神经接口指导第4层电路的重建，该重建使用了移植的人脑类器官，并改善了视觉引导的行为

《Cell Stem Cell》：Neural interface instructs layer 4-appropriate circuit reconstruction with engrafted human brain organoids and improves visually guided behavior

亮点：
- 靶向窄带伽马（NBG）神经调节指导hBO移植在受损的V1区域的整合
- 移植物获得了适合L4层的分子和功能特性
- 移植的神经元表现出方向选择性和与宿主外侧膝状核（LGN）节律的相位锁定
- 靶向刺激提高了视觉敏锐度和对比敏感度

摘要：
在皮质损伤后修复精确的神经微回路仍然是一个关键挑战。人类脑类器官（hBOs）是一个有前途的细胞来源，但组织混乱的整合限制了其治疗潜力。在这里，我们证明了由内源性窄带伽马（NBG）节律引导的靶向神经调节能够指导hBO移植在受损成年小鼠视觉皮层中的结构和功能整合。通过使用神经接口系统，我们促进了移植体与宿主的总体耦合，然后向特定的功能集群传递NBG节律刺激。这种策略引导移植体获得了适合L4层的分子和功能特性，实现了与宿主视觉回路的双向连接，并支持了高级视觉处理的发展，包括hBO神经元中的方向选择性。电生理学上，移植体的放电相位与宿主NBG振荡同步。行为学上，宿主的视觉敏锐度和对比敏感度得到了显著恢复。我们的工作为电路级修复建立了一个框架，突显了一种超越单纯细胞替换的协同策略，用于指导神经移植体的组装。

图形摘要

引言：
大脑皮层的损伤，如中风或创伤，通常会导致不可逆的损害和严重的神经功能缺陷。修复的核心挑战在于重建那些能够实现复杂信息处理的特定微回路。人类脑类器官（hBOs）可以在体外再现大脑发育的部分过程，并已成为一种有前途的修复细胞来源。然而，一个主要障碍仍然存在：移植体普遍缺乏结构组织性和精确的突触匹配，这常常阻碍了功能整合和行为相关输出的实现。虽然初步研究表明hBOs可以在宿主体内存活、分化和延伸投射，但移植体在多大程度上能够被引导以建立特定的、功能相关的神经回路仍很大程度上尚未探索。最近的进展证实，hBOs具有显著的整合能力，包括参与行为相关的回路和受损皮层内的功能修复。这些发现表明，局部宿主环境为移植体整合提供了关键线索。然而，一个关键问题仍然存在：我们能否主动指导移植体超越被动整合，获得明确的皮层特征并处理复杂信息？

初级视觉皮层（V1）的发育过程涉及神经发生、神经元迁移以及经历驱动的功能精细化，特别是在出生后关键时期的丘脑输入。这些特定的回路输入塑造了专门用于视觉感知的L4层神经元的独特特性，使它们与其他皮层区域区分开来。在V1中，L4层是视觉输入的主要门户，接收来自外侧膝状核（LGN）的直接丘脑皮层投射。L4层的发育和专业化在这个窗口期间至关重要，这一过程受到丘脑驱动模式的影响，这种模式导致了特征选择性反应（如方向选择性DS）的出现。这一过程基于LGN和V1-L4之间高度特异性的连接，而单眼剥夺会破坏这种精细化的过程。鉴于丘脑皮层输入在指导L4层成熟中的基础作用，我们探讨了模仿这种驱动模式的神经调节策略是否能够促进hBOs的定向整合。值得注意的是，这种丘脑皮层对话是通过窄带伽马（NBG，约60 Hz）振荡来介导的。NBG具有典型的频率，在L4层最为明显，并且可以在视网膜丘脑通路中检测到。这种节律能够使L4层的多单位活动相位锁定，并与丘脑节律精确同步，从而增强拓扑组织的连接。在皮质抑制后NBG在LGN中的持续存在，以及在LGN沉默时在L4层中的减少，证实了其丘脑起源。因此，NBG构成了一个专门的前馈通道，使其成为引导hBO移植体获得L4层适当身份和功能的有效工具。

基于输入的脑-计算机接口（BCI）技术代表了通过桥接受损回路并实现精确靶向神经调节来促进神经损伤后功能恢复的有前途的前沿。在基础研究基础上，进一步证明了皮层内刺激可以增强移植hBOs在体感皮层中的成熟和整合，关键的下一个步骤是实现超越一般成熟的特定电路功能修复。NBG在V1的L4层最为明显，并且已知可以指导特征选择性回路的成熟，为我们靶向神经调节策略提供了精确的内源性生理模板。因此，我们假设通过传递更复杂的、与内在发育节律相一致的刺激模式，可以引导hBO移植体超越被动整合，朝着具有L4层适当特性的功能性神经回路的主动重建迈进。在本研究中，我们使用“L4层适当”一词来表示获得L4层的典型特征，包括分子和功能特征，而不仅仅是物理层次的重建。在这里，我们提出了一种神经调节策略，该策略基于丘脑皮层发育的生理原理设计，旨在主动指导hBO移植体在视觉皮层损伤模型中的整合。我们证明了靶向NBG神经调节不仅促进了移植体内神经元之间的稳健突触发育和具有L4层适当分子和功能特性的神经元 speciation，还驱动了复杂特征选择性视觉反应（尤其是方向选择性DS）的出现，并在行为评估中显著改善了视觉功能。在这些变化的基础上，我们提供了移植体与宿主之间增强相互连接性和神经元与内源性节律相位锁定的证据。总体而言，我们的工作建立了一个皮层修复的范式，从被动细胞替换转向精确指导的功能性神经回路重建。

结果：
- 功能性神经接口为hBO移植在V1中的调节建立了关键时期
- 根据已建立的生成皮层类器官的协议，我们将绿色荧光蛋白-H9（GFP-H9）细胞成功分化为具有背侧前脑身份的人类脑类器官（图S1A和S1B）。到分化第40天时，类器官显示出了发育中神经上皮的特征性玫瑰花结结构。免疫染色确认了包含增殖前体（KI67+）、背侧前脑前体（PAX6+）、VZ细胞（SOX2+）、中间前体（TBR2+）和前脑特异性细胞（FOXG1+）以及分化神经元（TUJ1+/MAP2+/NeuN+）的室管膜样区域（VZ）（图S1C–S1I）。经过75-100天的持续培养后，类器官发展出类似皮层的结构，并进一步成熟，表达第六层（T-box脑转录因子1，TBR1）、第五层（COUP-TF相互作用蛋白2，CTIP2）和第二/第三层（特殊AT丰富序列结合蛋白2，SATB2）神经元，以及兴奋性谷氨酸能神经元（vGLUT1）和星形胶质细胞（GFAP）（图S1J–S1N）。
- 为了构建脑损伤模型，我们按照既定协议在宿主初级视觉皮层（V1）中创建了一个损伤空腔。这种吸入性损伤破坏了局部皮层回路，去除了视觉处理所需的神经基质。在损伤后1、2和3个月的组织学评估中可见明显的空腔和胶质疤痕，随着时间的推移空腔略有扩大（图S2A–S2F），证实了非再生性损伤环境的持续存在。
- 为了实现V1的电路级修复，我们在皮层损伤的小鼠模型中建立了一个神经接口系统（图1A）。我们将体外预培养40天的GFP+ hBOs移植到手术创建的V1损伤空腔中。这个时间点被指定为移植后第0天（0 dpt）（图1B和1C）。移植体内的成熟神经元和突触连接比例在30 dpt时相对较低，但在60 dpt时显著增加（图1D–1G、S3E和S3F）。120天的纵向监测显示移植体逐渐成熟，表现为宿主来源的血管化和神经元分化的增强，在90 dpt后达到平台期（图S3A–S3D）。为了验证类器官与宿主皮层之间的突触连接，在60 dpt进行了人类特异性突触连接蛋白（hSYN）、SYN和突触后密度（PSD95）的免疫荧光染色。结果表明，在移植体中心和边界都形成了人类特异性的突触前颗粒，以及在远端移植区域通过hSYN/PSD95共定位证实了成熟的突触（图S3I和S3J）。值得注意的是，类器官内的星形胶质细胞发育速度比神经元成熟慢（图S3G和S3H）。在移植体中未检测到PV阳性的神经元（图S3K和S3L）。此外，我们的结果显示在4个月的时间里移植组织中没有肿瘤形成，且OCT4呈阴性（图S4A和S4B）。这些发现表明60 dpt是一个适合进行指导性神经调节的时间窗口。

