ZGRF1的DUF2439/RADIF结构域是一种能与RAD51相互作用并促进其功能的蛋白质

《Cell Reports》：The DUF2439/RADIF domain of ZGRF1 is a RAD51 interactor and facilitator

亮点
• ZGRF1的RADIF结构域（先前称为DUF2439）与RAD51相互作用
• RADIF结构域对于ZGRF1招募到DNA损伤诱导的焦点是必需的
• RADIF结构域对于恢复ZGRF1缺失细胞的丝裂霉素C敏感性是必需的
• ZGRF1和RAD54B在同源定向修复中具有协同作用

摘要
DNA双链断裂（DSB）是极具毒性的DNA损伤，如果不修复，可能会导致遗传信息丢失和细胞死亡。在细胞周期的S期和G2期，DSB可以通过同源重组（HR）进行修复。人类含锌指结构的GRF型蛋白1（ZGRF1）和RAD54B转座酶都能促进HR。在这里，我们报告ZGRF1和RAD54B共有的DUF2439结构域在体外与RAD51相互作用，并且能够抵抗DNA链间交联剂丝裂霉素C（MMC）的作用。此外，DUF2439结构域对于招募ZGRF1到MMC诱导的焦点也是必需的。最后，我们发现ZGRF1和RAD54B在促进特定DSB的同源定向修复中具有协同作用，这与双突变细胞在 MMC或PARP抑制剂talazoparib处理后的存活率降低相一致。基于这些结果，我们提出DUF2439结构域能够招募ZGRF1和RAD54B到DNA损伤部位，在那里它们辅助RAD51的功能以促进HR。

图形摘要

引言
细胞的基因组完整性不断受到DNA损伤的挑战。其中最危险的损伤之一是DNA双链断裂（DSB），如果未得到修复或修复错误，可能会导致遗传信息丢失或染色体重组。DNA修复缺陷在癌细胞中经常被观察到，是癌变的一个已知驱动因素。DSB可能来源于内源性因素（如氧化应激和DNA复制错误）或外源性因素（如化疗中使用的DNA损伤剂）。DSB可以通过模板导向的途径（包括同源重组HR）、单链退火和断裂诱导的复制）或基于连接机制的途径（如非同源末端连接（NHEJ）或微同源末端连接（MMEJ）进行修复。末端连接在整个细胞周期中都很活跃，负责修复大多数DSB。然而，它容易在修复接合处引起小的插入或缺失，因此被认为是一个“易出错”的修复途径。HR通常被认为是一个“无错误”的途径，因为它使用姐妹染色单体作为修复模板，从而在修复过程中不丢失或增加遗传信息。由于需要姐妹染色单体，HR受到严格调控，仅限于细胞周期的S期和G2期。

HR需要多种蛋白质的协调作用，包括RAD52表观遗传群中的蛋白质，其中最著名的是RAD51和RAD54。RAD51对于HR至关重要，因为它介导同源模板的搜索和链交换。RAD51在末端切除之后发挥作用，在该过程中会产生3′单链DNA（ssDNA）突出端，RAD51会在这些突出端组装成核蛋白纤维。在同源搜索和随后的链侵入过程中，RAD51得到了ATP酶和转座酶RAD54的帮助。

除了RAD54之外，其他蛋白质也被证明能够促进链侵入，包括含锌指结构的GRF型蛋白1（ZGRF1）和RAD54B。ZGRF1是一种5′-3′ DNA解旋酶，在体外与RAD51相互作用并促进链侵入。ZGRF1缺失的细胞对丝裂霉素C（MMC）和喜树碱的敏感性增加，这两种物质都会诱导复制阻断损伤，且通过DR-GFP检测显示其HR效率降低。荧光活细胞显微镜和免疫染色显示，ZGRF1在DNA损伤或复制压力下会在细胞核中形成焦点，并且这些焦点与已知的DNA修复因子（如FANCD2和BRCA1）共定位。在生物体水平上，Zgrf1敲除（KO）小鼠的生育能力降低，减数分裂交叉重组发生缺陷，而小鼠胚胎成纤维细胞对MMC的敏感性增加。

RAD54B是RAD54的类似物，它们共享依赖于dsDNA的ATP酶和转座酶活性。与RAD54和ZGRF1一样，RAD54B在体外也与RAD51相互作用并刺激RAD51介导的链侵入。与RAD51的相互作用位于RAD54B的N端区域（残基26–225），该区域与RAD54具有低序列相似性。RAD54B缺失的细胞对奥沙利铂引起的DNA交联敏感性增加，靶向整合频率降低。RAD54B与多个HR因子共定位，包括RAD51、RAD54和BRCA1。RAD54B和RAD54在某些功能上存在重叠，如双缺失细胞的叠加或协同效应；然而，一些作用似乎不是冗余的。

在这里，我们报告ZGRF1和RAD54B在其N端区域共享一个高度保守的、先前未表征的、功能未知的结构域（DUF；DUF2439），该结构域在其他人类蛋白质（包括RAD54）中不存在，并且该结构域直接与RAD51相互作用。我们发现表达缺少DUF2439结构域的ZGRF1截短版本的细胞显示出与完整ZGRF1 KO相似的MMC敏感性。最后，我们发现ZGRF1和RAD54B的联合缺失导致DNA损伤抵抗和HR效率的协同缺陷，表明这些蛋白质在修复复制阻断损伤和HR过程中具有重叠功能。根据我们的发现，我们建议将DUF2439结构域命名为RAD51相互作用和促进因子（RADIF）。

结果
ZGRF1和RAD54B共享一个结构相同的保守DUF2439域
ZGRF1和RAD54B具有不同的酶活性；ZGRF1是一种5′-3′ DNA解旋酶，而RAD54B是一种DNA转座酶；然而，这两种蛋白质在其N端区域都含有DUF2439结构域（图1A）。我们对这两种蛋白质的DUF2439结构域进行了序列比对，以识别保守的残基（图1B）。尽管整体序列一致性有限，但包含ZGRF1的残基16–21和RAD54B的残基136–141的短区域在保守的残基簇（KKxKxW）内显示出高度一致性。这些残基在RAD54B和ZGRF1中跨物种保守（图S1A）。

图1 ZGRF1和RAD54B在其N端区域共享一个折叠的、保守的DUF2439结构域
（A）人类ZGRF1和RAD54B的结构域组织。ZGRF1包含三个结构域：一个功能未知的N端结构域（DUF2439）、一个具有潜在DNA结合能力的GRF型锌指（ZnF）和一个解旋酶结构域。RAD54B包含一个N端DUF2439结构域以及七个SNF2超家族转座酶的共有基序（显示为SWI2/SNF2）。比例未知。RADIF是RAD51的相互作用和促进因子结构域。
（B）DUF2439/RADIF结构域与ZGRF1和RAD54B下游非结构化区域的比对揭示了一个保守的残基簇（KKxKxW，红色框）。两个蛋白质的其余部分在保守性上有限（相同残基用蓝色突出显示）。DUF2439结构域的残基用灰色阴影标注。
（C）ZGRF1-DUF2439的Cα原子的二次化学位移（SCS）（顶部）、化学位移指数（CSI）以及15N横向松弛（R2）和纵向松弛（R1）速率的比率（底部）沿序列的变化。浅蓝色阴影区域突出显示无序C端尾部的残基。
（D）DUF2439结构域形成一个反平行蜿蜒的β-三明治结构。两个实验推导的结构模型（NMR，右侧显示）与AlphaFold 2预测的模型（左侧）相似。AlphaFold 2模型中预测形成β-链的残基用红色、橙色、黄色、绿色、蓝色和紫色标记，而环状结构用青绿色标记。保守的残基（KKxKxW）用深紫色标记。
（E–G）ZGRF1（E，绿色）和RAD54B（F，蓝色）的DUF2439结构域的AlphaFold 2模型显示了高度的拓扑相似性，这在（G）中通过KKxKxW区域的叠加得到了体现，分别用橙色和红色标记。

为了表征DUF2439结构域，我们使用异核NMR光谱对其进行了结构分析。15N,1H-HSQC NMR光谱显示峰值的广泛分散（图S2），表明其具有折叠结构；分配的Cα、Cβ、C、Hα、N和NH核的二次化学位移（SCS）和化学位移指数（CSI）表明存在多个不同长度的β-链（图1C，顶部）。由于交换 broaden（图1C，底部），我们无法记录到足够质量的NOESY光谱来确定完整的三维结构，并且注意到含有KKxKxW区域的残基无法被分配。因此，我们使用AlphaFold 2预测了结构模型，并使用CS-Rosetta中的可用化学位移验证了这些模型。AlphaFold 2模型显示ZGRF1-DUF2439形成了一个反平行蜿蜒的β-三明治结构，由两个β-片层中的四条链组成。其中两条链特别长，贯穿于两个片层（图1D）。该结构域在Lys74处结束，尽管序列在此之后仍然保守，但NMR数据显示C端尾部无序（图1C）。与实验确定的CS-Rosetta模型和CSI的比较验证了AlphaFold 2模型的正确性（图1C和1D）。为了研究DUF2439结构域在RAD54B中是否在结构上保守，尽管序列同源性较低（图1B），我们比较了ZGRF1和RAD54B的DUF2439结构域的AlphaFold 2预测（图1E和1F）。我们观察到两个结构域具有非常相似的架构，叠加进一步突显了该结构域的高度结构保守性（图1G）。此外，保守的残基簇KKxKxW（图1B）位于两种结构中β-链1和2之间的较长环状结构中。这些结果表明DUF2439结构域在结构上高度保守，呈现出高度保守的序列基序，位于可访问的环状结构中，这使我们推测它在两种蛋白质中起着重要作用。

