面描绘这一程序并识别TolDC表型的调控因子。我们在TolDC模型中进行了整个基因组CRISPR筛选，以识别与耐受性相关的基因。这种方法建立在早期关于传统DCs工作的基础上，并在概念上与之一致。这种方法突出了如NF-κB这样的经典免疫信号通路以及选择性控制CD86表达的其他调控因子，提供了关于TolDC建立和维持的机制见解。将pooling CRISPR筛选应用于原代人源DCs的一个主要技术挑战在于它们的有限增殖能力和对基因操作的抵抗性。我们通过优化病毒传递条件和细胞扩增策略解决了这些技术障碍，使得在原代小鼠BMDCs中进行稳健的文库表示和功能筛选成为可能，并注意到使用生物重复样本会适度降低统计功效。为了评估识别出的靶点与炎症的相关性，我们进行了通路富集分析，发现许多靶点与关键炎症通路相关，例如toll样受体、IL-17、RIG-I、MAPK和NF-κB信号通路，这与CD86在免疫调节和疾病中的重要作用一致（图4）。为了进一步阐明这些靶点的炎症背景和疾病相关性，我们使用GWASs检查了它们与自身免疫疾病的关系。许多候选基因显示出与自身免疫和炎症疾病风险增加的显著关联，表明DC共刺激调节和耐受性通路的中断可能是自身免疫发病机制的一个共同机制（图5和S6）。此外，我们进一步证明，从小鼠筛选中获得的多个优先候选基因在人源moDCs中也表现出保守效应，选择性地降低了CD86表达，而不会广泛损害DC成熟标志物或分化（图6）。这种跨物种验证突显了我们结果的转化意义，并强调了这些调控因子在促进自身免疫和炎症性疾病中免疫耐受性的治疗潜力。我们的验证仅限于一部分优先候选基因，而非全部450个正向调节因子和345个负向调节因子，因此这些发现尚不足以支持跨物种保守性的系统量化。更广泛的验证和全面的小鼠到人类的保守性分析是下一步的重要工作。需要进一步的研究来确定这些验证的候选基因是否也能促进Treg诱导和更广泛的DC耐受性。值得注意的是，我们发现UBE2L6是通过控制ISG15和USP18蛋白水平来调控DC激活的关键调节因子。蛋白质组分析显示，UBE2L6的丢失会特异性增加USP18的活性，USP18是一种DUB蛋白，是toll样受体和细胞因子受体下游先天性免疫信号传导的中心负调节因子（图7A–7F）。UBE2L6和USP18都是干扰素刺激的基因，但它们在ISG化过程中起着相反的作用——ISG化是一种调节多种促炎级联反应的蛋白质翻译后修饰过程。UBE2L6向目标蛋白添加ISG15，而USP18则去除ISG15。先前的研究和我们的数据表明ISG15可能稳定USP18。尽管USP18和ISG15上调的确切机制尚不清楚，需要进一步研究，但我们观察到UBE2L6缺陷细胞中ISG15水平显著升高，我们推测这会导致USP18的稳定。我们的挽救实验表明，USP18的过表达足以降低CD86表达，支持USP18在促进CD86低表达的耐受性表型中的作用。相反，在UBE2L6缺陷细胞中，USP18的KO恢复了CD86的水平，表明USP18是UBE2L6对CD86表达调节作用所必需的（图7I、7J和S8）。未来研究中对ISG化底物的量化对于从机制上连接UBE2L6丢失与ISG化通路的变化非常重要。更广泛的ISG化分析，如anti-ISG15免疫沉淀结合质谱分析，对未来研究至关重要。除了USP18的变化外，我们还观察到IκB水平的改变，这也已知会影响DC的耐受性状态。鉴于USP18在减弱上游激活通路中的核心作用，IκB动态的改变可能反映了信号通量的减少，而不是UBE2L6的直接调控。同时，UBE2L6缺陷的DCs显示出转录调节因子（包括CREBBP和KLF4）的丰度降低，这些因素对于NF-κB依赖的基因表达和功能成熟是必要的。UBE2L6 KO DCs中观察到的T细胞增殖减弱和细胞因子产生减少可能是由于CD86下调、NF-κB信号通路成分（Nfkbib和Relt）以及转录调节因子（Crebbp、Klf4和Il12b）下调所致。这表明UBE2L6通过调节对T细胞增殖和炎症效应功能至关重要的信号和转录网络来维持DC的免疫刺激能力（图7F）。当前模型认为ISG15有助于USP18的稳定性，从而支持I型IFN信号的负反馈调节；然而，最近的研究表明，ISG15依赖的USP18稳定作用是必要的，但不足以完全调节人类细胞中的I型IFN信号。与Vasou等人的工作一致，我们的数据支持一种模型，即USP18由ISG15稳定只是调控机制的一部分，额外的非共价ISG15-USP18相互作用共同促进了IFN信号的完全抑制。总的来说，我们的发现支持UBE2L6通过ISG15-USP18相关途径调节DC激活的模型。UBE2L6的丢失与ISG15和USP18水平的增加以及共刺激分子CD86表达的减少有关，最终损害了DC介导的T细胞激活。通过将TolDC功能与稳健的生物标志物CD86联系起来，我们的方法为理解免疫耐受性的机制提供了见解，这些见解可用于后续的高通量筛选，以发现具有耐受性的疗法。此外，我们的发现为未来开发有效的和安全的将效应分子递送到患者DCs的方法奠定了基础，避免了离体细胞操作，为将免疫耐受性作为自身免疫疾病的治疗方法奠定了基础。我们设想，为了定义UBE2L6下游的因果机制，未来的研究应关注下游信号和转录网络，使用基因拯救和ISG15及USP18的扰动，以及在移植耐受性和自身免疫疾病模型中的体内相关性。我们的基于CRISPR的筛选方法结合了稳健的功能分析，为理解TolDC生物学提供了一个框架，并为基于TolDC的疗法的临床评估和推进提供了强大的工具集。