图1 在体内建立了功能性神经接口
- （A）示意图说明了实验设计。
- （B）hBO植入受损V1空腔的示意图。
- （C）移植后第60天（60 dpt），使用紫外线照明来评估hBO的整合情况，血管化区域用虚线标出。
- （D和E）不同时间点的SOX2+的荧光图像（D）和量化（E）。
- （F和G）不同时间点的NeuN+的荧光图像（F）和量化（G）。
- （H）体内神经接口的示意图。
- （I）移植后150天的神经接口概览。黄色虚线标记了电极轨迹。移植的类器官显示为绿色。（I-a）150天时的微胶质细胞（红色）和移植体（绿色）的免疫染色。
- （J）150天时，稳态微胶质细胞用P2RY12标记（上），激活的微胶质细胞用iNOS标记（下）。
- （K）150天时电极轨迹周围的星形胶质细胞（GFAP）标记。
- （L）hBOs的栅格图。红线对应所有通道的群体放电率。
- （M）hBOs内的LFP连接性热图。

所有数据均表示为平均值±标准差；n = 6幅图像/3只小鼠（在D和F中）；***p < 0.01。比例尺：C中的3 mm，B中的1 mm，I、Ia和K中的200 μm，D和F中的25 μm，J中的10 μm。另见图S1–S4。
- 在60 dpt进行了第二次开颅手术，将灵活的双柄电极植入hBO移植体或宿主LGN中进行记录和刺激（图1H）。在150天时的组织学评估确认了植入物的生物相容性，没有显著的星形胶质细胞（GFAP+）或微胶质细胞（Iba1+）异常积聚，电极轨迹周围主要是稳态微胶质细胞（P2RY12+/iNOS-）（图1I–1K）。整个时期的电生理记录显示了持续的神经活动，表现为强劲的放电活动（图1J）和保存良好的局部场电位（LFP）信号（图1K），支持了类器官-电极接口的长期功能稳定性。

非靶向神经调节促进了hBOs的神经成熟并诱导了窄带伽马振荡
- 为了为后续的特定电路指导奠定基础，我们在65 dpt时进行了初始阶段的电刺激，旨在促进神经成熟和增强移植体与宿主的连接（图2A）。这种非靶向刺激均匀地施加在hBOs的整个深度上的五个位置，以确保全面覆盖。电刺激与视觉刺激结合使用，以促进脑类器官与视觉神经回路的整合。具体来说，视觉刺激遵循5秒开启、5秒关闭的节奏，电刺激也采用相同的时序模式。这种配对刺激模式旨在促进移植体内NBG振荡的出现，从而创建出可作为后续节律刺激目标的可识别功能集群。在8天的刺激后，记录并分析了第73天hBOs的电生理学特征，结果显示放电率和爆发事件显著增加（图2B和2C），尽管放电幅度没有统计学上的显著变化（图2D）。在刺激期间，移植体的放电率持续增加，证实电刺激加速了hBOs的功能发展（图2E）。我们进一步使用皮尔逊相关系数（Pearson’s correlation）评估了网络连接性，结果发现hBOs内部以及hBOs与宿主之间的网络同步性得到了增强（图2F–2I）。图2显示，神经调节促进了hBOs的功能发展，并引发了窄带伽马振荡。

神经调节促进了hBOs的功能发展，并引发了窄带伽马振荡。

图2 神经调节促进了hBOs的功能发展，并引发了窄带伽马振荡

图观众：
(A) 70 Hz频率刺激的示意图，刺激部位均匀分布。
(B–D) 8天70 Hz刺激前后，(B) 发射率、(C) 每分钟突发次数以及(D) 振幅的量化结果。
(E) 植入的hBOs在刺激期间的发射率明显升高，并且持续增加，与未刺激时相比。
(F) 控制组和刺激组中hBOs内部LFP连接的热图。
(G) 控制组和刺激组中hBOs内部LFP连接的量化结果。
(H) 控制组和刺激组中hBOs与宿主之间LFP连接的热图。
(I) 控制组和刺激组中hBOs与宿主之间LFP连接的量化结果。
(J) 刺激期间通道内发射率的热图。
(K) 8天70 Hz刺激后，窄带伽马功率的归一化气泡图（上）和曲线图（下）。
(L) 刺激后，第1通道到第8通道、第9通道到第16通道、第17通道到第24通道以及第25通道到第32通道之间窄带伽马功率的量化结果。
(M) 面向宿主的视觉刺激示意图。
(N) 8天刺激后，栅格段和空白段中hBOs窄带伽马功率的归一化量化结果。

所有数据均以平均值±标准差表示；(B)–(E)、(G)、(I)、(N)和(O)组中的n = 5只小鼠；?p < 0.05，??p < 0.01。另见图S5。

为了研究对刺激的空间反应，我们分析了8天内hBO区域内的发射率热图。该分析显示，电生理活动呈现均匀的上调（图2J）。在整个刺激期间对窄带伽马功率的跟踪表明，这种活动模式逐渐巩固，始终集中在hBOs的中间到深层区域（图2K、2L和S5A）。我们还通过向睁眼的麻醉宿主展示简单的开-关闪烁刺激来评估hBOs对视觉刺激的响应性（图2M）。LGN在栅格段期间的窄带伽马功率显著升高，证实了有效的视觉信号传递（图S5B和S5C）。重要的是，hBOs在栅格刺激期间也显示出窄带伽马功率的增加，表明它们在视觉通路中的功能发展（图2N）。此外，这种刺激增强了栅格状态和空白状态之间窄带伽马功率的差异，支持其在增强移植电路基本视觉辨别中的作用（图2O）。这种增强的响应性为识别后续节奏刺激的目标——空间限定的NBG活跃簇提供了基础。

有针对性的神经调节促进了hBOs与宿主视觉系统的功能整合
在最初的非靶向均匀刺激（70 Hz，刺激部位均匀分布）阶段之后，我们成功诱导出了hBOs内部表现出强烈窄带伽马振荡的空间限定区域，这些区域成为后续刺激阶段的精确目标（图3A）。在第二阶段（初始阶段之后2周），目标组接受了专门针对形成最大NBG功率簇的五个相邻通道的60 Hz NBG-节奏性刺激，目的是加强局部NBG活动。相比之下，非目标组继续接受与第一阶段相同的非靶向、均匀的70 Hz刺激（50 μA，200 μs脉冲宽度）。为了进一步验证这种方法的特异性，我们增加了三个额外的对照组：随机刺激组（60 Hz平均频率，NBG高频区域的随机间隔）、非NBG节奏组（20 Hz，NBG高频区域）和非NBG区域组（60 Hz，NBG低频区域）。功率谱分析表明，有针对性的神经调节显著增强了NBG功率（图3B和S6A），这种效应在所有三个对照组中均不存在，证实了观察到效应需要NBG频率和NBG高频区域的空间定位（图3C）。此外，相位锁定值（PLVs）在有针对性的神经调节后显著增加，表明hBO发射活动与窄带伽马节奏之间的相位耦合得到加强（图3D–3G和S6B–S6D）。空间分析显示，刺激后的相位锁定集中在预先识别的窄带伽马区域内（图3H）。定量比较证实，刺激区域的PLVs显著高于同一移植体内的其他区域，这种效应在目标刺激组中最为明显（图3I和3J）。