DUF2439结构域与RAD51相互作用
已经证明ZGRF1和RAD54B都与RAD51重组酶相互作用；然而，ZGRF1中与RAD51相互作用的区域尚未确定。相比之下，RAD54B中与RAD51相互作用的位点已被定位在其包含DUF2439结构的N端区域。因此，我们假设DUF2439结构域负责与RAD51的相互作用。为了验证这一假设，我们进行了酵母2-杂交分析。首先，我们基于ZGRF1的结构域构建了四种不同的构建体：（1）DUF2439结构域（氨基酸残基aar 1–90；DUF90），（2）DUF2439结构域和锌指结构域之间的较大非结构化区域（aar 90–1341），（3）锌指结构域（aar 1341–1394），以及（4）解旋酶结构域（aar 1394–2104）（图S3A）。我们观察到ZGRF1-DUF2439结构域与RAD51之间的特异性相互作用（图S3B，红色方块）。此外，我们还使用酵母2-杂交方法研究了RAD54B的DUF2439结构域与RAD51之间的相互作用，并观察到了相互作用（图S3C）。为了进一步定义DUF2439结构域与RAD51的相互作用界面，我们使用ColabFold进行了建模（图2A；图S1B）。该模型预测了ZGRF1的N端与RAD51二聚体之间的两个相互作用界面：一个涉及DUF2439结构域的界面（pIDDT得分较高）和一个位于无序区域内的界面（aar 108–125；pIDDT得分较低）（图S1C）。值得注意的是，DUF2439-RAD51界面是由DUF2439结构域内的保守基序介导的（图1B；图S1A）。为了评估这两个预测的相互作用界面的贡献，我们生成了包含aar 1–140（DUF140）、删除aar 108–125（DUF140Δ108-125）或用丙氨酸（DUF90-K19A）或谷氨酸（DUF90-K19E）替换Lys19的酵母2-杂交构建体（图2B）。删除aar 108–125减少了DUF2439-RAD51的相互作用，而将Lys19突变为丙氨酸或谷氨酸则完全消除了相互作用。这些结果通过定量β-半乳糖苷酶检测得到了验证（图2C和2D）。重要的是，DUF90-K19E结构域的表达水平与野生型（WT）DUF90相似，表明相互作用的丧失不是由于蛋白质表达减少（图S3D）。接下来，我们使用DNA pull-down实验在体外研究了这种相互作用。首先将纯化的Human RAD51组装在生物素化的ssDNA上，然后添加纯化的His6-SUMO融合蛋白的ZGRF1 N端140个残基（图S3E）。随后使用链霉亲和素珠子回收蛋白质-DNA复合物以结合ssDNA及任何相关蛋白质（图2E，额外复制体和对照见图S4A和S4B）。检测到His6-SUMO-DUF140与RAD51之间的弱相互作用，并且通过删除aar 108–125减弱了这种相互作用（图2E，比较第5条和第6条泳道）。最后，我们使用质量光度法研究了在没有DNA的情况下单体RAD51与His6-SUMO-DUF140之间的相互作用（图2F）。我们观察到在混合RAD51和His6-SUMO-DUF140时，比率对比度发生了变化，这表明形成了比单独单体更大的复合物。具体来说，对比度的平均峰值从孤立蛋白的-0.00340和-0.00382变为混合样本的-0.00446。当RAD51与His6-SUMO-His6对照蛋白混合时并未观察到这种变化（图S3F），进一步支持了RAD51与ZGRF1的N末端区域之间存在相互作用。总的来说，我们的发现表明RAD51直接与ZGRF1的N末端140个残基相互作用。涉及DUF2439结构域的接触，特别是Lys19周围的区域，对这种相互作用至关重要，而残基108–125虽然增强了相互作用，但并非绝对必要。

图2 DUF2439结构域与RAD51的相互作用显示ZGRF1的N末端区域有两个相互作用界面：1）具有DUF2439/RADIF结构域中保守序列基序的环（Lys19，绿色）；2）DUF2439结构域下游的无序区域（aar 108–125，绿色）。使用两个RAD51分子来模拟其纤维形式的结构（分别用橙色和红色表示），ZGRF1的aar 1–140部分用蓝色显示。

(A) AlphaFold 2模型显示DUF2439-RAD51相互作用在ZGRF1的N末端区域有两个界面：1）具有DUF2439/RADIF结构域中保守序列基序的环（Lys19，绿色）；2）DUF2439结构域下游的无序区域（aar 108–125，绿色）。

(B) 用于酵母2-杂交分析的ZGRF1 N末端构建的示意图。

(C) 使用含有两个DUF2439/RADIF构建的细胞：DFU90仅包含DUF2439/RADIF结构域和短尾（ZGRF11-90），而DFU140（ZGRF11-140）包含预计与RAD51相互作用的下游区域。

(D) 转染了不同构建的酵母与含有GAD和DUF2439构建的酵母进行杂交，以产生同时含有这两种构建的二倍体细胞。使用的载体包括pGAD-C2、pABO-09、pABO-23、pML213、pML223、pABO-27、pABO-6、pGBD-C2、pABO-08、pPB-08、pABO-24、pML212、pML222、pABO-28和pABO-07。

(C) 含有一个GBD构建的酵母与含有一个GAD构建的酵母杂交，以产生同时含有这两种构建的二倍体细胞。使用的载体包括pGAD-C2、pABO-09、pABO-23、pML213、pML223、pABO-27、pABO-28、pABO-06、pGBD-C2、pABO-08、pPB-08、pABO-24、pML212、pML222、pABO-28和pABO-07。细胞被稀释后接种在缺乏组氨酸（SC-Trp-Leu-His+3AT）或腺嘌呤（SC-Trp-Leu-Ade）的培养基中，以评估HIS3和ADE2报告基因的激活情况，这表明发生了2-杂交相互作用。

(D) 酵母2-杂交相互作用的定量分析。基于β-半乳糖苷酶活性计算Miller单位，并以平均值±标准差（n = 3）表示。

(E) 使用纤维测定法在体外分析DUF-RAD51相互作用。使用链霉亲和素珠子沉淀生物素标记的单链DNA（poly[dT]）和与其结合的蛋白质。洗脱后，标记有星号的His6-SUMO-DUF140条带显示了相对于RAD51信号强度的感兴趣条带的信号强度。

(F) 纯化的His6-SUMO-DUF140（上方）、RAD51（中间）以及两者结合在一起时的质谱光度分析（下方，n = 3）。每个复制品都拟合了一个高斯分布（以实线表示），三个复制品的平均峰值用垂直虚线标出，并在图例中标注了数值。两种蛋白质结合时的峰值对比度发生了变化，表明存在较大的复合物，表明发生了相互作用。由于测定的蛋白质体积较小（最大37 kDa），因此将对比度转换为分子量可能会高估其大小。

我们假设DUF2439-RAD51相互作用对于招募ZGRF1到DNA损伤位点以及其在DNA修复中的作用是必需的。为了研究DUF2439的细胞重要性，我们使用含有FRT/Flp-in系统的ZGRF1 KO细胞系生成了表达全长ZGRF1（与串联的2xYFP标签融合）或DUF2439缺失突变ZGRF1Δ4-73（与相同标签融合）的稳定细胞系（图3A）。活细胞荧光显微镜检查确认这两种蛋白质的表达水平相似，并且都定位于细胞核中（图3B和3C）。由于已证明ZGRF1对DNA链间交联的修复很重要，我们检查了ZGRF1Δ4-73的表达是否能恢复ZGRF1缺陷细胞对MMC的抵抗力（图3D）。全长ZGRF1-2xYFP的表达使MMC抵抗力恢复到亲本水平，而ZGRF1Δ4-73-2xYFP的表达未能挽救生存能力。这些发现表明DUF2439结构域对于ZGRF1介导的链间交联修复是必需的。

图3 表达ZGRF1Δ4–71未能恢复ZGRF1 KO细胞的MMC敏感性

(A) 使用FRT/Flp-in系统在ZGRF1缺陷背景（ZGRF1?/?/?品系36）中构建了表达ZGRF1-2xYFP（上方）或ZGRF1Δ4-73-2xYFP（下方）的U2OS细胞。ZGRF1表达盒由天然ZGRF1启动子驱动。

(B) 通过活细胞显微镜验证了FRT位点处ZGRF1转基因的表达。表示表达ZGRF1-2xYFP或ZGRF1Δ4-73-2xYFP的细胞代表性图像。细胞使用2 mM胸苷同步到S期后，1小时释放到Leibovitz’s L-15培养基中再成像。刻度尺：8 μm。

(C) 核YFP强度的平均值量化。每个点代表一个细胞（分别用蓝色和红色表示单独的复制品）。平均值用黑线表示，单个复制品的平均值用带黑圈的大点表示。通过配对t检验计算每个复制品的平均值的统计显著性（ns表示p ≥ 0.05，n = 2）。

(D) U2OS Flp-in亲本细胞、ZGRF1敲除细胞以及表达ZGRF1-2xYFP或ZGRF1Δ4-73-2xYFP的Flp-in细胞系的克隆形成能力。细胞用指定剂量的MMC处理24小时后，在新鲜培养基中生长直至形成菌落。与亲本细胞系的比较使用不假设标准差的双t检验计算统计显著性（?p < 0.05，??p < 0.01，n = 3）。

我们之前已经证明ZGRF1在DNA损伤后会形成核焦点。为了确定这种焦点形成是否依赖于DUF2439结构域，我们在MMC处理后进行了活细胞荧光显微镜观察。尽管观察到少量自发的ZGRF1Δ4-73-2xYFP焦点，但这些焦点并非由MMC处理诱导的。相比之下，MMC处理后ZGRF1-2xYFP焦点增加了1.7倍（图4A和4B）。这些发现表明DUF2439结构域和/或RAD51是招募ZGRF1到MMC诱导的DNA损伤位点所必需的。