**研究的局限性**
这项研究的一个局限性是使用CD86作为主要筛选读数。尽管CD86表达降低与增强的耐受性和T细胞激活减少相关，但TolDC功能涵盖更广泛的表型特征，这些特征可能与CD86独立调控。未来结合其他功能读数的研究将进一步定义TolDC生物学的调控图谱。此外，虽然关键发现已在人源供体来源的细胞中得到验证，但最初的CRISPR筛选是在小鼠BMDCs中进行的。进一步的研究将有助于确定这些调控通路在人类免疫耐受性中的保守性和体内相关性。我们还感谢我们的前同事Kevin White和Tim Radstake在领导方面的贡献。我们要感谢FinnGen研究的参与者和调查人员。图表是使用Adobe Illustrator和BioRender生成的。AbbVie资助了这项研究，并参与了数据解释、审稿和论文的发表批准。作者贡献：X.L.、L.C.和K.K.设计并监督了这项研究。X.L.、T.H.、M.S.、R.M.和J.D.S.进行了研究工作。F.R.、C.G.和J.W.分析了数据，X.L.和K.K.撰写了论文。

利益声明：所有作者在研究期间都是AbbVie的员工。本研究的设计、实施和财务支持均由AbbVie提供。

**STAR★ 方法**
**关键资源表**
**试剂或资源**
**来源标识符**
**抗体**
BD Pharmingen? 纯化大鼠抗小鼠CD16/CD32（小鼠BD Fc Block?）：BD Biosciences（目录号：553142；RRID：AB_394657）
FITC抗小鼠F4/80抗体：BioLegend（目录号：123108；RRID：AB_893502）
PE抗小鼠CD11c重组抗体：BioLegend（目录号：117308；RRID：AB_313777）
PerCP/Cyanine5.5抗小鼠CD86抗体：BioLegend（目录号：105028；RRID：AB_207499）
PE/Cyanine7抗小鼠CD40抗体：BioLegend（目录号：124622；RRID：AB_108978）
APC抗小鼠CD274（B7-H1, PD-L1）抗体：BioLegend（目录号：124312；RRID：AB_106127）
APC/Fire? 750抗小鼠I-A/I-E抗体：BioLegend（目录号：107652；RRID：AB_261672）
Brilliant Violet 421?抗小鼠CD80抗体：BioLegend（目录号：104726；RRID：AB_256144）
Brilliant Violet 510?抗小鼠CD80抗体：BioLegend（目录号：104741；RRID：AB_281033）
Brilliant Violet 711?抗小鼠/人类CD11b抗体：BioLegend（目录号：101242；RRID：AB_256331）
PE抗小鼠CD25抗体：BioLegend（目录号：102008；RRID：AB_312857）
Alexa Fluor? 647抗小鼠FOXP3抗体：BioLegend（目录号：126408；RRID：AB_108911）
FITC抗人类CD83抗体：BioLegend（目录号：305306；RRID：AB_314514）
PE抗人类CD80重组抗体：BioLegend（目录号：370612；RRID：AB_289080）
PE/Cyanine5抗人类CD86抗体：BioLegend（目录号：305408；RRID：AB_314528）
PE/Cyanine7抗人类HLA-DR抗体：BioLegend（目录号：307616；RRID：AB_493588）
APC抗人类CD274（B7-H1, PD-L1）抗体：BioLegend（目录号：329708；RRID：AB_940360）
APC/Fire? 750抗人类CD209（DC-SIGN）抗体：BioLegend（目录号：330116；RRID：AB_272147）
Brilliant Violet 510?抗人类CD40抗体：BioLegend（目录号：334330；RRID：AB_256403）
Alexa Fluor? 594抗人类CD4抗体：BioLegend（目录号：300544；RRID：AB_256323）
Brilliant Violet 421?抗人类CD8抗体：BioLegend（目录号：344748；RRID：AB_262958）
PerCP/Cyanine5.5抗人类CD127（IL-7Rα）抗体：BioLegend（目录号：351322；RRID：AB_108971）
PE/Cyanine7抗人类CD25抗体：BioLegend（目录号：302612；RRID：AB_314282）
Alexa Fluor? 647抗人类FOXP3抗体：BioLegend（目录号：320114；RRID：AB_108911）
PE/Cyanine7抗人类IFN-γ抗体：BioLegend（目录号：505826；RRID：AB_229577）
Human TruStain FcX?（Fc受体阻断溶液）：BioLegend（目录号：422302；RRID：AB_281898）样本是在BD FACSCanto II或BD LSRFortessa流式细胞仪（BD Biosciences）上记录的。在对单个细胞进行分选并排除死亡细胞后，按照以下方式对细胞进行分选：活的单个细胞被分为DC-SIGN阴性的细胞，这些细胞进一步被分为FITC阴性的细胞（增殖的T细胞）和APC+/PE-Cy7+细胞（Tregs）。使用FlowJo来分析数据。