图3 有针对性的神经调节增强了hBOs与宿主视觉系统的功能连接

图观众：
(A) 8天60 Hz频率、针对性区域的刺激示意图。
(B) 8天针对性刺激前后窄带伽马功率的归一化量化结果。
(C) 刺激后，无刺激组、非目标组、随机组、非NBG节奏组、非NBG区域组和目标组中窄带伽马功率变化的量化结果。
(D) 刺激期间，单个电极测量的窄带伽马相位与脉冲列之间的耦合示意图。
(E) 有针对性刺激前后窄带伽马相位的圆形分布图。
(F) 刺激前后各组中窄带伽马相位锁定的量化结果。
(G) 刺激前后通道中PLVs的量化结果。
(H) 8天刺激后，刺激区域周围和其他区域中PLVs的量化结果。
(I) 刺激区域周围和其他区域之间PLVs的量化结果。
(J) 所有组中刺激区域周围和其他区域之间PLVs差异的量化结果。
(K) 有针对性刺激前后hBOs与LGN之间窄带伽马相位差的量化结果。
(L) 8天针对性刺激期间hBOs与LGN之间窄带伽马相位差的量化结果。
(M) 所有组中相位差变化的量化结果。
(N) 刺激区域周围和其他区域之间相位差的量化结果。Rhy表示节奏性；reg表示区域。

所有数据均以平均值±标准差表示；(B)、(C)、(E)、(F)、(I)、(J)和(L)–(O)组中的n = 5只小鼠；?p < 0.05，??p < 0.01，???p < 0.001。另见图S6。

鉴于窄带伽马振荡在介导LGN-L4通信中的作用，我们询问是否可以在宿主LGN和具有L4适当特性的移植体集合之间检测到类似的精确同步性。为了测试这一点，我们评估了LGN与hBOs之间窄带伽马的相位同步性，作为与视觉电路功能整合的指标（图3K）。与脉冲相位耦合的结果一致，有针对性的神经调节减少了LGN-hBO窄带伽马相位差并增强了区域间的同步性（图3L和3M）。空间分析进一步证明了刺激区域内更强的相位对齐，并证实了有针对性的神经调节优于其他组（图3N和3O），突显了其在将具有L4适当特性的hBO衍生集合与视觉电路功能耦合方面的有效性。

有针对性的神经调节促进了更高级的视觉处理和行为恢复
为了评估电路整合的程度，我们测试了植入的类器官是否能够区分不同方向的移动光栅，这是成熟皮层电路中出现的复杂视觉计算能力。我们在目标刺激组中向宿主小鼠展示了八个方向移动的光栅，同时记录了120 dpt处hBOs的神经活动（图4A）。量化了大脑类器官对不同方向视觉刺激的单一通道发射率（图4B）。此外，我们分析了这些刺激方向上的窄带伽马功率、PLVs和相位差的分布，揭示了多样的响应特性（图4C–4E）。无刺激组和非目标组的相关数据见图S7A–S7F。为了确定这种现象是否与视觉输入有关，我们在目标组中遮挡了光栅视觉刺激，同时记录了电生理数据。结果显示，与正常视觉刺激条件相比，当视觉输入被遮挡时，具有方向选择性的单元百分比和平均方向选择性指数（DSI）值显著降低（图S7H和S7I）。为了量化DS，我们分析了单个神经元的调谐特性。这种分析表明，有针对性的神经调节显著增加了具有方向选择性的单元比例和DSI值，定量显示了增强的方向辨别能力（图4F和4G）。此外，在这些具有方向选择性的单元中，大多数单元表现出单一的偏好方向，而一小部分单元表现出更复杂的调谐特性（图4H和S7J）。

图4 有针对性的神经调节促进了更高级的视觉处理和行为恢复

图观众：
(A) 8天60 Hz方向性光栅刺激期间记录的通道栅格图。红线对应所有通道的群体发射率。
(B–E) 目标组在8方向性光栅刺激期间，(B) 发射率、(C) 归一化窄带伽马功率、(D) 相位锁定角以及(E) 单个通道的相位差的玫瑰图。
(F) 无刺激组、非目标组、随机组、非NBG节奏组、非NBG区域组和目标组中具有方向偏好（定义为DSI > 0.33）的单元百分比的量化结果。
(G) 所有组中DSI值的量化结果。
(H) 所有组中具有0、1、2或3个方向偏好的单元百分比。
(I) D1S1和D4S4期间非目标组和目标组的代表性迁移轨迹（从每只小鼠的2次试验中选取，n = 6，D1S1、D1S4和D4S4分别为第1天的第1次和第4天的第4次会话）。
(J) 空间频率阈值的量化结果（n = 6）。
(K) 对比敏感度阈值的量化结果（n = 6）。Rhy表示节奏性；reg表示区域。

所有数据均以平均值±标准差表示；(G)中的n = 5只小鼠，(I)–(K)中的n = 6只小鼠；?p < 0.05，??p < 0.01，???p < 0.001。另见图S7。

使用移植后5个月的视觉水面迷宫任务评估了视觉功能。在4天的训练期间，所有小鼠在第2天都达到了70%的正确选择标准，证实了任务的成功掌握（图S7K）。损伤组的正确率显著低于假手术组，而目标组的性能相对于损伤组、无刺激组和非目标组有所改善。游泳轨迹分析进一步显示，目标组小鼠比非目标组小鼠以更高的空间精度导航到平台（图4I）。视觉敏锐度评估显示V1损伤后存在显著缺陷。虽然非目标组相比无刺激组没有显著改善，但目标组的视觉敏锐度显著优于两个对照组（图4J）。对比敏感度测量结果也显示，只有目标组相对于无刺激组和非目标组有显著恢复（图4K）。总体而言，这些发现表明，有针对性的NBG神经调节促进了皮层损伤后视觉引导行为的功能恢复，而非非目标性的NBG神经调节则没有这种效果。