图4 DUF2439/RADIF结构域和RAD51对于招募ZGRF1到MMC诱导的焦点是必需的

(A) 使用胸苷将表达ZGRF1-2xYFP或ZGRF1Δ4-73-2xYFP的细胞同步到早期S期，然后用 MMC处理4小时（20 ng/mL），之后释放到不含MMC的新鲜培养基中。释放后1小时和2小时分别对细胞进行成像。红色箭头标记ZGRF1焦点。刻度尺：10 μm。

(B) MMC处理诱导表达ZGRF1-2xYFP的细胞形成核焦点，但不诱导表达ZGRF1Δ4-73-2xYFP的细胞形成核焦点。在未经处理的条件下（UNT，释放到S期后1小时）和MMC处理条件下（释放到S期后1小时和MMC处理后2小时）对核焦点进行了量化。每个点代表一个细胞（分别用蓝色和红色表示单独的复制品）。平均值用黑线表示，单个复制品的平均值用带黑圈的大点表示。通过配对t检验计算每个复制品的平均值的统计显著性（?p < 0.05，ns表示p ≥ 0.05，n = 2）。

(C) B02抑制剂抑制了ZGRF1向RAD51焦点的定位。表示表达ZGRF1-2xYFP和RAD51-mCherry的HCT116细胞的代表性图像。细胞使用2 mM胸苷同步到S期，然后用20 ng/mL MMC处理，同时或不使用30 μM RAD51抑制剂B02处理3小时。接下来，培养基替换为含有相同处理的Leibovitz’s L-15培养基（不含胸苷），以将细胞释放到S期。释放到S期后1小时进行显微镜观察。刻度尺：16 μm。白色箭头表示共定位焦点的例子。绿色箭头表示单独的ZGRF1焦点的例子。红色箭头表示单独的RAD51焦点的例子。

(D) 量化(C)中的ZGRF1和RAD51焦点（每个处理条件N = 160–230个细胞）。误差条表示平均值和标准差。显示了配对t检验的p值（ns，不显著，p > 0.05）。三个生物学复制品以叠加图的形式显示，较大的符号代表每个复制品的平均值。

(E) 表示HCT116 ZGRF1-2xYFP mCherry-FANCD2细胞在有无BRCA2 siRNA敲低条件下的代表性图像。细胞使用单次胸苷阻断同步到S期，然后用20 ng/mL MMC处理4小时。白色箭头指向共定位的焦点。刻度尺：5 μm。

(F) 量化(E)中的共定位FANCD2和ZGRF1焦点。误差条显示95%置信区间。p值通过Mann-Whitney U检验计算。橙色、蓝色和紫色代表各自的实验复制品。N > 150个细胞。

为了研究这种可能性，我们检查了RAD51抑制剂B02对MMC处理后ZGRF1焦点形成的影响。B02抑制RAD51与DNA的结合，从而抑制了RAD51焦点的形成和RAD51催化的链交换，并且我们确认B02在DR-GFP检测中抑制了HR（图S5A）。细胞使用胸苷同步到S期，并在有无B02的情况下用MMC处理，然后通过荧光显微镜观察ZGRF1和RAD51焦点的形成。B02显著减少了共定位的ZGRF1和RAD51焦点的形成（图4C和4D）。令人惊讶的是，我们还观察到了一部分不受B02处理的非共定位RAD51焦点。我们怀疑这些非共定位的RAD51焦点代表了蛋白质聚集体或异位表达的mCherry-RAD51融合蛋白的降解产物（图S5B），这可以解释它们对B02无反应的原因。重要的是，mCherry-RAD51融合蛋白的表达在MMC处理后不影响细胞生存（图S5C）。

为了独立验证ZGRF1是否通过RAD51被招募到MMC诱导的焦点，我们检查了BRCA2敲低后ZGRF1和FANCD2焦点的形成。BRCA2对于HR是必需的，因为它介导了单链DNA上RPA被RAD51替换的过程。我们对用siBRCA2或siLuciferase转染的HCT116 ZGRF1-2xYFP mCherry-FANCD2细胞进行了活细胞荧光显微镜观察，并用MMC处理4小时。BRCA2敲低通过免疫荧光确认，其中ZGRF1焦点在BRCA2缺乏的细胞中被消除（图S5D和S5E）。我们观察到BRCA2敲低后ZGRF1焦点的数量显著减少，尤其是与FANCD2共定位的ZGRF1焦点（图4E和4F）。值得注意的是，ZGRF1蛋白水平未受BRCA2敲低的影响，表明ZGRF1焦点的减少不是由于ZGRF1蛋白的不稳定（图S5F）。总的来说，这些结果表明ZGRF1向MMC诱导的DNA损伤位点的招募依赖于BRCA2、RAD51和ZGRF1的DUF2439结构域。

由于ZGRF1和RAD54B共享DUF2439结构域，而且该结构域似乎在招募到DNA损伤位点方面起作用，我们假设ZGRF1和RAD54B在同源定向修复中可能具有重叠的功能。为了验证这一想法，我们在人类骨癌细胞系U2OS（DR-GFP）中创建了RAD54B的纯合KO，该细胞系含有三个ZGRF1和RAD54B的基因拷贝，并在亲本和ZGRF1?/?/?背景中使用CRISPR-Cas9进行了敲除（图S6A）。通过Western blot确认了敲除效果，显示缺少全长RAD54B（图5A，左；图S6C）。此外，还在RAD54B?/?/?品系5中通过敲除ZGRF1生成了独立的双重KO（图5A，右；图S6B）。我们研究了ZGRF1?/?/?和RAD54B?/?/?细胞对DNA损伤剂MMC和talazoparib的敏感性。Talazoparib是一种聚(ADP-ribose)聚合酶1/2（PARP抑制剂或PARPi）的催化抑制剂，它将酶捕获在DNA上，从而产生依赖HR进行修复的复制相关DSB。

ZGRF1和RAD54B在HRS中的作用有重叠

由于ZGRF1和RAD54B共享DUF2439结构域，且该结构域似乎在招募到DNA损伤位点方面起作用，我们假设ZGRF1和RAD54B在同源定向修复中可能存在功能重叠。为了验证这一假设，我们在人类骨癌细胞系U2OS（DR-GFP）中创建了RAD54B的纯合KO，该细胞系含有三个ZGRF1和RAD54B的基因拷贝，并在亲本和ZGRF1?/?/?背景中使用CRISPR-Cas9进行了敲除（图S6A）。通过Western blot确认了敲除效果，显示缺乏全长RAD54B（图5A，左；图S6C）。此外，还在RAD54B?/?/?品系5中通过敲除ZGRF1生成了独立的双重KO（图5A，右；图S6B）。我们研究了ZGRF1?/?/?和RAD54B?/?/?细胞对DNA损伤剂MMC和talazoparib的敏感性。Talazoparib是一种催化抑制剂，它抑制poly(ADP-ribose)聚合酶1/2（PARP抑制剂或PARPi），该抑制剂将酶捕获在DNA上，从而导致依赖于HR的复制相关DSB。与已发表的数据一致，ZGRF1和RAD54B的单基因敲除都显示出对DNA交联（MMC）的敏感性（图5B）。RAD54B敲除细胞系的敏感性在另一个独立的克隆中也得到了验证（图S6D）。此外，在RAD54B?/?/?细胞系中敲除ZGRF1显著提高了MMC敏感性，而在ZGRF1?/?/?细胞系中敲除RAD54B仅略微提高了MMC敏感性，这表明ZGRF1和RAD54B可能具有某些重叠的功能。独立生成的双基因突变体对MMC的敏感度不同，这可能反映了抑制突变以及它们对亲本突变体表型的适应。RAD54B单基因敲除显示对talazoparib的敏感性（在另一个独立的敲除克隆中得到验证，图S6E），并且通过敲除ZGRF1进一步增强了这种敏感性（图5C），尽管在独立生成的双基因突变体中的效果程度不同，这进一步支持了ZGRF1和RAD54B的功能重叠。图5显示ZGRF1和RAD54在同源重组中具有重叠的功能。

注：以上内容为长篇科学文本的中文翻译，部分内容采用了简化或意译处理，以保持清晰性和流畅性。由于科学文本的复杂性，某些专业术语和详细实验步骤可能需要根据具体研究背景进行更精确的解释。然而，研究中的双重KO细胞显示出一些克隆变异，例如在MMC存活率和微核形成方面。这种变异可能反映了抑制突变的获得和/或适应性，因为U2OS细胞系是一种基因不稳定的癌细胞系。然而，我们更倾向于认为细胞系获得的是降低对遗传毒性应激敏感性并促进更快生长的抑制突变，而不是增加DNA损伤敏感性或染色体不稳定性的突变，这使我们对那些表现出叠加或协同表型的双重KO细胞更有信心，从而表明ZGRF1和RAD54B具有重叠的作用。鉴于ZGRF1和RAD54B都被发现可以促进同源配对和链交换，这可能是解释双重突变细胞系中观察到的增强表型的一个原因。此外，ZGRF1和RAD54B可能在位移环（D-loop）形成下游也发挥作用，这也可能有助于观察到的表型。例如，ZGRF1被发现可以促进交叉事件，可能是通过促进末端捕获来实现的。最后，在转化生物学意义上，ZGRF1和RAD54B在一些癌症中都被发现上调，其高表达与不良预后相关。此外，根据cBioportal的数据，癌症样本中观察到的遗传变化主要是ZGRF1的突变和RAD54B的扩增。值得注意的是，ZGRF1和RAD54B的癌症突变共现频率高于随机预期（p < 0.001）。此外，已经有报道指出RAD54B存在有害的生殖系和体细胞突变。总的来说，这些报告表明ZGRF1和RAD54B可以作为生物标志物，并可能成为抗癌治疗的潜在靶点，这进一步强调了阐明它们在DNA修复中的作用机制的重要性。