**慢病毒包装和慢病毒转导**
CRISPR小鼠基因组86K敲除文库（目录号KOMGW-86K-P，Cellecta，美国）是通过将慢病毒载体质粒和慢病毒包装质粒混合物（慢病毒包装质粒psPAX2和含有VSV-G的pMD2.G质粒，目录号CPCP-K2A，Cellecta）短暂共转染到HEK293T细胞（目录号CRL-3216，ATCC）中产生的（使用FuGENE转染试剂，目录号E2311，Promega，美国）。病毒上清液通过0.45 μm的低蛋白结合滤膜过滤，然后在4°C下以107,000g (RCF)的蔗糖梯度超速离心2小时（使用Sw40 Ti转子的Beckman Coulter Optima XPN-80）。浓缩后的慢病毒重新悬浮在PBS + 1% BSA中，并储存在-80°C下。

THP-1细胞以1百万细胞/毫升的密度接种。USP18慢病毒颗粒（目录号ULP-U0871-Lv201-100，GeneCopoeia，美国）和对照载体（目录号LP146-100，GeneCopoeia）以MOI = 1的比例加入培养基中。细胞与病毒颗粒共同孵育12-24小时后，加入1 μg/mL的嘌呤霉素（目录号A11138-03，Gibco，美国）以选择稳定转导的细胞。持续选择直到非转导细胞被清除。

**全基因组CRISPR筛选和RNA测序**
8.1亿个BMDCs以感染复数（MOI）= 0.1的比例用sgRNA文库转导。转导后48小时，培养物扩增到大约12亿个细胞，转导效率约为10%，得到大约1.2亿个转导细胞，每个引导序列的代表数量约为1500个。在整个实验过程中，细胞在1 μg/ml的嘌呤霉素条件下进行筛选。嘌呤霉素筛选后，细胞用LPS处理24小时，收集4000万个细胞并用胰蛋白酶进行“预分离”，以便为每个重复实验提取基因组DNA。然后处理超过1.2亿个细胞，并按照流式细胞术部分提到的协议以1000万个细胞的浓度用CD86染色。使用FACSAria Fusion细胞分选仪（BD Biosciences）根据整个群体中的CD86荧光分布，富集表达最高和最低20% CD86水平的细胞群体。收集最高20%的细胞作为CD86高表达组，最低20%的细胞作为CD86低表达组。收集200万个分选后的细胞用于基因组DNA提取（使用Quick-DNA FFPE Kit，目录号D3067，Zymo Research，美国）。每个PCR反应中使用ExTaq DNA聚合酶（目录号RR001C，Takara Bio，日本）和引物扩增引导RNA。然后用SPRIselect磁珠（目录号B23319，Beckman Coulter，美国）纯化样本，并在NextSeq 500上进行75-bp单端测序。