有针对性的神经调节加速了hBO移植中的突触形成和神经递质信号传递
为了阐明有针对性的神经调节促进hBOs功能整合的机制，我们在150 dpt时对移植体进行了免疫荧光染色（图5A）。我们首先进行了组织和行为分析，以评估类器官移植和神经接口系统的生物安全性。在移植体中没有检测到OCT4+多能细胞的证据（图S8A）。开放场测试数据分析表明，接受类器官移植和神经调节的动物表现出与Naive组相似的运动轨迹和总行程距离，表明运动功能未受损（图S8B和S8C）。对关键突触标记物（包括hSYN、PSD95、vGLUT1、GAD65/67和VAChT）的免疫荧光分析表明，有针对性的神经调节显著增强了突触结构和连接性。这通过hSYN+/PSD95+突触结节的显著增加得到证实，表明移植体-宿主突触整合有效（图5D、5E和S9A–S9D）。一致地，目标刺激区域内的突触数量显著多于非刺激区域，表明目标刺激特异性地促进了移植体内的局部突触发展（图S9G和S9H）。此外，hBO移植体表现出与神经递质相关的蛋白质（vGLUT1、GAD65/67和VAChT）的表达增加，表明突触可塑性的广泛增强（图5B–5G、S9E和S9F）。树突棘密度的显著增加进一步证实了移植网络向更复杂和成熟状态的进展（图5H和5I）。这些结果共同表明，靶向神经调节创造了一个有利于突触重塑和电路精炼的微环境，为高级视觉功能奠定了结构基础。图5 目标神经调节加速了hBOs中神经递质突触的发展。显示完整标题 图片查看器 (A) 该示意图展示了移植体-宿主神经递质突触结构。(B和C) 每组中vGLUT1+的荧光图像(B)和定量分析(C)。(D和E) 每组中hSYN+的代表性荧光图像(D)和定量分析(E)。(F和G) 每组中GAD65/67+的荧光图像(F)和定量分析(G)。在目标组中，图像是在目标刺激区域附近拍摄的。(H和I) 每组中树突棘的荧光图像(H)和定量分析(I)。所有数据均以平均值±标准差表示；n = 6幅图像/3只小鼠在(B)–(H)；*p < 0.05和***p < 0.01。刻度尺：(B)、(D)、(F)和(H)中的10 μm，(D和H)的高倍放大图中的5 μm。另见图S8和S9。

靶向神经调节增强了从移植体到视觉系统的传出投射。hBO移植体与宿主大脑之间的功能整合依赖于移植体器官与宿主电路之间的连接。因此，为了确定靶向神经调节后hBOs整合到视觉电路的解剖学证据，我们检查了从移植体到宿主大脑的传出投射的程度和目标定位（图6A和6B）。我们首先验证了投射特性。与STEM121（人类细胞质标记物）和doublescortin（DCX）的共定位确认了人类来源的投射（图S10A）。与GFP和SMI312（全轴突神经丝标记物）的共标记以及MAP2的缺失证实这些投射具有轴突性质（图S10B）。我们注意到，在靶向神经调节后，由于大量投射进入宿主大脑，hBO移植体的边界变得模糊（图6Ca和6Cb）。大多数投射位于移植体位置附近，而一些投射出现在胼胝体和对侧大脑皮层（图6C）。我们还在海马区检测到了传出纤维。投射被识别为与视觉电路相关的丘脑核，特别是外侧膝状体（LGN）和外侧后丘（LP）（图6C）。定量分析显示，靶向神经调节显著增强了到邻近区域和宿主大脑远距离目标的投射（图6D、S10C和S10D）。这些传出投射已被验证为人源（图S11A和11B）。此外，我们使用荧光显微光学切片断层扫描（fMOST）成像来可视化来自靶向神经调节样本的全脑投射（图6E）。结果表明，hBOs向LGN和LP扩展了密集的轴突投射（图6F和6G）。此外，在运动和前额叶皮层中也观察到了大量的轴突支配（图6F和S10E）。这些发现表明，hBOs已成功整合到高级视觉运动处理中。总体而言，上述结果证实了靶向神经调节增强了hBOs在视觉系统的电路级整合。

靶向神经调节增强了hBOs的传出投射。显示完整标题 图片查看器 (A) 该示意图通过显示不同冠状层面的切片来说明投射的大致位置，时间为150天。(B) 荧光图像显示了移植体在不同冠状层面的投射分布。(C) 改良体和宿主大脑皮层、胼胝体、海马体、外侧膝状体和LP的高倍和低倍视图显示了高密度的GFP+投射。(D) 在150天时不同大脑区域中GFP+投射分布的定量分析.(E) fMOST成像的示意图.(F) 从hBOs重建的全脑投射的正面（左侧）和背面（右侧）视图。浅蓝色表示移植体，深蓝色代表LGN，粉色表示LP，紫色线条表示一般投射，黄色线条突出显示了针对视觉电路的投射。(G) 宿主LGN中hBOs移植体投射的局部放大视图.(H) 该示意图说明了用于逆行追踪分析器官移植体传入端的CTB系统.(I) 移植体中心及其邻近皮层中CTB的表达。(a)–(d) 显示了框内区域的放大视图.(J) 宿主LGN中CTB的表达。(a) 和 (b) 显示了圈出区域的放大视图.(K) 该示意图说明了用于逆向跨突触追踪分析器官移植体传入端的HSV系统.(L) 在LGN注射部位HSV表达的低倍和高倍(a)视图.(M) 器官移植体的高倍视图显示了与HSV共定位的GFP+细胞的高密度。(a)–(c) 显示了圈出区域的放大视图。所有数据均以平均值±标准差表示；n = 6幅图像/3只小鼠在(C)、(I)、(J)、(L)和(M)；***p < 0.01。刻度尺：(B)中的1.5 mm，(C-left)中的500 μm，(G)和(L)中的100 μm，(Ca)、(Cb)和(I-left)中的50 μm，以及(Ia–Id)、(J)和(M)中的10 μm。另见图S10和S11。

靶向神经调节增强了hBOs与宿主视觉电路之间的功能连接。hBO移植体的功能整合不仅需要传出投射，还需要适当的传入输入来携带视觉信息。为了在解剖学上绘制这些连接，我们在150天时采用了多种病毒和示踪策略。使用霍乱毒素B亚单位（CTB）的逆行追踪揭示了来自移植体附近皮层区域的最密集的传入输入（图S10F），以及来自同侧LGN的额外输入（图6H–6J）。这些结果证明了hBO移植体与宿主视觉网络之间的功能整合。为了具体评估来自上游视觉核的跨突触连接，我们将单纯疱疹病毒（HSV）和腺相关病毒（AAV）注射到LGN。注射后，在移植体内很容易检测到tdTomato+神经元（图6K–6M、S10G和S10H），这证实了LGN的输出与移植体神经元发生突触连接。定量分析显示，目标组中hBO移植体与宿主视觉通路之间的双向连接显著增强。逆行追踪显示LGN中GFP+/CTB+的共标记增加，而顺行跨突触追踪显示移植体内的HSV+神经元数量显著增加，与非刺激组和非目标组相比（图S10I–S10L）。这些结果为hBO移植体整合到宿主视觉通路提供了决定性的解剖学证据。

靶向神经调节丰富了hBO移植体中适合L4阶段的功能神经元。为了研究靶向神经调节是否可以驱动特定身份特征的获取，我们在150天时对移植体进行了单核RNA测序（snRNA-seq）（图7A）。经过严格的质量控制（图S12A–S12D）后，我们识别出了所有主要的皮层细胞类型，包括循环祖细胞、放射状胶质细胞（RGC）、少突胶质细胞前体细胞（OPCs）、星形胶质细胞、上层谷氨酸能神经元（GluN-UL）、N端EF-hand钙结合蛋白1（NECAB1）神经元（GluN-NECAB1）和Reelin（RELN）谱系细胞（图7B和S12E）。比较分析显示，目标组中NECAB1+谷氨酸能神经元显著增加，这是L4阶段身份的分子标志，同时SATB2+ L2/3神经元也有所增加，而CTIP2+ L5神经元则保持稀少，这表明靶向神经调节促进了上层（L2/3和L4）而不是深层细胞类型的形成（图7C、7D和S12H–S12J）。GluN-NECAB1簇的基因本体（GO）分析显示，涉及视觉感知和神经递质传输的基因显著富集，而GluN-UL簇则富集了参与突触组织的基因（图7E）。伪时间轨迹分析将循环祖细胞、RGC和NECAB1+神经元按顺序排列在发育过程中（图7F、S12F和S12G）。