**研究的局限性**
这项研究存在一些局限性。特别是，我们观察到独立使用CRISPR-Cas9生成的突变U2OS细胞系之间存在表型异质性，这可能是由于基因编辑的脱靶效应或对突变的适应性所致。鉴于U2OS细胞缺乏端粒酶并且依赖于HR来替代延长端粒长度，未来研究ZGRF1和RAD54B突变对端粒长度维持的影响将是非常有趣的。

**材料可用性**
本研究生成的所有独特且稳定的试剂均可从主要联系人处获得，同时附有完整的材料转让协议。

**数据和代码可用性**
- 原始数据可根据请求提供。
- 本文未报告原始代码。
- ZGRF1-DUF的NMR化学位移已存入BioMagResBank，访问号为53243。
- Miseq数据已存放在https://www.ncbi.nlm.nih.gov/sra（访问号PRJNA1536334），也可在https://doi.org/10.5281/zenodo.22685314获取。
- 如需重新分析本文中报告的数据，可向主要联系人请求额外信息。

**致谢**
本研究得到了诺和诺德基金会（NNF22OC0074308资助A.B.和M.L.；NNF18OC0033926资助B.B.K.）、丹麦国家研究基金会（DNRF115资助T.C.R.M.和M.L.）、诺和诺德基金会Hallas-M?ller新兴研究者基金（NNF22OC0073571）和嘉士伯基金会（CF21-0571资助T.C.R.M.）以及丹麦独立研究基金（1026-00041B和7016-00214B资助M.L.、A.K.W.S.和O.P.）的支持。我们感谢哥本哈根大学的Jakob Nilsson提供人类亲本细胞系，哥伦比亚大学的Lorraine Symington分享pGAD-Rad51和pGBD-Rad51，以及东京大学的Kiyoshi Miyagawa和Takaaki Yasuhara提供RAD54B抗体。同时感谢德克萨斯大学的Helen Piwnica-Worms分享U2OS T-rex Flp-in细胞系，以及丹麦技术大学的Alexander Kai Büll和Soumik Ray在质谱测量方面的帮助。我们还感谢Villum Fonden和诺和诺德基金会（NNF18OC0032996）对NMR设施的支持，以及先进生物成像中心提供的HCS共聚焦显微镜的使用。

**作者贡献**
M.L.、O.P.、B.B.K.和V.H.O.共同构思、设计并监督了这项研究。实验工作由O.P.、C.A.R.、A.B.、V.T.-T.、S.G.、S.P.、S.W.、A.K.W.S.、E.W.K.L.、L.S.、E.L.B.-J.、K.S.V.和X.X.完成。T.C.R.M.在ColabFold和AlphaFold 2及3中监督建模工作。手稿由O.P.撰写，所有作者都对文本进行了审阅、评论和编辑。

**利益声明**
作者声明没有竞争利益。

**方法**
**关键资源表**
**试剂或资源**
- 抗体：
- 兔抗ZGRF1（Brannvoll等人）：批号28429（Biogenes, GmbH）
- 兔抗微管蛋白（Abcam）：Cat#ab6160；RRID:AB_305328
- 兔抗RAD51（Bio Academia）：Cat#70-001；RRID:AB_2177110
- 兔抗RAD54B（Kiyoshi Miyagawa和Takaaki Yasuhara，东京大学）：N/AR
- 兔抗TopBP1B（Bethyl）：Cat#A300-111A；RRID: AB_2272050
- STAR RED（山羊抗兔IgG）（Abberior）：Cat#STRED-1002-500UG；RRID: AB_2833015
- 山羊抗兔AF594（Thermo Fisher）：Cat#A11037；RRID: AB_2534095
- 山羊抗兔AF647（Thermo Fisher）：Cat#A21245；RRID: AB_25358
- HRP标记的猪抗兔抗体（Agilent Dako）：Cat#P0217；RRID:AB_272819
- HRP标记的兔抗鼠抗体（Invitrogen）：Cat#61–9520；RRID: AB_253394

**细菌和病毒菌株**
- 大肠杆菌菌株DH5α（Life Technologies）：Cat#18258012
- 大肠杆菌菌株BL21（DE3）（New Englang Biolabs）：Cat#C25271
- 大肠杆菌菌株One Shot? ccdB Survival? 2 TIR（Invitrogen）：Cat#A10460
- 大肠杆菌菌株INV110（无dam和dcm甲基化，Life Technologies）：Cat#C71710

**化学物质、肽和重组蛋白**
- 完整的蛋白酶抑制剂混合物（Roche）：Cat#25735720
- Dynabeads蛋白G（Invitrogen）：Cat#10004D
- Dynabeads streptavidin M-280（Invitrogen）：Cat#11205
- Mitomycin C（Sigma）：Cat#M7949
- Talazoparib（TargetMol）：Cat#T6253
- Camptothecin（Merck）：Cat#C9911
- KaryoMAX colcemid（Life Technologies）：Cat#15212-012

**其他工具**
- EdU click-chemistry kit（Thermo Fisher）：Cat#C10639
- Gateway? LR Clonase? II Enzyme mix（Thermo Fisher）：Cat#11791020
- NEBuilder HiFi DNA Assembly（New England Biolabs）：Cat#E2621
- SFactor Xa Cleavage Capture Kit（Merck）：Cat#69037

**数据存储**
- Miseq数据：https://doi.org/10.5281/zenodo.22685314 或 https://www.ncbi.nlm.nih.gov/sra（访问号PRJNA1536334）
- NMR化学位移数据：BioMagResBank（访问号53243）

**实验模型**
- 细胞系：HCT116（Brattain等人）
- U2OS（Pontén和Saksela）
- PE-1（Jiang等人）
- MiSeq试剂盒v2（Illumina）

**引物和寡核苷酸**
- 引物和寡核苷酸详见表S4

**重组DNA**
- pAB_KO1（Brannvoll等人）
- pABO10
- pABO11
- pABO12
- pABO13
- pABO14
- pABO15
- pABO16
- pABO17
- pABO18
- pABO19
- pABO20
- pABO21
- pABO22
- pABO23
- pABO24
- pABO27
- pABO28
- pABO29
- pCBA-I-Sce（Richardson等人）
- pCS2-mRFP（Sartori等人）
- pEL1
- pEL5
- pEL6
- pEL7
- pEL8
- pEL9
- pET-24a-SUMO（Twist Bioscience）
- pEX-B0087-M55（GeneCopoeia, Inc.）
- pGAD-C2（James等人）
- pGBD-C2（James等人）
- pGEX-3X-ZGRF1 N-term（Brannvoll等人）
- pKL9（Brannvoll等人）
- pML210
- pML212
- pML213
- pML214
- pML222
- pML223
- pOG44（O’Gorman等人）
- pOP10（Addgene Plasmid #209087）
- pOP11
- pOP12
- pOP13
- pOP14
- pPB8
- pX458（Ran等人）

**软件和算法**
- ICE工具EditCo：https://ice.editco.bio/#/FlowJo v10.4.1
- FlowJo, LLC（RRID: SCR_008520）
- Volocity v6.3（PerkinElmer）：RRID: SCR_002668
- SoftWoRx 7.0.0（Applied Precision）
- Prism 10（GraphPad软件）：RRID: SCR_000306
- HarmonyRevvity（N/A）
- NMRPipe（https://www.ibbr.umd.edu/nmrpipe）
- ACCP（N/A）
- Random coil shift predictor（www.bio.ku.dk/english/research/bms/sbinlab/randomchemicalshifts2）
- ACS Rosetta（https://docs.rosettacommons.org/docs/latest/CS-Rosetta）
- ImageJ（Schneider等人）

**实验细节**
- U2OS细胞在37°C、5% CO2条件下，使用含10%热灭活FBS、10,000单位/mL青霉素和10,000 μg/mL链霉素（Gibco，15140163）的Dulbecco改良Eagle培养基（DMEM）中培养。HCT116细胞在37°C、5% CO2条件下，使用含10%热灭活FBS、10,000单位/mL青霉素和10,000 μg/mL链霉素（Gibco，15140163）的McCoy’s 5A改良培养基中培养。条件培养基是通过将20%细胞在相应培养基中培养48小时至80%汇合度后，离心去除细胞制备的。
- 在使用表达外源蛋白的细胞（如Flp-in细胞系）时，细胞在接种前至少用选择抗生素处理2天以确保表达外源抗性标记。实验过程中未使用选择抗生素。研究中使用的细胞系列表见表S1。所有使用的亲本细胞系均经过检测，未发现支原体污染。
- 表S2-S4列出了研究中使用的引物、质粒、抗体和化学品/试剂的列表。

**CRISPR敲除的生成**
- RAD54B gRNA编码序列被克隆到CRISPR-Cas9 pX458质粒（Addgene plasmid #48138）中以敲除RAD54B。pX458先用BbsI酶切，去磷酸化并纯化。为了获得靶向序列，将两个互补的5′-磷酸化寡核苷酸（RAD54B_KOexon3_classic_F1和RAD54B_KOexon3_classic_R1）与BbsI酶切后的pX458退火，温度从95°C开始，以5°C/分钟的速度降温至25°C。退火的寡核苷酸通过加热连接到BbsI酶切并去磷酸化的pX458上，然后转化到大肠杆菌DH5α中。通过限制性酶切和测序验证gRNA的插入和序列，所得质粒命名为pOP10。此外，还使用pAB_KO1质粒敲除ZGRF1。

**转染和FACS**
- U2OS DR-GFP亲本细胞、ZGRF1敲除细胞或RAD54B敲除细胞使用FuGENE 6转染试剂（Promega，E2692）按制造商协议转染。转染比例为准备的6孔板和FuGENE 6转染试剂：DNA为3:1。转染后30小时，使用BD FACSJazz细胞分选仪将GFP阳性的细胞分选到含有40%条件培养基和60%普通培养基的96孔板中。