**测序分析**
测序数据被解复用，含有引导RNA（sgRNA）序列的读段使用定制的Perl脚本进行量化。由于sgRNA可能在读段中的不同位置出现，因此使用侧翼引物序列来定位它。从每个读段中提取引物之间的区域并与sgRNA文库进行匹配。只有在完全匹配（无错配）的情况下，才将序列计入引导序列级别的读段计数中。如果至少80%的读段映射到引导RNA，则选择样本进行进一步分析。筛选的质量控制指标，包括测序覆盖率和读段映射统计，在补充材料中报告（图S5；表S3和S4）。按照之前工作中介绍的分析框架，使用edgeR包中的修剪均值（TMM）方法对样本间的读段计数进行归一化，以提供可靠的差异sgRNA丰度分析。然后使用limma包在引导序列级别进行差异分析。对于基因级别的分析，使用四个相应引导序列的中位数log倍数变化。通过稳健的秩聚合（RRA）方法将差异排序的sgRNA聚合起来识别统计上显著的基因。通路富集分析使用clusterProfiler包进行。因为筛选的目的是为了识别下游验证的候选调节因子并尽可能捕获生物学信息，所以我们优先考虑结合效应大小和名义p值的方法来选择hit，如果基因满足中位数FC≥1.5和p值<0.05的标准，则认为其显著。

**Open Targets L2G评分**
Open Targets项目对来自GWAS目录、FinnGen研究和UK Biobank的130,000多个已出版的GWAS位点进行了系统的精细映射和基因优先级排序。L2G算法在一组明确映射的GWAS基因上进行了训练，使用梯度提升模型，通过整合统计精细映射和各种表观遗传特征作为预测特征来对每个GWAS位点内的基因进行排名。从Google BigQuery批量下载了2022年10月（22.10）发布的包含这些数据的多个表格。我们通过合并不同表格并协调不同GWAS中的表型描述来整理数据。我们将小鼠基因映射到人类同源基因，然后查询L2G分析输出，以获取我们全基因组筛选CRISPR中识别的顶级基因。当同一疾病或性状的多个研究将基因与给定的GWAS信号关联时，我们保留这些研究中最高的L2G评分。使用ggplot2 R包（v3.3.6）绘制基因和表型之间的最高L2G评分大于0.5的结果。

**Cas9/gRNA RNP复合物的核转移**
从Synthego（美国）购买的sgRNAs和Alt-R S.p. HiFi Cas9核酸酶V3（目录号10007803，IDT，美国）被组装并通过Lonza P3 Primary Cell 96孔核转移试剂盒（目录号V4SP-3096，Lonza，美国）和优化程序CM-137在Amaxa 96孔Shuttle系统中（目录号AAF-1002B，Lonza）电穿孔到人类moDCs中。每个核转移反应包括0.6–0.8× 10^6个细胞与RNP和10 μM Alt-R Cas9电穿孔增强剂（目录号1075916，IDT）混合。对于人类细胞系，使用相应的RPMI培养基在核转移后重新悬浮和培养细胞。对于人类moDCs，在电穿孔后加入含有GM-CSF和IL-4的完整RPMI培养基，将细胞转移到含有预温培养基的96孔组织培养板上。moDCs再培养4-6天后处理LPS以促使其成熟。sgRNAs和引物序列列在表S1中。

**基因组DNA提取、PCR、Sanger测序和ICE分析**
使用QuickExtract DNA提取溶液（目录号SS000035-D2，Biosearch Technologies，美国）提取基因组DNA。PCR扩增使用Platinum PCR SuperMix High Fidelity（目录号12532–016，Thermo Fisher Scientific）、10 μM引物（Azenta，美国）进行，如前所述进行DNA测序，并使用提取的基因组DNA或人类基因组DNA对照（目录号636401，Takara Bio，日本）。使用C1000 Touch Thermal Cycler（目录号1851196，Bio-Rad，美国）进行PCR反应。PCR扩增产物被送到Azenta进行纯化和测序。引物序列列在SI附录表S1中。Indel形成和KO评分通过EditCo Bio提供的ICE分析进行评估。

**细胞因子检测**
收集在96孔板上培养的细胞的上清液，并使用U-PLEX TH1/TH2 Combo（human）试剂盒（IFN-γ、IL-1β、IL-2、IL-4、IL-6、IL-8、IL-10、IL-12p70、IL-13和TNF-α，目录号K15010K-4，Meso Scale Discovery，美国）测量细胞因子浓度。使用Meso Sector S 600MM仪器（目录号IC1AA-0，Meso Scale Discovery）进行MSD实验，并使用XLfit软件（IDBS，英国）分析结果。