在这些发现中，我们通过组织学验证了L4（NECAB1）、L2/3（SATB2）和L5（CTIP2）标记物在移植组织中的表达。尽管移植体内没有完全恢复层状结构，但具有L4阶段特征的NECAB1+神经元仍然可以清晰识别（图7Ga–7Gc），并且其数量在靶向神经调节后显著增加（图7H和7I）。目标组中SATB2+ L2/3神经元也有所增加，而CTIP2+ L5神经元保持稀少且未发生变化（图S12K–S12N）。重要的是，从宿主LGN进行的顺行跨突触追踪显示，移植体内的NECAB1+神经元与HSV共标记，表明这些适合L4阶段的神经元已功能整合到宿主视觉电路中（图7J）。

在本文中，我们发现，与内源性NBG节律同步的靶向神经调节能够指导hBO移植体的结构和功能整合，从而在受伤的成年小鼠视觉皮层中实现特定电路的修复。通过利用移植体可塑性的关键时期并采用两阶段刺激方案，我们成功地将hBOs从被动整合引导到具有关键L4阶段功能和分子特性的神经微电路的主动重建，包括双向宿主连接和选择性视觉反应。重要的是，我们在整个研究中使用“适合L4阶段”这一表述，指的是移植神经元获得了这些分子和功能特性，而不是形成解剖学上的不同层结构。大量研究已经证实，hBOs在移植到宿主皮层后能够长期存活并逐步发展。这一成熟过程包括14天内快速的血管化、50天内神经元分化的加速以及到50天时成熟神经元数量的显著增加，这一进程通常在90天后趋于稳定。鉴于不同细胞类型对电刺激的反应不同，神经调节与特定发育窗口的精确时间对齐至关重要。虽然我们之前的工作已经证明30天时的电刺激可以增强增殖活性并促进早期移植体生长，但要实现完全的功能成熟和与宿主的深度电路整合则需要更长的时间。我们的纵向分析确定60至90天是神经元成熟和突触建立的关键窗口期，此时与宿主大脑的强功能性连接已经形成。因此，我们选择在60天时植入电极，以在神经可塑性增强的这一阶段进行积极干预。在不同时间点测试刺激将有助于确定最佳神经调节窗口。设计有效的刺激策略至关重要，需要探索最佳参数。虽然我们之前的工作建立了使用电刺激促进体感皮层移植体一般成熟的器官-大脑-计算机接口（OBCIs）平台，但现在我们将这一工具扩展到了指导电路级修复的系统。这一范式的转变是基于一个关键观察：特定移植体簇在视觉刺激下表现出强烈的相位一致的60 Hz NBG振荡。这些内源性NBG节律的出现至关重要，因为它标志着能够参与丘脑-皮层通信的神经元群的形成。由于NBG节律起源于视网膜或LGN并通过丘脑-皮层传入通路传播，并在V1-L4神经元中引发共振响应，因此它们代表了这一主要输入层的特征动态及其微电路精炼的先决条件。随机刺激和非NBG节律对照组中没有观察到类似的改善，这表明频率特异性是观察到的效果的关键决定因素。此外，与非NBG节律对照组相比，目标组的一致优异结果强调了在传递有效神经调节时空间精确性的重要性。因此，通过采用一种仿生学的两相刺激策略，与该节奏保持一致，我们主动引导突触的精细化和细胞的特化，将领域从被动细胞替代推进到定向电路重建。移植神经元中方向选择性（DS）的出现是指导性整合的一个关键基准，因为这一特征是成熟视觉计算的标志。开创性的研究表明，人类大脑类器官可以整合到受损的视觉皮层中，并自发地发展出方向选择性，为移植神经元能够采用宿主网络功能提供了基础证据。基于这些初步观察，我们探讨了是否可以主动引导这种功能整合，以实现更高的效率和特异性。电生理记录证实，在目标神经调节下，hBOs表现出与NBG振荡同步的强大尖峰。关键的是，我们观察到移植细胞的尖峰与宿主LGN中的内源性NBG节奏发生了相位同步，这直接证明了丘脑-皮层视觉处理的成功。这种跨区域的相位同步是L4适当神经群体功能成熟的明确标志。定量分析进一步显示，目标刺激显著增加了方向选择性单元的比例。值得注意的是，在这些选择性单元中，大多数表现出单一的首选方向，与经典的方向选择性神经元一致，而一小部分显示出更复杂的调谐特性。这些发现表明，移植网络发展出了比其他组更强大和全面的视觉运动信息表征，证明通过适当模式的神经调节可以增强功能结果。虽然之前的移植工作表明不成熟的神经元以非特异性方式采用宿主连接，而成熟的神经元依赖于内在程序，但我们的结果表明，目标神经调节通过促进具有L4适当输入输出特性的神经群体的出现，积极促进了hBOs的功能整合，有效地建立了一个功能性的“输入层”。总体而言，这些发现将范式从记录移植体能够做什么扩展到了展示如何主动塑造和增强它们的功能能力。这种指导性整合的行为相关性通过视觉水迷宫测试得到了进一步证实，其中目标刺激显著改善了视觉敏锐度和对比敏感度。这些结果表明，在神经元水平上实现的L4适当功能重建转化为可测量的视觉引导行为恢复，增强了我们方法的转化潜力。观察到的功能成熟得到了结构证据的支持。与已知的神经调节机制一致，我们的组织学分析证实，目标刺激加速了神经递质特异性突触的成熟。这些细胞变化可能构成了DS出现所观察到的增强的结构基础。解剖学上，我们发现移植体与视觉网络的关键组成部分建立了特定的连接。这一点通过长距离传出投射到定义的视觉目标的显著增加以及确认来自宿主LGN的传入输入的跨突触追踪得到了证明，表明了双向和解剖学上精确的互惠连接，这是参与视觉处理的基本前提。此外，节奏性的NBG刺激不仅增强了突触可塑性，还对细胞分化起到了指导作用，促进了具有独特L4适当分子身份的谷氨酸能神经亚群的形成。这一现象通过L4标记物NECAB1的聚集表达得到了验证。总体而言，我们开发了一个超出被动细胞替代的电路级皮质修复框架。通过将移植体可塑性的时间动态与内源性节奏的指导能力结合起来，我们证明了功能特定的神经调节可以主动引导hBOs获得L4适当的神经身份和功能，实现双向整合，并获得复杂的视觉功能，这一点通过方向选择性神经反应以及行为测试中改善的视觉敏锐度和对比敏感度得到了证明。这一策略为精确重建神经回路指明了一条路径，为开发复杂脑部疾病的治疗干预措施开辟了途径。

### 研究的局限性

我们的研究有几个局限性需要考虑。首先，虽然真空抽吸方法可靠地创建了破坏局部神经回路的皮质损伤，但该模型并没有完全再现临床状况（如创伤性脑损伤或中风）的复杂病理生理学。其次，我们的神经接口的空间分辨率受到所用电极密度的限制。未来使用高密度阵列的工作将能够提供移植体功能微观结构的更细致视图。最后，snRNA-seq的细胞产量受到从安全固定的神经接口硬件周围获取新鲜组织的技术挑战的限制，这是我们模型设计的一个固有限制。