**基因分型**
- 细胞分选后14-18天，使用DNA QuickExtract（Lucigen，QE09050）从单个克隆中提取基因组DNA。使用RAD54B的引物RAD54B_KO_F4和RAD54B_KO_R2以及ZGRF1的引物ZGRF1_KO_IDAA_FW和ZGRF1_KO_4_RV扩增Cas9靶点附近的区域。所得PCR产物由Eurofins Genomics进行纯化和Sanger测序。使用在线Synthego ICE工具分析序列，以亲本细胞系序列作为对照。
- RAD54B的测序使用RAD54B_KO_F4引物进行，ZGRF1的测序使用ZGRF1_KO_IDAA_FW引物进行。

**Western blot验证**
- Western blot验证ZGRF1的敲除情况，方法如前所述。RAD54B的Western blot使用抗RAD54B抗体（来自东京大学的K. Miyagawa和T. Yasuhara）。细胞通过刮除收集，然后在冰上用23G针头在NP-40缓冲液（150 mM NaCl、1% NP-40、50 mM Tris-HCl pH 8.0、1 mM PMSF、完整蛋白酶抑制剂混合物（Roche，25735720）中裂解10次。所得全细胞提取物用于用Dynabeads Protein G pull down ZGRF1或RAD54B（及微管蛋白）。样品在1x SDS样品缓冲液（62.5 mM Tris、pH 6.8、2.5% SDS、0.002% Bromophenol Blue、5% β-mercaptoethanol、10%甘油、RIPA缓冲液）中煮沸10分钟。样品在70°C下进行SDS-PAGE分离，直到40 kDa标记物跑完。凝胶转移到0.45 μM PVDF膜（乙醇活化，Immobilon-FL，IPFL00010）上，4°C下作用18小时。膜在60 kDa处切割以分离微管蛋白和其他蛋白质，然后在5% skim milk和TBST中封闭1小时。ZGRF1的膜在室温下与相应的一抗孵育1小时；RAD54B的膜在4°C下一夜与一抗孵育。膜再用TBST洗涤3次，随后用ECL（GE Healthcare，RPN2232；ImageQuant LAS 4000）显色。

**Flp-in细胞系的生成**
- U2OS T-rex Flp-in ZGRF1?/?/?细胞转染表达Flp重组酶的质粒（pOG44）和含有ZGRF1 cDNA（pEL9）或带2xYFP标签的DUF2439删除变体（pOP11）的Flp-in质粒（带有FRT位点）。转染使用Lipofectamine 3000按制造商协议进行。PCR 2：使用ZGRF1-6100-FW和ZGRF1-105-RV扩增ZGRF1 cDNA（815 bp），并通过显微镜验证ZGRF1-2xYFP的表达。细胞接种在Ibidi 8孔μ-slides（Ibidi，80826）中。成像前30分钟，将培养基更换为Leibovitz’s L-15培养基（不含酚红，含有10% FBS，Gibco，21083-027），并加入0.4 μM Hoechst 33258（Merck Life Science，14530）。成像前立即去除Hoechst，并使用DeltaVision Elite显微镜（softWoRx软件）在Leibovitz’s L-15培养基中观察细胞。成像温度为37°C，以0.5 μm间隔获取5个光学切片。利用Volocity软件测量总核YFP强度（由Hoechst标记的细胞核），并比较表达全长ZGRF1的Flp-in细胞与DUF2439缺失突变体细胞之间的差异。

构建HCT116 ZGRF12xYFP/+ mCherry-RAD51细胞系
含有由CMV启动子控制的mCherry-RAD51表达盒的pEX-B0087-M55载体通过PvuI进行线性化，并转染到HCT116 ZGRF12xYFP/+细胞中。筛选出对新霉素具有抗性的细胞，从中选择克隆B1用于本研究。

克隆存活实验
将细胞以重复方式接种在6孔板（三种不同的细胞密度）或直径为10 cm的培养皿（一种细胞密度）中，并让其贴壁过夜。次日，用指定的DNA损伤剂处理细胞。对于MMC，处理24小时后洗去药物；对于talazoparib处理的样本，持续处理直至固定。talazoparib处理的样本接种在40%的调整后的培养基中。细胞生长至形成菌落（根据细胞系和药物的不同，需10-20天），此时加入0.5%甲基紫在25%甲醇中染色2分钟以固定菌落。用清水洗去染色和固定液，干燥平板后进行手动计数菌落。通过将存活率与未处理样本的接种效率进行归一化来计算存活比例。

DR-GFP HR实验
DR-GFP HR实验按照文献中的方法进行。简要来说，携带DR-GFP基因（整合在基因组中）的U2OS细胞与I-SceI表达载体（pCBA-I-SceI）和mRFP表达载体（pCS2-mRFP）以1:3的比例共转染（阴性对照仅转染mRFP表达载体）。转染48小时后收获细胞，使用BD FACSJazz Cell Sorter通过流式细胞术分析GFP和mRFP的表达情况。仅分析mRFP陽性的细胞，使用FlowJo计算HR效率（GFP表达），以考虑重复实验之间的转染效率差异。不同时间的实验结果绘制在不同的图中（图5F；图S6F），因为GFP阳性细胞的绝对水平可能因FACS校准和不同批次载体及转染试剂而异。

微核和后期桥的定量
U2OS细胞接种在96孔PhenoPlates（PerkinElmer，6055308）中，用指定剂量的talazoparib处理24或72小时。处理后，用4%甲醛的PBS固定10分钟，然后用0.3% Triton X-100渗透5分钟。在黑暗条件下加入200 ng/mL DAPI染色6分钟。去除DAPI后，细胞保存并在PBS中成像。使用Revvity Opera Phenix显微镜和Harmony软件进行成像。使用PreciScan功能识别和成像后期细胞。微核通过Harmony软件自动定量，而后期桥则通过手动计数。

活细胞成像
为了成像ZGRF1焦点，将表达ZGRF1-2xYFP或ZGRF1-2xYFP-Δ4-73的细胞接种在8孔μ-Slide（Ibidi，80826）中。使用2 mM胸苷将细胞同步18小时再进行显微镜观察。成像前4小时，向处理过的样本中加入20 ng/mL MMC。成像前30分钟，将培养基更换为Leibovitz’s L-15培养基（不含酚红，含有10% FBS，Gibco，21083-027），并加入0.4 μM Hoechst 33258。成像前立即去除Hoechst，并使用配备100×油浸物镜的DeltaVision Elite显微镜（softWoRx软件）在Leibovitz’s L-15培养基中观察细胞。成像温度为37°C，以0.5 μm间隔获取7个光学切片。

在表达ZGRF1-2xYFP和mCherry-RAD51的HCT116细胞中检查ZGRF1和RAD51焦点的共定位。大约在每个8孔μ-Slide（Ibidi，80826）中接种40,000个细胞，最终每孔体积为200 μL McCoy’s 5A培养基。细胞在37°C下孵育过夜以促进适当贴壁和生长。

通过将细胞在2 mM胸苷中培养过夜来实现S期的细胞周期同步。次日，用含有或不含30 μM B02（RAD51抑制剂，Merck，SML0364，从10 mM储备液中的DMSO中加入）的mitomycin C处理细胞3小时。最后，去除培养基并替换为含有相同药物但不含胸苷的Leibovitz’s L-15培养基，使细胞进入S期。再孵育1小时后再进行成像。在Deltavision显微镜下以0.5 μm的Z间隔获取8个光学切片的图像。每种处理条件捕获10张图像。YFP的曝光时间为2秒，mCherry的曝光时间为0.5秒，LED强度为32%。

RAD51免疫染色
实验方法参照文献进行修改。简要来说，将携带DR-GFP基因（整合在基因组中）的U2OS细胞与I-SceI表达载体（pCBA-I-SceI）和mRFP表达载体（pCS2-mRFP）以1:3的比例共转染（阴性对照仅转染mRFP表达载体）。转染48小时后收获细胞，使用BD FACSJazz Cell Sorter通过流式细胞术分析GFP和mRFP的表达情况。仅分析mRFP陽性的细胞群体，使用FlowJo计算HR效率（GFP表达），以考虑重复实验之间的转染效率差异。不同时间点的实验结果绘制在不同的图中（图5F；图S6F），因为GFP阳性细胞的绝对水平可能因FACS校准和不同批次载体及转染试剂而异。

微核和后期桥的定量
U2OS细胞接种在96孔PhenoPlates（PerkinElmer，6055308）中，用指定剂量的talazoparib处理24或72小时。处理后，用4%甲醛的PBS固定10分钟，然后用0.3% Triton X-100渗透5分钟。在黑暗条件下加入200 ng/mL DAPI染色6分钟。去除DAPI后，细胞保存并在PBS中成像。使用Revvity Opera Phenix显微镜和Harmony软件进行成像。利用PreciScan功能识别和成像后期细胞。微核通过Harmony软件自动定量，后期桥则通过手动计数。

活细胞成像
为了成像ZGRF1焦点，将表达ZGRF1-2xYFP或ZGRF1-2xYFP-Δ4-73的细胞接种在8孔μ-Slide（Ibidi，80826）中。使用2 mM胸苷将细胞同步18小时后再进行显微镜观察。成像前4小时，向处理过的样本中加入20 ng/mL MMC。成像前30分钟，将培养基更换为Leibovitz’s L-15培养基（不含酚红，含有10% FBS，Gibco，21083-027），并加入0.4 μM Hoechst 33258。成像前立即去除Hoechst，并使用配备100×油浸物镜的DeltaVision Elite显微镜（softWoRx软件）在Leibovitz’s L-15培养基中观察细胞。成像温度为37°C，以0.5 μm间隔获取7个光学切片。

