《Infection and Drug Resistance》：Association of BALF Targeted Next-Generation Sequencing with Pathogen Identification and Antimicrobial Therapy Adjustment in Pulmonary Infections: A Retrospective Cohort Study
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目的 评价支气管肺泡灌洗液（BALF）靶向二代测序（tNGS）在肺部感染病原体鉴定中的应用及其与抗菌治疗调整和短期指标的关系。方法 本单中心回顾性队列研究纳入2023年1月至2026年3月期间接受BALF-tNGS的274例肺部感染住院患者。比较BALF-tN
目的 评价支气管肺泡灌洗液（BALF）靶向二代测序（tNGS）在肺部感染病原体鉴定中的应用及其与抗菌治疗调整和短期指标的关系。方法 本单中心回顾性队列研究纳入2023年1月至2026年3月期间接受BALF-tNGS的274例肺部感染住院患者。比较BALF-tNGS与同期常规微生物学检测（CMTs）在临床相关病原体检出方面的差异。根据tNGS报告后72小时内是否进行与结果一致的抗菌治疗调整对患者进行分组，并比较短期结局。采用配对分析评估病原体检出差异，采用多因素logistic回归探讨与报告后7天早期临床改善复合终点相关的因素。结果 BALF-tNGS在更高比例的患者中检出至少一种临床相关病原体[71.9%（197/274）vs 41.2%（113/274）；配对OR=8.636，95%CI：4.626–16.123，P<0.001]。报告后72小时内，108例（39.4%）发生一致性调整。一致性调整组早期临床改善复合终点发生率高于无一致性调整组（71.3% vs 57.8%，P=0.024），C反应蛋白/降钙素原下降≥50%的比例也更高。两组在机械通气强度增加、报告后住院时间或28天全因死亡率方面无显著差异。在探索性多因素分析中，一致性调整与早期临床改善复合终点相关（校正OR=4.120，95%CI：2.088–8.131，P<0.001）。然而，治疗调整并非随机分配，该关联不能确立因果关系。结论 BALF-tNGS与肺部感染中临床相关病原体的更高检出率及后续抗菌治疗调整相关。一致性调整与早期临床改善复合终点相关，但其对患者结局的独立作用尚需进一步验证。
下呼吸道感染仍是全球重大疾病负担，病原谱因医疗环境、宿主免疫状态及既往抗菌药物暴露而异。重症肺炎和免疫抑制患者中机会性病原体和混合感染更为常见，增加了病因学诊断的复杂性。早期可靠的微生物学证据有助于优化经验性治疗并实施病原体靶向方案，但相当比例患者在初始治疗期间仍缺乏明确病原学诊断。常规微生物学检测（CMTs）是肺部感染病因学诊断的基础，基于培养的方法及表型药敏试验对指导抗菌药物选择仍不可或缺。然而不同病原体常需分别进行培养、涂片、抗原或核酸检测，覆盖范围取决于临床怀疑方向，且结果可能受标本质量、病原体载量及既往抗菌治疗影响。支气管肺泡灌洗液（BALF）采自下呼吸道病变区域，可为复杂肺部感染的病因学评估和治疗调整提供有价值的信息。靶向二代测序（tNGS）富集预定义病原体靶序列，可在单次运行中并行鉴定多个微生物类别。既往研究显示tNGS可提高痰液或BALF中难培养病原体、非典型病原体及多微生物信号的检出率，周转时间相对较短。然而检测范围受预设靶标限制，阳性结果本身不能区分活动性感染、定植、残留核酸或污染，须结合临床数据和同期微生物学结果进行判读。现有研究已开始评估tNGS结果对抗菌药物管理的影响，但临床转化证据仍不完整。部分队列报告了tNGS报告后的抗菌方案变更，近期多中心研究提示tNGS与宏基因组二代测序（mNGS）对抗菌药物管理的影响可能不同。然而各研究在治疗调整定义、观察窗口及结果归因方面存在差异，且多数以病原体检出或诊断性能为主要终点。tNGS额外的临床相关病原体检出能否转化为相应的治疗变更，以及此类变更是否与短期临床结局相关，需在临床队列中系统评价。