### 资源可用性

有关进一步信息和资源的请求应向主要联系人Xiao-Hong Li ([e-mail]) 提出，她将予以满足。

### 材料可用性

本研究未生成新的独特试剂。

### 数据和代码可用性

单核基因表达数据可在基因表达库（GEO: GSE325024）下获取。支持本研究所有发现的所有数据均包含在文章及其补充信息文件中。如需重新分析本文报告的数据，可向主要联系人请求额外信息。

### 致谢

本工作得到了中国国家重点研发计划（2023YFF1204200）、国家自然科学基金重大项目（T2596044）以及国家自然科学基金（82571588、8256090247和62476197）的支持。

### 作者贡献

Z.-H.C.：方法学、研究、可视化、撰写——初稿；J.-X.S.：研究、可视化；C.C.：方法学、正式分析、监督；X.-G.Y.：软件、验证；P.-F.H.：数据管理、正式分析；J.-C.C.：资源、软件；Z.-H.Z.：资源、软件；N.H.：数据管理；J.H.：正式分析、验证；Q.Y.：验证；W.-W.S.：概念化；Y.-L.Z.：概念化；S.L.：项目管理；X.-H.L.：资金获取、项目管理。

### 利益声明

作者报告无竞争利益。

### 方法

### 关键资源表

| REAGENT 或 RESOURCES | SOURCE | IDENTIFIER |
|---------------|---------|-----------|
| 抗体 | AbcamCat#ab79351; RRID: AB_10710406 | |
| 抗体 | AbcamCat#ab97959; RRID: AB_2341193 | |
| 抗体 | AbcamCat#ab195045; RRID: AB_2750924 | |
| 抗体 | AbcamCat#ab16667; RRID: AB_302459 | |
| 抗体 | AbcamCat#ab207175; RRID: AB_2811258 | |
| 抗体 | AbcamCat#ab215037; RRID: AB_3712442 | |
| 抗体 | AbcamCat#ab183830; RRID: AB_2895301 | |
| 抗体 | Sigma-AldrichCat#m1406; RRID: AB_477171 | |
| 抗体 | AbcamCat#ab104224; RRID: AB_10711040 | |
| 抗体 | AbcamCat#ab177487; RRID: AB_2532109 | |
| 抗体 | AbcamCat#get18465; RRID: AB_2064130 | |
| 抗体 | AbcamCat#ab51502; RRID: AB_882455 | |
| 抗体 | AbcamCat#ab7260; RRID: AB_305808 | |
| 抗体 | InvitrogenCat#14-6525-82; RRID: AB_2573150 | |
| 抗体 | AbcamCat#get18258; RRID: AB_444362 | |
| 抗体 | Santa Cruz BiotechnologyCat#sc-7271, RRID: AB_627810 | |
| 抗体 | InvitrogenCat#702516; RRID: AB_2813759 | |
| 抗体 | AbcamCat#ab235201; RRID: AB_2857900 | |
| 抗体 | BioLegendCat#837904, RRID: AB_2566782 | |
| 抗体 | Takara BioCat#Y40410; RRID: AB_2801314 | |
| 抗体 | Sigma-AldrichCat#MAB1281, RRID: AB_94090 | |
| 抗体 | AbcamCat#ab28364; RRID: AB_726362 | |
| 抗体 | AbcamCat#ab178846; RRID: AB_2636859 | |
| 抗体 | AbcamCat#ab283319; RRID: AB_2924797 | |
| 抗体 | AbcamCat#ab183999; RRID: AB_2893526 | |
| 抗体 | Atlas AntibodiesCat#HPA023629; RRID: AB_1856035 | |
| 抗体 | AbcamCat#ab254349; RRID: AB_2920663 | |
| 抗体 | AbcamCat#ab216870, RRID: AB_2943124 | |
| 抗体 | AbcamCat#ab22035; RRID: AB_446723 | |
| 抗体 | AbcamCat#ab181557; RRID: AB_2687916 | |
| 抗体 | AbcamCat#ab181086; RRID: AB_2924658 | |
| 抗体 | AbcamCat#ab196868; RRID: AB_28926044 | |
| 抗体 | InvitrogenCat#A31627, RRID:AB_307386859 | |
| 抗体 | InvitrogenCat#A11005, RRID:AB_141372647 | |
| 抗体 | InvitrogenCat#A31634, RRID:AB_2535813647 | |
| 抗体 | InvitrogenCat#A-21247, RRID:AB_141778405 | |
| 抗体 | AbcamCat#ab175671, RRID:AB_2890626 | |

### 细菌和病毒株

HSV-td | TomatoBrainVTACat#H01002 |
| AAV-hSyn-mCherry-WPRE-hGH | BrainVTACat#PT-0100 |
| 霍乱毒素亚单位B（CTB），Alexa Fluor 555结合物 | InvitrogenCat#C34776 |

### 化学品、肽和重组蛋白

mTeSR? Plus | STEMCELL TechnologiesCat#100-0276 |
DMEM/F-12 | GibcoCat#C11330500 |
BT | CorningCat#354230 |
EDTA | NuwacellCat#RP01007 |
DPBS (1×) | GibcoCat#C14190500 |
BT | GibcoCat#11140-050 |
GlutaMAX?-I | GibcoCat#35050-061 |
SB431542 | AbcamCat#ab120163 |
XAV939 | Sigma-AldrichCat#X3004 |
LDN-193189 | Sigma-AldrichCat#SML-055 |
Accutase?细胞 detachment solution | STEMCELL TechnologiesCat#07920 |
Y-27632 | STEMCELL TechnologiesCat#7230 |
2-Mercaptoethanol (55 mM in DPBS, 1000×) | GibcoCat#21985-023 |
KnockOut?血清替代品 | GibcoCat#108280 |
Neurobasal?培养基 | GibcoCat#211030 |
B-27?补充剂 (50×) | GibcoCat#175040 |
B-27?补充剂 (50×)（不含维生素A） | GibcoCat#12587-010 |
N-2补充剂 (100×) | GibcoCat#175020 |
青霉素-链霉素 | GibcoCat#15140122 |
胰岛素溶液（人源） | Sigma-AldrichCat#I9278 |
CHIR99021 | STEMCELL TechnologiesCat#72054 |
正常山羊血清（即用型） | BOSTER Biological TechnologyCat#AR0009 |
甲醛（4% in PBS） | BiosharpCat#BL539 |
二甲基亚砜（DMSO） | Sigma-AldrichCat#D2650 |
SlowFade? Diamond抗褪色剂 | Thermo Fisher ScientificCat#S36972 |
O.C.T.化合物 | Sakura FinetekCat#4583 |
L-抗坏血酸 | Sigma-AldrichCat#A4403 |
Hoechst 33342 | InvitrogenCat#H3570 |
BDNFP | PeprotechCat#450-02-100 |
Triton X-100 | SolarbioCat#T8200 |

### 存储数据

GEO: GSE325024

### 实验模型

细胞系：H9 hESCs（WiCell协议编号24-W0484）

### 实验模型：生物体/品系

小鼠：NOD.CB17-Prkdcscid/NcrCrl (NOD-SCID)（Charles RiverCat#406）

### 软件和算法

Fiji | N/A
https://fiji.sc
Imaris | https://imaris.oxinst.com
Cell Ranger (v7.0) | N/A
https://www.10xgenomics.com/support/software/cell-ranger
Intan RHX | Intan Technologieshttps://www.intantech.com
GraphPad Prism | GraphPad Software
https://www.graphpad.com
MATLAB | MathWorkshttps://ww2.mathworks.cn