**蛋白质提取、BCA测定和Western印迹（自动和传统方法）**
使用RIPA裂解和提取缓冲液（目录号89900，Thermo Scientific）从细胞沉淀物中提取蛋白质，并添加磷酸酶抑制剂混合物（目录号5870S，Cell Signaling Technology，CST，美国）和蛋白酶抑制剂混合物（目录号5871S，CST）。使用Pierce Rapid Gold BCA蛋白测定试剂盒（目录号A53225，Thermo Scientific）测量裂解物中的蛋白质浓度，并通过与该试剂盒中包含的BSA蛋白测定标准品进行校正。将4份裂解物与1份12–230 kDa分离模块的5X荧光Master Mix（目录号SM-W004，Bio-techne，美国）混合，在95°C下变性5分钟。根据制造商的说明，将制备好的样品、稀释的抗UBE2L6一级抗体（目录号ab109086，Abcam，美国）、抗-β-Actin一级抗体（目录号NB600-532，Novus Biologicals，美国）、抗兔二级抗体（包含在Anti-Rabbit Detection Module中，目录号DM-001，Bio-techne）和其他必要的Western印迹试剂放入特殊的Jess板上。在Jess机器（Bio-techne）上进行自动Western印迹，并使用Compass for Simple Western软件分析结果。20 μg蛋白质与NuPAGE LDS样品缓冲液（目录号NP0007，Invitrogen）和NuPAGE样品还原剂（目录号NP0009，Invitrogen）混合，在95°C下加热10分钟。样品使用NuPAGE Bis-Tris Mini蛋白凝胶（目录号NP0322BOX，Invitrogen）和NuPAGE MES SDS运行缓冲液（目录号NP0002，Invitrogen）分离，并使用iBlot 2 Transfer Stacks（nitrocellulose，mini，目录号IB23002，Invitrogen）将蛋白质转移到膜上。膜在含有5%牛血清白蛋白（目录号A7906，Sigma-Aldrich，美国）的 Blocking Buffer中在室温下封闭1小时。然后在4°C下用稀释1:1000的一级抗体在Blocking Buffer中孵育过夜。第二天，膜用TBST洗涤三次，并在室温下用适当的辣根过氧化物酶标记的二级抗体孵育1小时。之后用TBST洗涤三次，使用SuperSignal West Pico PLUS Chemiluminescent底物（目录号34577，Thermo Scientific）检测蛋白质，并使用数字化学发光检测系统成像。

**LC-MS/MS分析和数据解释**
如前所述，肽样本在TimsTOF HT质谱仪（Bruker Daltonics，德国）上进行分析，该质谱仪与EvoSep液相色谱系统（Evosep，丹麦）连接，配有固定喷雾源。对于每个样本，按照制造商的协议将300 ng的肽加载到Evotips Pure（Evosep）上。数据采集使用标准的Evosep 60 samples-per-day（60 SPD）方法，使用Aurora Elite柱（15 cm × 75 μm，1.7 μm；IonOpticks）递送逐渐增加的有机梯度来洗脱肽。毛细管电压设置为1600 V，柱温使用Column toaster（Bruker Daltonics）保持在40°C。移动相A为0.1%甲酸水溶液；移动相B为0.1%甲酸甲醇溶液。质谱数据使用内部优化的短梯度DIA-PASEF（Data-Independent Acquisition Parallel Accumulation–Serial Fragmentation）方法获取。DIA-PASEF扫描覆盖的质量范围为400–1000 m/z，TIMS迁移率范围为0.64–1.35V·cm?2；坡度和积累时间均设置为70 ms。每个扫描周期包括24个DIA-PASEF扫描窗口，循环时间为0.95 s。数据分析使用Spectronaut 19（Biognosys，瑞士）中的“.d”文件和DirectDIA模式进行。光谱搜索针对人类UniProt标准蛋白质数据库（检索日期2025年1月7日）进行：使用trypsin/P作为消化酶，允许最多两次缺失切割；半胱氨酸的羧甲基化作为固定修饰；蛋白质N末端的乙酰化和甲硫氨酸氧化作为可变修饰。肽-谱匹配（PSM）和蛋白质组假发现率（FDRs）限制在1%。下游数据在Perseus（v2.1.3.0）中处理，保留实验中至少有50%有效值的特征。量化和使用MinProb进行数据归一化和缺失值插补。使用R脚本进行火山图和其他可视化。

**补充信息（2）**
下载所有内容：
PDF（2.16 MB）文件S1。图表S1–S8和表格S1–S4
PDF（19.48 MB）文件S2。文章及补充信息