近期真实世界数据提示tNGS结果可能参与部分临床决策，但其对患者结局的独立贡献仍不确定。因此，本单中心回顾性队列研究比较BALF-tNGS与同期CMTs在患者水平上临床相关病原体的配对检出率，评估tNGS报告后72小时内抗菌治疗调整的类型及其与tNGS发现的一致性，并探讨一致性调整与短期临床指标的关系。研究方法方面，本研究为单中心回顾性队列研究，连续筛选2023年1月至2026年3月在本院住院并接受支气管镜检查的成年患者。纳入标准为：（1）年龄≥18岁；（2）确诊或疑似肺部感染；（3）成功采集BALF并完成tNGS；（4）BALF采样前后7天内至少完成一次CMTs；（5）微生物学结果、tNGS报告时间、抗菌治疗及主要结局数据记录完整。排除标准包括：最终诊断不支持肺部感染、BALF标本不合格或tNGS质控失败、tNGS用于非感染性肺病评估、无法确定相应感染发作或tNGS报告时间、关键数据缺失。以患者为分析单位，每位患者仅纳入研究期间首次符合条件的感染发作。BALF采集遵循本中心标准支气管镜方案，灌洗部位根据胸部影像学最明显异常选择。BALF-tNGS由苏州艾迪康临床检验实验室有限公司（中国苏州）作为呼吸道感染靶向病原体检测项目完成，检测设计为同时检测DNA和RNA病原体，核酸提取后RNA逆转录为cDNA，与DNA一起进行多重PCR靶向富集和文库制备，文库经Qubit荧光计（Thermo Fisher Scientific，美国）质控后在Illumina NextSeq系列高通量测序平台（Illumina，美国）测序。测序数据经实验室验证的生物信息学流程处理，检测面板包含198个预定义病原体靶标，涵盖细菌、真菌、病毒、分枝杆菌和非典型病原体。测序质控标准包括Q30≥75%、每样本至少50,000条原始reads及至少200条内参扩增reads。病原体鉴定基于靶特异性序列计数、归一化reads丰度、扩增子覆盖度及与阴性对照的比较。CMTs包括BALF培养、痰培养、血培养、涂片或镜检、抗酸染色、分枝杆菌培养或核酸检测、1,3-β-D-葡聚糖试验、半乳甘露聚糖试验、呼吸道病毒核酸检测及支原体、衣原体、军团菌检测，BALF采样前后7天内获得的CMT结果在患者水平整合。所有微生物均结合临床表现、影像学特征、基础疾病、免疫状态、采样前抗菌药物暴露、同期微生物学证据及病程进行评估以判断临床相关性。病原体相关性由两名具有感染性疾病经验的临床医生根据预设标准独立评估，评估时不使用治疗调整、治疗反应及后续结局信息，分歧通过讨论或第三方裁定解决。tNGS报告后72小时内的抗菌方案变更通过电子医嘱、给药记录、病程记录和会诊记录评估，调整类型包括升级或降级、抗菌谱修改、抗真菌优化、抗病毒启动、抗分枝杆菌调整、加用非典型病原体覆盖及停用部分药物。tNGS一致性调整定义为报告后72小时内发生的、与tNGS检出的临床相关病原体相对应的治疗变更，仅时间关联不足以确立一致性。数据从电子病历、实验室信息系统、影像数据库、医嘱及给药记录、感染科会诊记录和出院小结中提取。主要结局为BALF-tNGS与CMTs在患者水平上临床相关病原体配对检出率差异，按细菌、真菌、病毒、分枝杆菌、非典型病原体及临床相关混合感染分别比较。次要结局为tNGS报告后72小时内抗菌治疗调整情况。探索性临床结局包括：报告后7天内早期临床改善复合终点（呼吸支持减少、氧合改善或感染相关临床表现改善中至少一项，且无感染相关恶化、机械通气强度增加或死亡）、CRP和PCT较基线下降≥50%、7天内机械通气强度增加、报告后住院时间及28天全因死亡率。统计分析使用R软件4.5.2版，连续变量以均数±标准差或中位数（四分位距）表示，分类变量比较采用χ2或Fisher精确检验，临床相关性评估者间一致性采用Cohen's κ评估，配对检出率比较采用McNemar检验及配对OR和95%CI，预设类别比较的P值采用Holm法校正。以早期临床改善复合终点为因变量构建多因素logistic回归模型，纳入年龄、ICU入住、免疫抑制状态、白蛋白、PCT、混合感染及tNGS一致性调整。研究结果方面，共筛选332例患者，排除58例后274例纳入分析。