在表达ZGRF1-2xYFP和mCherry-RAD51的HCT116细胞中检查ZGRF1和RAD51焦点的共定位。在每个8孔μ-Slide（Ibidi，80826）中接种大约40,000个细胞，每孔最终体积为200 μL McCoy’s 5A培养基。细胞在37°C下孵育过夜以促进适当贴壁和生长。

通过在2 mM胸苷中培养细胞过夜实现S期的细胞周期同步。次日，用mitomycin C（Sigma，M7949）处理细胞，同时加入或不含30 μM B02（RAD51抑制剂，Merck，SML0364，从10 mM储备液中的DMSO中加入）处理3小时。最后，去除培养基并替换为含有相同药物但不含胸苷的Leibovitz’s L-15培养基，使细胞进入S期。再孵育1小时后进行成像。在Deltavision显微镜下以0.5 μm的Z间隔获取8个光学切片的图像。每种处理条件捕获10张图像。

RAD51免疫染色
实验方法参照文献进行修改。简要来说，将U2OS细胞接种在96孔PerkinElmer PhenoPlates（每个时间点一个平板）中，并使用单次胸苷处理（2 mM胸苷处理18小时）进行S期同步。同步后，用1000 ng/mL MMC处理细胞1小时。处理后，细胞洗涤两次，然后在指定时间内恢复到新鲜培养基中，再进行预提取和固定。细胞用0.3% Triton X-100（0.3% Triton X-100在20 mM PIPES pH 6.8，1 mM MgCl2，10 mM EGTA的ddH2O）预提取3分钟，然后用4%甲醛（4%甲醛，0.3% Triton X-100在20 mM PIPES pH 6.8，1 mM MgCl2，10 mM EGTA的ddH2O）固定15分钟。固定后，用PBS洗涤4次，并在4°C下保存过夜。RAD51染色按照文献中的方法进行，使用STAR red作为 secondary antibody（Abberior，STRED-1002-500UG）。染色完成后，细胞在黑暗条件下用200 ng/mL DAPI染色7分钟。染色完成后，细胞在4°C下保存在PBS中直至成像。使用Revvity Opera Phenix显微镜和Harmony软件进行成像。成像温度为室温，以0.5 μm间隔获取7个光学切片。使用Revvity Harmony软件进行自动处理和定量分析。仅统计位于细胞核内的焦点。

RAD51的Western blot
通过胰蛋白酶处理收获HCT116细胞进行Western blot，用冰冷的PBS洗涤，离心收集后悬浮在50 μL含有complete protease inhibitor cocktail（Roche，25735720）的RIPA缓冲液中。在冰上孵育15分钟后，以20,000 g在4°C下离心20分钟，然后转移上清液到新的试管中。提取物与含有10% β-mercaptoethanol的Laemmli样本缓冲液混合，并在95°C下加热5分钟，随后加载到Bio-Rad 4–20% mini-PROTEAN TGX预制梯度凝胶上，电压100V电泳2小时。使用Spectra Multicolor Broad Range Protein Ladder（ThermoFisher，26634）作为分子量标准。

免疫印迹时，将蛋白质转移到孔径为0.45 μm的聚偏二氟乙烯（PVDF）膜（Millipore，IPFL00010）上，转移缓冲液为25 mM Tris base，190 mM glycine，20% ethanol，温度4°C，孵育过夜。PVDF膜在组装凝胶/膜三明治之前用96%乙醇激活。探针处理前，用1X TBS（Tris缓冲液pH 7.6，含0.1% Tween 20（1X TBST）和5% milk在室温下封闭1小时。接下来，在室温下用兔抗RAD51抗体（1:2000，Abcam，ab63798）在1X TBST（含5% milk）中探针处理1小时。然后，在室温下用1X TBST洗涤三次后，用辣根过氧化物酶标记的兔二抗（Agilent Dako，P0217，1:1000）在1X TBST中探针处理1.5小时。最后，在室温下用ECL（Amersham，RPN2236）和ImageQuant软件进行成像。

ZGRF1-2xYFP表达载体质粒（pEL9）的生成
使用GeneCards数据库确定了驱动ZGRF1表达的启动子。该启动子位于ZGRF1起始密码子上游3.4 kb的区域，包括内含子1、外显子1和外显子2（chr4:112,635,200–112,638,648）。利用GeneArt Services（Thermo Fisher）合成该启动子的一个片段（2003 bp，包含内含子1和外显子1），并在5′端添加KasI限制性位点，在3′端添加NotI限制性位点，用于后续的限制性酶切和连接反应。为了生成完整的启动子区域，从U2OS基因组DNA（chr4: 112633901–112636909）中使用引物ZGRF1_Exon1_1_Fw和ZGRF1_Intron2_2950_Rv通过PCR扩增一个包含内含子2的3028 bp片段。扩增的片段用ApaI和NotI切割后，与预先构建的pAIO_ZGRF1prom CmR-ccdB载体（pKL9）连接，生成包含完整启动子区域和attR1位点的pEL5，以便进行后续的Clonase反应。载体和合成的上游区域都用BstBI和NotI切割，生成互补末端，然后将这些末端连接起来，组装成从GeneCards中识别的3.4 kb启动子区域，生成pEL6。在Clonase反应中将带有2xYFP标签的ZGRF1 cDNA插入启动子之前，将连接好的组装体转移到含有ccdB选择标记的骨架上。通过KasI和NotI的限制性酶切，然后连接到pAIO_ZGRF1prom CmR-ccdB载体（pEL7）上，接着使用第二种含有2xYFP标签的ZGRF1 cDNA（pEL1）在pDONR221骨架（Thermo Fisher，12536017）上进行LR Clonase反应，生成含有启动子区域和ZGRF1-2xYFP cDNA（pEL8）的载体。该载体克隆在One Shot ccdB Survival 2 T1R Chemically Competent Cells（Invitrogen，A10460）中。

为了确保由启动子序列驱动的cDNA有效表达，首先通过一系列步骤删除了位于外显子2内部（起始密码子上游）的attB1位点。首先，使用引物ZGRF1_Intron2_3170_Fw和ZGRF1_Exon2_42_Rv通过PCR扩增内含子2的BstEII切割位点和外显子2 5′端之间的505 bp区域。接着，使用引物ZGRF1_Exon2_42-ATG_Fw和ZGRF1_ATG-2952_Rv扩增外显子2 3′端到PmlI切割位点之间的2973 bp片段。这两个PCR产物用于融合PCR，生成一个3478 bp的片段。最后，用BstEII和PmlI切割融合PCR产物，并将其连接到消化的LR Clonase反应产物上，替换含有attL1位点的片段，生成用于转染的ZGRF1-2xYFP表达载体（pEL9）。通过测序验证正确的克隆。

在FRT/Flp-in载体中克隆ZGRF1Δ4-73-2xYFP
基于含有全长ZGRF1 cDNA的pEL9载体构建了ZGRF1Δ4-73-2xYFP和ZGRF1Δ108-125-2xYFP表达载体，其中ZGRF1 cDNA在其天然启动子中表达2xYFP。ZGRF1Δ4-73-2xYFP载体通过PCR扩增整个载体，但不包括编码氨基酸（aa）4–73的区域。分两部分进行：第一部分，引物pEL9 delete 4–73 F和pEL9 DUF deletion split R；第二部分，引物pEL9 DUF deletion split F和pEL9 Del108-125_Nterm_F和pEL9 Del108-125_Cterm_R。扩增的PCR产物使用NEBuilder HiFi DNA Assembly（New England Biolabs，E2621S）根据制造商的协议进行纯化和组装，得到载体pOP11（ZGRF1Δ4-73-2xYFP），并通过测序确认正确的克隆。ZGRF1Δ108-125-2xpEL9载体被BstEII和PmlI切割后，线性化的质粒以及两个PCR产物通过NEBuilder HiFi DNA Assembly（New England Biolabs，E2621S）按照制造商的协议进行组装，从而得到了载体pOP12（ZGRF1Δ108-125-2xYFP），并且通过测序确认了正确的克隆。pOP11用于人类细胞的转染，而pOP12则用于酵母2-杂交系统的亚克隆和蛋白质表达（见后续段落）。

**酵母2-杂交载体的克隆**
通过使用BamHI和PstI适应的引物pGD-ZGRF1-start-F和pGD-ZGRF1-140-R，从pML210中PCR扩增出带有GAD和GBD标签的ZGRF11-140（DUF140）序列，构建了相应的载体。随后，将BamHI/PstI切割后的PCR产物克隆到BamHI/PstI切割的pGAD-C2和pGBD-C2中，分别得到pML213和pML212载体，并通过测序验证了正确的克隆。

**带有GAD和GBD标签的ZGRF1-DUF140Δ108-125载体的克隆**
首先从dam和dcm甲基化阴性的大肠杆菌INV110（Life Technologies，C717103）中纯化出pML212和pML213载体。接着，利用ClaI酶将这些载体在DUF140结构域进行线性化，并与pOP12共同转化到酵母菌株PJ69-4A中，通过缺口修复将DUF140Δ108-125突变导入pML212和pML213中。得到的载体分别被命名为pML222和pML223。

**酵母2-杂交构型的构建**
从含有hZGRF1 cDNA的pDONR221（pAB E012）中扩增出ZGRF1的DUF90、ZnF、USTR和HEL区域。用于扩增编码ZGRF1第1-90位氨基酸残基（aar）的引物分别为DUF90_Y2H-F#2和DUF90_Y2H-R#2。将BamHI/PstI切割后的PCR产物克隆到BamHI/PstI切割的pGAD-C2和pGBD-C2中，得到pABO9和pABO8。用于扩增ZGRF1锌指结构域（ZnF）的引物分别为ZnF_Y2H-F和ZnF_Y2H-R#2。同样地，将BamHI/PstI切割后的PCR产物克隆到BamHI/PstI切割的pGAD-C2和pGBD-C2中，得到pABO12和pABO13。用于扩增ZGRF1解旋酶结构域的引物分别为Hel_Y2H-F和Hel_Y2H-R。接着，将XmaI/SalI切割后的PCR产物克隆到XmaI/SalI切割的pGAD-C2和pGBD-C2中，得到pABO5和pABO4。用于扩增ZGRF1大片段无结构区域的引物分别为USTR_Y2H-F和USTR_Y2H-R。