### 实验模型和研究参与者详情

细胞系：人类大脑类器官（hBOs）源自人类胚胎干细胞系（hESCs；WiCell协议编号24-W0484）。GFP-H9克隆是通过基因组操作建立的（H9-AAVS1-CAG-hrGFP）。克隆体在Matrigel涂层的6孔板（Corning，美国）上扩增，并使用mTeSR Plus培养基（StemCell Technologies，加拿大）以1:30的比例每4-5天传代一次，使用0.5 mM EDTA溶液（Nuwacell，中国）。细胞在37°C、5% CO2的湿润培养箱中维持，每天更换培养基。使用MycoAlert试剂盒（Lonza，瑞士）常规监测支原体污染，并确认为阴性。

### 动物

所有动物程序均得到了天津大学动物护理和使用委员会的批准（TIVE-2021-128）。免疫缺陷非肥胖糖尿病/严重联合免疫缺陷（NOD/SCID）雄性小鼠（5周大）从Charles River Laboratory Animal Technology（北京，中国）购买。小鼠被安置在无特定病原体的条件下，每个笼子中不超过5只，具有12小时的明暗周期、受控的温度（25°C）以及自由获取食物和水的条件。在整个实验期间，包括刺激阶段，小鼠都接受了正常的视觉输入。

小鼠被随机分配到九个实验组。其中，六组接受了hBO移植和电极植入：无刺激组（n = 12，无刺激）、非目标组（n = 18，两个阶段均为70 Hz均匀刺激）、随机组（n = 6，第一阶段为70 Hz，第二阶段在NBG高信号位点为60 Hz随机间隔）、非NBG Rhy组（rhythmic）（n = 6，第一阶段为70 Hz，第二阶段在NBG高信号位点为20 Hz）、非NBG Reg组（region）（n = 6，第一阶段为70 Hz，第二阶段在NBG低信号位点为60 Hz）和目标组（n = 19，第一阶段为70 Hz，第二阶段在NBG高信号位点为70 Hz NBG-rhythmic）。其余三组作为对照组：Na?ve组（未移植，n = 6）、Sham组（仅开颅手术，n = 6）和损伤组（仅真空抽吸，n = 6）。在实验期间，有三只在电极植入过程中死亡，另有三只由于信号质量差而被排除；植入后没有小鼠被安乐死。

### hBO的生成

根据先前建立的基于双重SMAD抑制的协议，生成了具有背侧前脑特性的hBOs。该协议能够有效将hESCs分化为具有背侧前脑特性的皮质类器官。为了类器官的分化，使用Accutase将hESCs的克隆体解离成单细胞，并转移到神经诱导培养基（NIM）（DMEM/F12培养基，15% [v/v] KSR，1% [v/v] GlutaMAX，1% [v/v] MEM-NEAA，100 μM β-mercaptoethanol，100 μM LDN-193189，10 μM SB-431542，2 μM XAV-939，50 μM Y27电极中心之间的距离为30 μm或25 μm。小鼠使用异氟烷（3%诱导剂量，1.5%维持剂量）在氧气中麻醉，并固定在立体定位框架中。打开头骨，利用紫外光确认类器官的位置。在立体显微镜的引导下进行电极植入。首先，将一根中心距离为30 μm的电极插入类器官中心1毫米深，然后将另一根中心距离为25 μm的电极精确放置在LGN（ ap ?2.5 mm，mL距离bregma 2.0 mm；DV 3.0 mm）处。为防止机械应力导致的神经损伤，插入后每100 μm的组织休息1分钟。柔性电极由一根记录电极（长1毫米）和一根较长的柔性基底（长3毫米）组成。电极插入类器官后，将剩余的柔性基底留在硬脑膜外，并用Matrigel封装。这种配置使电极能够随着类器官的生长而轻微移动，从而减少组织与设备接口处的错位和机械应力。用于参考和接地 的螺丝被植入小脑上方的头骨中，并用牙科粘合剂固定。

移植两个月后，向小鼠展示漂浮光栅视觉刺激。将小鼠固定在立体定位装置中，并将24英寸LED显示器（DELL，美国）放置在距离移植对侧眼睛20厘米的位置。视觉刺激模式包括11个重复周期（每个周期80秒）。在每个周期中，光栅以2赫兹的频率在8个方向（0°、45°、90°、135°、180°、225°、270°、315°）上顺序显示。每个方向显示5秒，然后是5秒的灰色屏幕间隔。对于遮蔽实验，小鼠在相同的麻醉条件下接受相同的光栅刺激，但在这两个屏幕之间放置了一个不透明的面板以防止视觉输入。

神经活动使用RHS Stim/Recording系统（Intan，美国）记录和刺激，采样率为30 kHz。视觉和电刺激遵循相同的时间模式，即5秒开启和5秒关闭，电刺激的开始时间比视觉刺激延迟50毫秒。在第一阶段，第65天应用了为期8天的刺激方案，参数为70 Hz、50 μA和200 μs的脉冲宽度，电极在电极上均匀分布有5个刺激位点。这个参数组合是基于我们之前的工作选择的，因为它能够促进移植物与宿主的连接。在每天的 ses 中，视觉刺激进行11个周期。在11个视觉刺激周期中，电刺激在第2至10个周期通过5个指定的刺激电极传递。第1和第11个周期不进行电刺激，用于记录刺激前后所有32个电极的神经活动。

对于每个脑类器官，根据它们的物理空间位置排列32个记录通道，并在第一次刺激后计算每个通道的NBG功率。然后应用滑动窗口方法，窗口大小为5个连续通道，步长为1，计算每个窗口内的平均NBG功率。选择平均NBG功率最高的窗口，并将其5个组成通道指定为第二阶段刺激的目标位点。在第一次刺激阶段后的两周休息期后，对五组（非目标组、随机刺激组、非NBG节律组和非NBG区域组、目标组）实施第二个为期8天的刺激阶段，每个组采用不同的方案。非目标组的刺激参数与第一次阶段相同，频率和位点选择没有变化。随机刺激组在随机间隔（0.01至1秒）内使用5个NBG高位点进行刺激，平均频率仍为60 Hz。非NBG节律组以20 Hz的频率进行刺激，该频率不在NBG带内，刺激部位与目标组相同。非NBG区域组则在NBG低区域接受聚焦刺激（60 Hz），而不是选定的NBG高位点。对于NBG低区域，我们选择了既不相邻也不包含前5个NBG功率通道的位置，并且这些位置距离选定的NBG高位点超过200 μm，以避免潜在的刺激扩散效应。目标组的刺激在5个NBG高位点进行，频率为60 Hz。所有组的第二阶段会话结构与第一次阶段相同，电刺激在第2至10个周期进行，而第1和第11个周期不进行电刺激，以记录神经活动。

在移植120天后，为了评估脑类器官的发育状态（DS），在记录神经活动的同时展示了一个视觉刺激周期，不施加电刺激。

在移植后5个月，使用开放场测试评估小鼠的运动能力。在测试前5天内，每天对小鼠进行5分钟的适应处理。测试期间，将每只小鼠放在 arena 的一个角落，并记录其运动轨迹以分析总行进距离。每次测试之间彻底清洁 arena。

视觉水迷宫测试用于评估视觉敏锐度和对比敏感性。该装置由一个梯形池组成，狭窄端有一个释放滑道，另一端有两个面对池的相同显示器。一个显示器显示正弦波光栅图案（0.12周期/度），另一个显示器显示均匀的灰色屏幕。隐藏的平台放置在光栅屏幕前，但不在灰色屏幕前。使用分隔板将两个游泳通道分开。