根据tNGS报告后72小时内是否发生与临床相关tNGS结果一致的抗菌调整，分为tNGS一致性调整组（108例，39.4%）和无一致性调整组（166例，60.6%）。总体队列平均年龄61.3±15.0岁，男性165例（60.2%），感染类型包括社区获得性肺炎（CAP）123例（44.9%）、医院获得性肺炎（HAP）110例（40.1%）和呼吸机相关性肺炎（VAP）41例（15.0%），185例（67.5%）在BALF采样前72小时内有抗菌药物暴露。全队列中免疫抑制85例（31.0%），BALF采样时入住ICU 108例（39.4%），接受机械通气76例（27.7%），符合脓毒症标准87例（31.8%）。与无一致性调整组相比，tNGS一致性调整组免疫抑制患者比例更高（38.9% vs 25.9%，P=0.023）、ICU入住率更高（49.1% vs 33.1%，P=0.008）、机械通气比例更高（37.0% vs 21.7%，P=0.006），两组在年龄、性别、感染类型、合并症、采样前抗菌药物暴露或主要实验室指标方面无显著差异。在患者水平配对分析中，BALF-tNGS检出至少一种临床相关病原体的患者比例高于联合CMTs策略[71.9%（197/274）vs 41.2%（113/274）；配对OR=8.636，95%CI：4.626–16.123，P<0.001]。患者水平上，两种方法均阳性102例（37.2%），仅BALF-tNGS阳性95例（34.7%），仅CMTs阳性11例（4.0%），两者均阴性66例（24.1%）。按预设类别，BALF-tNGS对细菌[51.1%（140/274）vs 31.0%（85/274）；配对OR=3.619，95%CI：2.232–5.867，Holm校正P<0.001]、真菌[22.6%（62/274）vs 9.1%（25/274）；配对OR=3.312，95%CI：1.894–5.794，Holm校正P<0.001]、病毒[18.2%（50/274）vs 2.9%（8/274）；配对OR=8.000，95%CI：3.424–18.693，Holm校正P<0.001]和非典型病原体[6.9%（19/274）vs 1.8%（5/274）；配对OR=3.800，95%CI：1.419–10.177，Holm校正P=0.016]的检出率均高于CMTs，分枝杆菌方面无显著差异[5.8%（16/274）vs 3.3%（9/274）；配对OR=1.875，95%CI：0.795–4.422，Holm校正P=0.211]。此外，BALF-tNGS检出临床相关混合感染的比例高于CMTs[24.5%（67/274）vs 7.7%（21/274）；配对OR=5.600，95%CI：2.857–10.975，Holm校正P<0.001]。两名临床医生评估病原体临床相关性的评估者间一致性较高（Cohen's κ=0.82）。临床相关病原谱覆盖细菌、真菌、病毒、分枝杆菌和非典型病原体。细菌中最常检出的为肺炎克雷伯菌、鲍曼不动杆菌和铜绿假单胞菌，分别为38、37和32例，其次为金黄色葡萄球菌、肺炎链球菌和流感嗜血杆菌。真菌主要为耶氏肺孢子菌和烟曲霉，分别检出29和26例。病毒中巨细胞病毒、呼吸道合胞病毒和甲型流感病毒常见。分枝杆菌包括结核分枝杆菌复合群和非结核分枝杆菌，分别检出14和11例。非典型病原体中鹦鹉热衣原体、嗜肺军团菌和肺炎支原体分别检出11、5和4例。部分病原体如鹦鹉热衣原体和诺卡菌属主要仅由BALF-tNGS检出，多数真菌和病毒病例也仅由BALF-tNGS检出，而部分常见细菌和分枝杆菌由tNGS和CMTs共同检出。274例患者中，129例（47.1%）在tNGS报告后72小时内至少发生一次抗菌调整，其中108例（39.4%）接受tNGS一致性调整，21例（7.7%）接受非一致性或经验性调整。tNGS一致性调整类型包括抗菌药物升级或抗菌谱扩大38例（13.9%）、降级或抗菌谱缩窄34例（12.4%）、抗真菌启动或优化27例（9.9%）、抗病毒启动17例（6.2%）、停用部分抗菌药物17例（6.2%）、加用非典型病原体覆盖14例（5.1%）、抗结核或抗分枝杆菌启动或优化9例（3.3%）。