**表示GAD-RAD51和GBD-RAD51的载体**
通过使用引物Rad51_Y2H-F和Rad51_Y2H-R从pEX-B0087-M55中PCR扩增RAD51 cDNA，构建了相应的载体。然后将BamHI/PstI切割后的PCR产物克隆到BamHI/PstI切割的pGAD-C2和pGBD-C2中，得到pABO6和pABO7。使用ADH1 prom-F引物验证了正确插入的产物。

**带有氨基酸替换（K19A，AAA→GCA）的DUF90载体**
首先使用pABO8（GBD-DUF90）作为模板，通过两次PCR扩增构建了带有K19A替换的DUF90载体（primer对分别为DUF-K19A-F和DUF90_Y2H-R#2，以及DUF-K19A-R + DUF90_Y2H-F#2）。将两次PCR产物通过引物DUF90_Y2H-F#2和DUF90_Y2H-R#2进行融合PCR，得到一个长度为286 bp的产物，该产物在两端具有BamHI和PstI限制性位点。将融合PCR产物与pGBD-C2载体通过BamHI和PstI切割后连接在一起。通过使用ADH1 prom-F引物进行测序确认了正确的克隆，该载体被命名为pPB8。

**表示GAD-DUF90K19E和GBD-DUF90K19E的载体**
首先使用引物对DUF90_Y2H-F#2和DUF90_K19E-R1以及DUF90_K19E-F1和DUF90_Y2H-R#2从pABO8（GBD-DUF90）中扩增出含有K19E突变的PCR产物。将这两个PCR产物在第二次PCR中使用引物DUF90_Y2H-F#2和DUF90_Y2H-R#2进行融合。最终，将融合PCR产物通过BamHI/PstI切割并连接到线性化的pGAD-C2和pGBD-C2载体中。通过Sanger测序验证了质粒构建的正确性。

**表示GAD-RAD54B-DUF2439和GBD-RAD54B-DUF2439的载体**
通过克隆一个合成序列（GeneArt），该序列编码RAD54B的aar 121–198区域，并使用限制酶BamHI和PstI将其适配到线性化的pGAD-C2和pGBD-C2载体中，分别构建了pABO27和pABO28载体。

**His6-SUMO标签的ZGRF1 N端结构域的克隆用于蛋白质纯化**
将编码aar 1–140或aar 1-140Δ108-125的ZGRF1 cDNA序列插入pET-24a-SUMO载体中，以便在其N端表达并带有His6-SUMO标签进行纯化。首先使用引物DUF 1–90 F和SUMO-DUF1-140-R从质粒pAB E012（DUF140）或pOP12（DUF140Δ108-125）中扩增出相应cDNA序列。这些引物具有5′延伸序列，用于添加插入pET-24a-SUMO的限制位点以及添加终止密码子。将PCR产物和载体分别用Eco31I和XhoI切割后，使用T4 DNA ligase连接在一起。通过限制酶切割和测序验证插入的准确性，然后将正确的质粒转化到BL21（DE3）大肠杆菌中进行蛋白质表达和纯化。这些载体分别被命名为pOP13（DUF140）和pOP14（DUF140Δ108-125）。

**His6-SUMO标签的ZGRF1 N端结构的表达和纯化**
在BL21（DE3）大肠杆菌中通过IPTG诱导表达His6-SUMO标签的蛋白质，并使用Ni-NTA beads（Life Technologies，R901-15）进行纯化。将含有所需表达载体的大肠杆菌在含有50 μg/mL卡那霉素的LB培养基中过夜培养。次日上午，将过夜培养物加入含有50 μg/mL卡那霉素的1L LB培养基中，37°C下培养至OD600 = 0.6–0.7。通过添加0.1 mM IPTG诱导蛋白质表达，并在37°C下继续孵育5小时。细胞在8000g下离心10分钟。细胞沉淀重悬于裂解缓冲液（10 mM咪唑、50 mM Tris pH 8.0、150 mM NaCl）中，并用超声波破碎器（Hielscher，UP200S Sonicator，点尖端，MAX功率）破碎细胞。细胞裂解液在4°C下20,000g离心45分钟后，应用到5 mL Ni-NTA beads上并在4°C下孵育1小时。然后用洗涤缓冲液（10 mM咪唑、50 mM Tris pH 8.0、1 M NaCl）洗涤珠子，再重悬于重悬缓冲液中。蛋白质通过洗脱缓冲液（250 mM咪唑、50 mM Tris pH 8.0、150 mM NaCl）进行洗脱。蛋白质纯度通过SDS-PAGE和Coomassie染色确定。

**RAD51的表达和纯化**
如前所述，从大肠杆菌中表达并纯化了RAD51。

**ZGRF1 N端结构的表达和纯化用于NMR**
如前所述，在大肠杆菌中使用pGEX-3X载体表达并纯化了ZGRF1的N端96个氨基酸残基。简而言之，将pGEX-3X-ZGRF1-N质粒转化到BL21（DE3）大肠杆菌中，并使用100 μM IPTG诱导蛋白质表达4小时。使用Glutathione Sepharose 4B（GE Healthcare，170756-01）纯化了带有GST标签的ZGRF1 N端区域（aar 1–102）。使用Factor Xa蛋白酶（Merck，69037）切掉GST标签，然后使用Xarrest Agarose从Factor Xa Cleavage Capture Kit（Merck，69037）中去除Factor Xa。需要注意的是，Factor Xa在去除GST标签的同时也去除了C端的最后6个氨基酸残基，从而在纯化后仅留下N端的96个氨基酸残基。为了制备用于核磁共振（NMR）光谱分析的标记蛋白质，将细胞在含有13C6-葡萄糖和15NH4Cl同位素的M9培养基（42.5 mM Na2HPO4、22 mM KH2PO4、1 mM MgSO4、17 mM NaCl、18.7 mM NH4Cl、22.2 mM葡萄糖，M2微量元素溶液）中培养。纯化的ZGRF1-N蛋白质通过Superdex 75柱（180 mL）进行大小排阻色谱分离。收集在280 nm处有吸收的洗脱峰，并在TCEP缓冲液（25 mM Tris pH 7.5、150 mM NaCl、10% (v/v) D2O、2 mM TCEP）中透析。使用Amicon 3K Ultra离心过滤柱（Merck，UFC9003）将蛋白质浓缩至0.9 mg/mL。这种蛋白质溶液用于NMR分析。

**ZGRF1-DUF2439的NMR分析**
将蛋白质样品调整至最终NMR样品，其中含有80 μM 13C,15N-ZGRF1-DUF2439或80 μM 15N-ZGRF1-DUF2439，缓冲液为25 mM Tris-HCl、150 mM NaCl、2 mM TCEP、pH 7.5、10% (v/v) D2O、2 mM 2,2-二甲基-2-戊烷-5-磺酸（DSS）。在600 MHz（relaxation）或750 MHz（assignments and relaxation）Bruker Avance光谱仪上记录了一系列2D和3D NMR谱图，用于主链化学位移的测定。侧链化学位移通过1H13C HSQC、15N TOCSY-HSQC和HCCH-TOCSY谱图获得。质子化学位移相对于DSS进行内部标定，而异核素的化学位移则通过相对旋磁比进行标定。谱图使用Bruker BioPack的脉冲序列进行记录，并通过NMRPipe软件进行转换和分析。化学位移手动分配，二级化学位移通过www.bio.ku.dk/english/research/bms/sbinlab/randomchemicalshifts2网站提供的随机 coil化学位移预测模型计算。使用CSI 3.0软件计算了ZGRF1-DUF2439的化学位移模型。

**蛋白质-蛋白质相互作用的预测**
使用ColabFold和AlphaFold 2预测蛋白质-蛋白质相互作用。预测结果的使用图像通过PyMOL生成。

**酵母2-杂交系统**
利用酵母2-杂交系统研究了蛋白质-蛋白质相互作用。将pGAD载体分别转化到MATa PJ69-4A菌株中，而pGBD载体则使用LiAc转化法转化到MATα PJ69-4A菌株中。当转化子形成菌落后，将MATa和MATα菌株杂交，并使用SC-Trp-Leu（一种缺乏色氨酸和亮氨酸的合成完全培养基）选择出同时携带一个pGAD载体和一个pGBD载体的二倍体细胞。将二倍体细胞转移到新的SC-Trp-Leu平板上，然后复制到含有3 mM 3-氨基三唑的SC-Trp-Leu-His平板上，再转移到SC-Trp-Leu-Ade平板上。在这些选择平板上的生长情况用于确定蛋白质-蛋白质相互作用。此外，二倍体细胞在96孔平板中的液体SC-Trp-Leu培养基中培养，使用β-半乳糖苷酶测定法定量测量相互作用。收集每个培养物的上清液，将细胞重悬于50 μL Z缓冲液（60 mM Na2HPO4、40 mM NaH2PO4、10 mM KCl、1 mM MgSO4、50 mM β-巯基乙醇，pH 7.0）中。加入25 μL 0.1% SDS和6 μL氯仿后，30°C下孵育15分钟以裂解细胞。作为β-半乳糖苷酶的底物，加入60 μL 4 mg/mL的ONPG并混合。细胞在30°C下孵育直至出现黄色，然后加入120 μL 1M Na2CO3终止反应。将每个孔的上清液转移到新的96孔平板上，测量420 nm和550 nm处的OD值。Miller单位（MU）的计算公式为MU = 1000 x (OD420–1.75 x OD550)/(T x V x OD600)，其中ODxxx表示在不同波长（600 nm在细胞悬浮液中测量，420和550 nm在反应混合物中测量）下的光密度，T表示加入ONPG后的时间（以分钟计），V表示体积（以毫升计）。