在训练阶段，小鼠在最佳条件下（100%对比度，0.12周期/度的空间频率）系统地学习从释放滑道游向显示器，并将正弦波光栅与隐藏的平台关联起来。小鼠每天接受4次训练，连续4天（D1S1和D4S4分别为第1天的第1次训练和第4天的第4次训练）。每次训练包括10次试验，在这些试验中，光栅在左侧或右侧显示器上以伪随机顺序显示（LRLLRLRRLR，其中L和R表示光栅在左侧或右侧显示器上显示）。如果小鼠游过选择线并找到平台，则试验计为“通过”；否则计为“失败”。正确试验的数量以百分比表示，当小鼠的正确选择率达到70%以上时，认为它们已经学会了任务。

对于视觉功能评估，使用了两种测试方案。在空间频率测试中，最初光栅的频率为0.12周期/度，每次小鼠通过后频率逐步增加0.06周期/度。当通过率降至70%以下时停止测试。对比敏感性的评估采用类似的方法。初始光栅对比度定义为在0.12周期/度的空间频率下为100%，然后逐步降低10%，直到通过率降至70%以下。

从移植后150天收集的快速冷冻hBO移植物中制备单核悬浮液。从液氮中取出移植物，放在干冰上，并使用立体显微镜进一步精细解剖。然后使用洗涤剂-机械细胞裂解方法破坏移植物。粗核通过40 μm过滤器过滤，离心，并通过蔗糖密度梯度离心纯化。纯化的核在含有RNase抑制剂的0.04% BSA/PBS中重新悬浮。每个样本大约加载18,000个核到Chromium Single Cell 3′ Chip（10× Genomics，美国）上，并使用v3试剂盒构建文库。使用Illumina NovaSeq 6000（10× Genomics，美国）对文库进行测序。

原始测序数据使用CellRanger软件套件（v7.0）处理，并与GRCh38-GRCm39双基因组对齐。计算每个细胞条形码的人类转录本比值（h-ratio）；h-ratio > 0.8的细胞归类为人类细胞，< 0.2的细胞归类为小鼠细胞，中间值归类为未知细胞。下游分析在Seurat（v4.1.1）中进行，使用筛选出nUMI > 500、nGenes > 500和线粒体百分比< 25%的人类来源细胞。根据典型标记对细胞簇进行注释：循环前体细胞（MKI67、TOP2A）、放射状胶质细胞（GLI3、TNC）、星形胶质细胞（GFAP、AQP4）、少突胶质细胞前体细胞（OLIG1、SOX10）、谷氨酸能神经元（SYT1、MAP2；GAD2阴性），以及由RELN、SATB2和CUX2（上层）、NECAB1（第4层）定义的亚类。使用Seurat和Cluster Profiler进行差异表达和富集分析。使用Monocle2（v2.18.0）进行伪时间轨迹推断。

类器官或脑组织的冰冻切片（厚度30 μm）用0.3% Triton X-100渗透，用10%山羊血清封闭，然后在4°C下过夜孵育与一级抗体（见关键资源表）。洗涤后，切片用Alexa Fluor结合的二级抗体（Invitrogen，美国）孵育2小时，用Hoechst 33342复染，再用ProLong Diamond Antifade Reagent（ThermoFisher，美国）封片。图像在Nikon A1HD25（Nikon，日本）共聚焦显微镜上获取，并在ImageJ（Fiji，美国）中分析。在多个图像系列中量化阳性细胞和突触点。通过计算GFP+区域相对于总视野的百分比来进行投影量化。

对于逆向追踪，在移植后5个月，在紫外光引导下将0.1 μL的CTB-555（Invitrogen，美国）注入hBO移植物中。15天后，用4% PFA灌注小鼠进行组织学处理。对于顺向追踪，在移植对侧的LGN注入单纯疱疹病毒（HSV-tdTomato，H01002，BrainVTA，中国）和腺相关病毒（rAAV-hSyn-mCherry-WPRE-hGH，PT0100，BrainVTA，中国）。HSV注射后7天和AAV注射后21天，灌注小鼠并处理大脑进行组织学分析。

小鼠通过心脏灌注PBS，然后注入4% PFA。大脑在乙醇系列中脱水，嵌入LR White树脂（Oebio，中国），并在48°C下聚合。使用荧光微光学切片成像系统（BioMapping 5000，Oebio，中国）和40×水浸物镜对嵌入样品进行成像。双通道（GFP/PI）数据集经过预处理以进行拼接和照明校正。使用Imaris软件（版本10.0，Oxford Instruments，美国）进行数据可视化，生成图像和视频。可视化过程包括在感兴趣区域提取数据、采样、重新切片图像和识别最大强度投影。通过人机交互，我们使用Imaris的Filament Editor模块对hBO中的长轴突进行3D追踪。

离线数据分析使用自定义的MATLAB脚本（MathWorks，美国）进行。通过去除50 Hz的电源线干扰并排除噪声幅度过大的通道来处理信号。数据输入Kilosort4进行自动峰峰排序。简要来说，该过程包括漂移校正、带通过滤和模板匹配。根据波形相似性自动聚类峰峰。对于刺激前后的比较，包括每个移植物的所有记录通道，因为这些比较是在不同实验组的全移植物级别进行的。对于同一移植物内的刺激区域与非刺激区域的比较，刺激区域定义为NBG高区域内的五个受刺激通道，而非刺激区域包括该区域外的其余通道。为了避免潜在的刺激扩散，要求非刺激通道至少距离NBG高区域200 μm。然后在每个区域内计算平均值。根据组织学验证的电极位置，排除所有位于移植物-宿主边界100 μm范围内的通道。

为了探索电活动的空间分布，将单个单元的峰峰恢复到原始通道。对于每个通道，我们量化了发射频率和平均峰峰幅度。通过定义脉冲序列中的最大脉冲间隔和最小脉冲数量来检测突发活动。对于局部场电位（LFP）分析，数据被重新采样至1000 Hz。特定频带内的频谱功率是通过傅里叶变换计算的，而时频分析则是使用小波变换实现的。在窄带伽马功率的计算中应用了归一化处理。为了分析窄带伽马振荡，我们应用拉普拉斯变换来提取其幅度和相位。通过计算每个通道在脉冲发生时的平均LFP相位来表征脉冲-LFP耦合。通过测量单个单元对不同方向的反应性来评估移植神经元向宿主视觉网络的整合情况。对于每个单元，计算了方向选择性指数（DSI）。为了分析方向调谐特性，使用单因素方差分析（one-way ANOVA）比较了每个分离单元在所有八个方向的放电率。放电率显著高于其他方向的方向（P < 0.05）被归类为优选方向。然后量化了每个实验组中每个单元的优选方向数量。

**量化和统计分析**
数据使用GraphPad Prism 8和MATLAB 2024b进行分析。多组比较通过单因素方差分析或包含Tukey多重比较的双因素方差分析（two-way ANOVA）进行，两组比较则使用配对双尾Student's t检验。使用Shapiro-Wilk检验来评估数据的正态性。对于非正态分布的数据，应用了非参数检验：两组比较使用Mann-Whitney U检验，多组比较则使用Kruskal-Wallis检验以及随后的Dunn事后检验。所有数据均以平均值±标准差（SD）的形式呈现。P值< 0.05被认为具有统计学意义。除非另有说明，实验至少包含三个独立的生物学重复。行为测试是盲法进行的。

**补充信息（2）**
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- PDF（72.04 MB）：文档S2。文章加上补充信息