145例（52.9%）未发生抗菌调整，原因包括经验性治疗已覆盖检出病原体（57例，20.8%）、结果考虑为定植、污染或临床意义不明确（45例，16.4%）及原方案下临床改善（36例，13.1%）。此外，110例（40.1%）接受感染科专科会诊，40例（14.6%）进行多学科讨论。探索性亚组分析显示，ICU患者较非ICU患者一致性调整率更高（49.1% vs 33.1%；OR=1.94，95%CI：1.15–3.29，P=0.011），免疫抑制患者（49.4% vs 34.9%；OR=1.82，95%CI：1.05–3.16，P=0.032）及临床相关混合感染患者（64.2% vs 31.4%；OR=3.89，95%CI：2.11–7.32，P<0.001）更可能接受一致性调整。tNGS一致性调整组报告后7天达到早期临床改善复合终点的患者比例高于无一致性调整组（71.3% vs 57.8%，P=0.024），该复合指标反映呼吸支持、氧合及感染相关临床表现的早期变化。此外，一致性调整组CRP较基线下降≥50%（68.5% vs 50.0%，P=0.002）和PCT下降≥50%（58.3% vs 42.2%，P=0.009）的比例更高。两组在报告后住院时间[8.0（7.0–10.0）天 vs 9.0（6.2–11.0）天，P=0.310]、28天全因死亡率（10.2% vs 13.3%，P=0.446）或机械通气强度增加方面无显著差异。将年龄、BALF采样时ICU入住、免疫抑制状态、白蛋白、ln(PCT+0.1)、临床相关混合感染及tNGS一致性治疗调整纳入多因素logistic回归模型，校正年龄、疾病严重程度、免疫状态及实验室参数后，tNGS一致性调整与达到早期临床改善复合终点的更高比值相关（校正OR=4.120，95%CI：2.088–8.131，P<0.001）。此外，年龄较大与达到早期临床改善复合终点的比值较低相关（校正OR=0.977，95%CI：0.958–0.996，P=0.020），BALF采样时ICU入住也与改善比值较低相关（校正OR=0.380，95%CI：0.206–0.701，P=0.002），白蛋白水平较高与改善比值增加相关（校正OR=1.102，95%CI：1.025–1.184，P=0.008），ln(PCT+0.1)水平较高与改善比值降低相关（校正OR=0.354，95%CI：0.231–0.543，P<0.001），免疫抑制状态和临床相关混合感染在该模型中与早期临床改善复合终点无显著相关。讨论部分指出，本研究评估了BALF-tNGS在肺部感染患者病原体鉴定和抗菌决策中的临床价值，结果显示BALF-tNGS较同期CMTs提供额外的临床相关病原体信息，提示其可在复杂肺部感染的病因学评估中补充传统方法。进一步分析显示部分tNGS结果后伴随一致性抗菌调整，且这些调整与临床和炎症指标的早期变化相关，提示BALF-tNGS的潜在效用可能主要在于促进病原体数据整合并支持临床决策，而其与硬性临床结局的关联仍不确定。BALF-tNGS对多数病原体类别的临床相关检出率高于CMTs，与既往BALF-tNGS研究报道的增量产出一致。通过多重PCR富集预定义靶序列，tNGS可在单次检测中覆盖细菌、真菌、病毒和非典型病原体。与培养相比，核酸检测较少依赖病原体活力，可能在采样前已接受抗菌治疗的患者中保留部分诊断能力。本队列67.5%患者在BALF采样前72小时内有抗菌药物暴露，可能部分解释tNGS相对于培养依赖方法的增量检出。真菌、病毒和非典型病原体的差异也可能受专科CMT检测使用不一致的影响，因为这些检测并非所有患者常规开展。鹦鹉热衣原体和诺卡菌属等病原体主要仅由tNGS检出，应谨慎解读，这些发现可能代表额外病原体检出，但也可能反映假阳性信号或非活菌残留核酸。同时tNGS仍受靶标覆盖、病原体载量、核酸提取效率、标本质量和阳性阈值限制，而CMTs可检出tNGS预定义靶标范围外的病原体。两种策略在分枝杆菌检出方面无显著差异，可能与病例数有限、专科检测路径相对成熟及方法学差异有关。此外，比较基于患者水平临床相关检出率而非针对独立参考标准的诊断准确性。核酸检测本身不能区分活动性感染、定植、潜伏或再激活、残留核酸或污染，因此判读需结合免疫状态、影像学和同期微生物学证据，增量检出的临床意义取决于其能否可靠转化为可操作的治疗信息。