**GAD-DUF90表达的Western blot**
为了准备在酵母2-杂交菌株PJ69-4A（转化有pABO9（GAD-DUF90）或pABO23（GAD-DUF90-K19E）中表达的GAD-DUF90的全细胞提取物，将细胞在30°C下摇床培养过夜。然后将过夜培养物稀释至OD600 = 0.2，并在30°C下在50 mL SC-Leu培养基中培养3小时，之后通过离心收获细胞。细胞先用20 mL H2O洗涤，再用10 mL 20% TCA洗涤，然后转移到2 mL Fast-prep管（Sarstedt，72.693）中。从解冻的细胞中提取样本，方法是在室温下使用Mini-BeadBeater 24（Biospec产品，112011EUR）以玻璃珠进行三次敲打，每次45秒，每次敲打之间间隔1分钟（在冰上）。提取的样本转移到1.5 mL试管中，并稀释至最终浓度为10%的TCA。通过将样本在3000 rpm的离心机中以室温离心10分钟来收集蛋白质。接下来，将沉淀重新悬浮在含有5% β-巯基乙醇的2x Laemmli loading缓冲液中100 μL，并加入2M Tris直至样本变蓝（约50 μL）。最后，将样本煮沸3分钟，然后在3000 rpm的离心机中离心10分钟，目的蛋白上样到Bio-Rad 4–20% mini-PROTEAN TGX预制梯度凝胶上，接着在100V下进行2小时的电泳。

对于免疫印迹实验，将蛋白质转移到孔径为0.45 μm的聚偏二氟乙烯（PVDF）膜上（Millipore，IPFL00010），使用Transfer Buffer（25 mM Tris碱、190 mM甘氨酸、20%乙醇）在4°C下处理1.5小时，电流为200 mA。在组装凝胶/膜三明治结构之前，先用96%乙醇对PVDF膜进行活化。在探针处理之前，将膜在含有0.1% Tween 20（1X TBST）和5%牛奶的1X TBS（Tris缓冲盐溶液）中于室温下封闭1小时。随后在含有5%牛奶的1X TBST中于室温下用针对GAD的一抗（sc-1663，1:2000）孵育膜3小时。之后用1X TBST清洗膜两次，并再用辣根过氧化物酶标记的抗鼠二抗（Dako，P0161；1:5000）在含有5%牛奶的1X TBST中于室温下孵育膜1小时。最后在室温下的摇摆桌上用1X TBST清洗膜两次，并使用ECL（Amersham，RPN2236）和ImageQuant软件进行显色。

通过使用生物素标记的ssDNA进行streptavidin拉钩实验来研究ZGRF1的N端区域与RAD51-ssDNA核蛋白纤维之间的相互作用。具体步骤如下：将10 μL浓度为30 nM的生物素标记的ssDNA（80 nt，poly(dT)）与10 μL Dynabeads streptavidin M-280珠子（Invitrogen，11205D）在反应缓冲液中（20 mM Tris（pH 7.5）、150 mM NaCl、0.05% Tween 20、25 μg/mL BSA）于室温下轻轻搅拌孵育1小时（不含ATP和MgCl2）。如果不使用ssDNA，珠子则在不含ATP和MgCl2的反应缓冲液中孵育。孵育后，用不含ATP和MgCl2的反应缓冲液清洗珠子两次，然后重新悬浮在含有ATP和MgCl2的反应缓冲液中（如上所述，含1 mM ATP、5 mM MgCl2）。加入15 μL浓度为1 μM的RAD51并在4°C下轻轻搅拌孵育1小时，随后加入5 μL浓度为4 μM的DUF140（或其变体）并在4°C下轻轻搅拌孵育1小时。如果不使用RAD51或DUF140，则仅用一种蛋白质或不加蛋白质孵育珠子1小时。收集上清液以分析未结合的蛋白质。加入十二烷基硫酸锂（LDS）缓冲液，然后将样品加热至70°C 10分钟。用不含ATP和MgCl2的反应缓冲液清洗珠子两次，然后用加热至70°C 10分钟的LDS样品缓冲液（4xLDS样品缓冲液（Invitrogen，NP0007）和10x样品还原剂（Invitrogen，NP0009）进行洗脱。上清液和洗脱液使用NuPAGE（Bis-Tris 4–12%，Invitrogen，NP0336BOX）进行分析，随后按照制造商的协议（BIO-RAD，161–0449）进行银染色。使用ImageJ软件的“BandPeakQuantification”宏定量条带强度，并将其相对于RAD51的条带强度进行标准化。

使用Refeyn TwoMP质量光度计测定单个分子和复合物的相对浓度。将含有指定蛋白质浓度的样品混合在Eppendorf试管中，并装入6孔盒（MP-CON-41005）中，然后放置在载玻片（MP-CON-21009）上。使用AcquireMP软件以常规尺寸帧进行采集，每个样品采集时间为60秒。样品分析和高斯拟合使用Python完成。

在固定前两天，将细胞接种在24孔板的? 12 mm盖玻片上，并在培养基中过夜培养（37°C，5% CO2）。第二天，用aphidicolin（0.4 μM）处理细胞16小时。用预温的培养基清洗细胞，然后加入20 μM的EdU和100 ng/mL的Colcemid，在37°C的培养箱中孵育1小时以富集有丝分裂细胞。再用1x PBS清洗细胞两次，然后加入100 μL浓度为4%的paraformaldehyde（PFA）在1x PBS中处理10分钟以固定细胞。加入PBS-T（PBS +0.1% Tween 20，含有3% BSA）以中和甲醛。接着在室温下加入KCM缓冲液（120 mM KCl、20 mM NaCl、10 mM Tris/HCl pH 8.0、0.5 mM EDTA、0.1% Triton X-100（ThermoFisher，T8787）处理10分钟以渗透细胞。渗透后，用含有3% BSA的PBS-T（封闭溶液）清洗细胞两次，然后使用EdU click-chemistry试剂盒（ThermoFisher）进行click反应以可视化EdU（荧光剂AZ染料488 picolyl azide，Vector labs），按照制造商的协议操作。再用封闭溶液清洗细胞两次，然后在37°C的湿润培养箱中用一抗孵育1小时。使用的一抗：兔抗TopBP1（1:200，Bethyl，A300-111A）。再用PBS-T清洗细胞两次，然后在37°C的湿润培养箱中用二抗孵育30分钟。使用的二抗：山羊抗兔AF594（1:500，A11037）或山羊抗兔AF647（1:500，A21245）。抗体孵育后，用PBS-T清洗细胞两次，在黑暗中用200 ng/mL的DAPI染色10分钟，然后再用PBS-T清洗两次。然后用Prolong Diamond（ThermoFisher，P36961）将盖玻片安装到显微镜载玻片上，并放置过夜以进行观察。

CRISPR-Select编辑实验的设计如前所述。简要来说，要突变的位点尽可能靠近PAM序列以促进高效的基因敲入。修复模板设计为单链寡核苷酸（ssODNs），在其两侧有45个核苷酸的同源臂，这些同源臂位于要突变的密码子旁边。同义的WT'突变位于与目标突变体相同的位点（MUT，终止密码子），以促进相似频率的基因敲入。从Eurofins Genomics购买未修饰的DNA寡核苷酸RAD54B-WT’和RAD54B-MUT。使用Neon NxT电穿孔系统在制造商指定的条件下将pOP10质粒（用于Cas9表达）和RAD54B的gRNA传递给细胞。150,000个细胞转染1 μg的pOP10和100 pM的修复模板（RAD54B-WT’和RAD54B-MUT的1:1混合物）。电穿孔参数如下：脉冲电压1,350 V，脉冲宽度20 ms，脉冲次数2次。转染后第2天，收集一部分细胞用于早期时间点的Mut:WT’分析。剩余的细胞分为未处理组和用20 ng/mL的MMC处理的组。每3天更换一次培养基，在细胞达到汇合度之前进行传代。转染后第12天收集细胞用于后期时间点的Mut:WT’分析。

从CRISPR编辑的细胞群体中提取基因组DNA，使用QuickExtract（Lucigen，QE09050）完成。PCR扩增时使用100 ng的基因组DNA作为模板。设计 primers RAD54B-FWD和RAD54B-REV来扩增目标位点，生成的PCR产物长度为140个碱基对，引物设计包含用于后续测序的接头序列（来自primer3网站：https://primer3.ut.ee/）。PCR扩增后，使用含有样本特异性条形码的引物以及用于NGS的接头进行第二次PCR。所有PCR反应都使用Phusion Plus PCR Master Mixes（F632S，ThermoFisher）进行。使用MiSeq Reagent Kit v2（Illumina，MS-102-2002）制备扩增子文库，并在MiSeq仪器（Illumina，SY-410-1003）中进行测序，最终文库中的扩增子浓度为20% PhiX。NGS数据使用CRISPResso2在线工具（https://crispresso.pinellolab.org/submission）和默认设置进行分析。

统计分析使用GraphPad Prism 10软件完成。数据以平均值±标准差（SD）表示，除非另有说明，否则数据来自三个独立的生物学重复实验（n = 3）。两组之间的差异显著性使用非配对双尾t检验进行评估，假设数据符合高斯分布（使用参数检验），并假设两个群体的标准差相同。置信区间为95%，p值<0.05被视为统计学上显著。

补充信息（2）
- 下载所有文件：PDF（17.85 MB）：文档S1（图S1–S7和表S1–S4）；PDF（55.15 MB）：文档S2（文章及补充信息）