本研究中39.4%患者在报告后72小时内接受与临床相关tNGS结果一致的抗菌调整，调整方向既包括扩大抗菌谱和加用抗真菌、抗病毒、抗分枝杆菌或非典型病原体覆盖，也包括降级、缩窄抗菌谱和停用部分药物，提示tNGS可能同时支持识别既往未覆盖的病原体和优化经验性治疗。既往研究报告的测序相关治疗调整比例差异较大，部分BALF-tNGS研究报告17.2%的患者发生调整，而重症或复杂肺部感染队列中观察到更高比例。BALF-mNGS研究中仅归因于测序结果的调整比例从不足10%到更高水平不等，这些差异可能与患者构成、初始经验性方案、报告周转时间及治疗调整定义有关。本研究采用报告后固定72小时窗口并要求治疗方向与临床相关tNGS结果明确对应，反映了相对严格的一致性调整定义，可能部分解释报告调整率的差异。未发生调整并不一定表明检测缺乏临床效用，经验性治疗已覆盖检出病原体、检出信号临床意义不明确或患者改善均可构成维持当前方案的合理依据。同时，即使调整与tNGS结果一致，也不能假定其仅由tNGS驱动，同期CMTs、影像学变化、炎症标志物、会诊意见和临床病程也可能参与决策。因此BALF-tNGS应被视为综合临床决策中的补充微生物学工具而非独立治疗指令。探索性亚组分析显示ICU患者、免疫抑制患者及临床相关混合感染患者中一致性调整更常见，提示tNGS信息在临床复杂人群中可能更易转化为治疗变更，这些亚组并非互斥，其重叠可能影响观察到的亚组差异，但该发现仅反映不同患者亚组间调整模式的差异，仍需进一步验证。一致性治疗调整与达到早期临床改善复合终点及CRP和PCT下降≥50%的患者比例较高相关，且该关联在多因素校正后仍存在，这可能反映微生物学发现与后续抗菌覆盖之间更好的一致性。既往BALF测序研究也报道了测序相关治疗调整与短期临床反应之间的关联。然而治疗调整并非随机分配，临床医生在病原体可信且存在可操作方案时更可能实施调整，可能引入适应证混杂和临床选择偏倚。调整窗口与复合结局评估窗口部分重叠，报告后临床状态的早期变化也可能反向影响治疗决策。此外，全队列中未观察到一致性调整与机械通气强度增加、报告后住院时间或28天全因死亡率之间的显著关联，既往研究关于测序检测与硬性临床终点关系的结果也不一致。因此这些结果应解读为探索性临床关联而非因果治疗效应证据，死亡或住院时间方面的获益尚未确立，成本效益也未评估。局限性方面，本单中心回顾性队列仅纳入接受支气管镜和BALF-tNGS的住院患者，与检测指征相关的选择可能限制结果的普适性。其次缺乏统一独立的病原体鉴定参考标准，CMTs因临床指征和标本类型而异，其结果在BALF采样前后7天内收集，可能引入检测策略和时机差异。临床相关性评估依赖临床判断，不能排除病原体误分类。此外，完整的tNGS靶标列表、病原体特异性阳性阈值和分析检测限无法从现有回顾性记录中独立验证，可能限制方法学可重复性。第三，治疗调整非随机分配，可能受疾病严重程度、初始方案、同期微生物学发现和临床决策影响，尽管进行多因素校正仍可能存在残余混杂，且无法从现有数据中分别量化类别间和类别内抗菌变更。调整与结局评估窗口重叠限制了因果解释。最后，早期临床改善复合终点依赖非标准化的回顾性临床评估，可能受记录不完整、调整组间记录差异及非标准化临床评估变异性的影响，复合结局的时机未在组间比较，也未进行排除极早期改善患者的敏感性分析，因此组间临床改善时机的潜在差异仍不确定。CRP和PCT变化也可能反映疾病严重程度、基础疾病和治疗差异，机械通气升级事件和死亡数量有限可能降低检测这些结局差异的统计效能，需要更大规模前瞻性研究。结论部分翻译为：在本队列中，BALF-tNGS检出的临床相关病原体多于同期CMTs，并与部分患者后续抗菌治疗调整相关。在探索性分析中，一致性调整与达到早期临床改善复合终点及炎症标志物下降相关，但与机械通气强度增加、报告后住院时间或28天全因死亡率无显著关联。BALF-tNGS可作为CMTs和综合临床评估的补充，但鉴于非随机设计和重叠的评估窗口，这些关联不能确立因果治疗效应，其对于治疗决策和患者结局的独立临床价值需在具有预设tNGS指导治疗方案、盲法结局评估和更长随访期的前瞻性多中心研究中进一步评价。
