双靶标qPCR-HRM分析用于直接从临床样本鉴别L. (L.) donovani复合体内L. (L.) infantum、L. (L.) donovani及杂合样变异株

《Journal of Clinical Microbiology》：A dual-target qPCR coupled with high-resolution melting analysis for direct strain discrimination within the Leishmania donovani complex

分子诊断方法，尤其是靶向核DNA或动基体DNA（kDNA）的定量聚合酶链反应（qPCR）检测，已显著提高利什曼原虫检测的灵敏度。然而，标准qPCR方法无法直接区分亲缘关系较近的物种，如L. (L.) infantum与L. (L.) donovani，这构成准确诊断和流行病学监测的关键限制。全基因组测序（WGS）和多位点微卫星分型（MLMT）虽可解析物种并发现L. (L.) infantum/L. (L.) donovani杂合体，但两者成本高且耗时。本研究开发了双靶标qPCR联合高分辨率熔解（HRM）分析，可直接从临床标本中区分具有医学意义的旧世界利什曼原虫物种，特别是L. (L.) infantum、L. (L.) donovani及与推定L. (L.) infantum/L. (L.) donovani杂合体相关的基因型。该检测靶向两个代谢基因——苹果酸酶（ME）和核苷水解酶（NH）——内的特异性多态性。该系统性能和区分能力使用参考菌株、临床分离株以及人源和犬源临床样本组成的面板进行验证。所建立的qPCR-HRM检测成功区分L. (L.) infantum与L. (L.) donovani，并鉴定L. (L.) infantum变异体，包括显示推定L. (L.) infantum/L. (L.) donovani杂合样谱的样本。重要的是，该方法在直接应用于临床样本时表现出高分析灵敏度（每反应管1个寄生虫）和82.7%的分型率，可在不进行寄生虫分离的情况下区分L. (L.) donovani复合体内的菌株。该双靶标qPCR-HRM方法为旧世界利什曼原虫物种鉴定和基因分型提供了快速、经济有效的筛查工具。通过实现临床样本直接分析，该方法在改善人利什曼病和犬利什曼病监测及流行病学追踪方面具有较强潜力。

利什曼原虫（Leishmania spp.）是利什曼病病原，其旧世界医学相关种包括可致内脏利什曼病（VL）和皮肤利什曼病（CL）的L. (L.) infantum与L. (L.) donovani等。不同种及株在地理分布、传播循环、动物储存宿主和临床转归上存在差异，故种/株水平鉴定对诊断、治疗随访和流行病学监测均重要。常规qPCR靶向核DNA或动基体DNA（kDNA）虽灵敏，却难以直接区分L. (L.) infantum与L. (L.) donovani；内部转录间隔区1聚合酶链反应-限制性片段长度多态性（ITS1-PCR-RFLP）需酶切和高分辨率电泳；全基因组测序（WGS）和多位点微卫星分型（MLMT）可解析种及推定杂合体，但成本高、分析复杂且常需寄生虫分离。近期意大利发现推定L. (L.) infantum/L. (L.) donovani杂合体，进一步增加监测难度。为此，研究人员建立双靶标qPCR-HRM方法，靶向苹果酸酶（ME）和核苷水解酶（NH）基因多态区，直接区分旧世界利什曼原虫种、L. (L.) infantum变异体及杂合样基因型，结论是该法快速、经济、灵敏，可无需寄生虫分离用于筛查和监测。

关键技术方法概括：研究人员纳入21株参考株、9株临床分离株和87份临床样本；临床样本来自意大利中部和南部，临床分离株来自意大利北部、中部和南部，涵盖人源和犬源等。关键技术包括基于ME和NH多态区设计qPCR-MEOW与qPCR-NHOW，扩增后进行HRM分型并以参考株建立谱型；对部分扩增子行Sanger测序验证；以ITS1-PCR-RFLP等作参考鉴定；开展扩增子序列系统发育分析；用Fisher精确检验比较基因型分布。

研究结果：
Amplicon-based polymorphism analysis of ME and NH genes reveals distinct clustering of Leishmania species and related variants：研究人员对ME和NH扩增子序列作系统发育分析，ME序列分为5簇，包括L. (L.) infantum/L. (L.) donovani、L. (L.) infantum c.273C > T、L. (L.) infantum杂合c.273C > Y、L. (L.) major及L. (L.) tropica/L. (L.) aethiopica；NH序列分为4簇，包括L. (L.) infantum、L. (L.) infantum c.562T > C变异体、L. (L.) donovani c.480A > G及L. (L.) infantum杂合c.562T > Y。合并序列分析分4簇，特定单核苷酸多态性（SNP）可区分变异体与杂合基因型；L. (L.) donovani MHOM/CN/0000/Wangjie-1因c.546G > T未稳定归簇。

Specificity and sensitivity evaluation of the qPCR assay：通过BLASTn和实验特异性评价，引物与目标ME/NH序列匹配，不扩增宿主DNA或T. cruzi；两qPCR检测限为1×10^?4 ng DNA/反应管，约相当于每反应管1个寄生虫，qPCR-MEOW效率≥89%，qPCR-NHOW效率≥94%，R² ≥ 0.98；人DNA背景下Cq略延迟，但线性和检测限不变。

Species discrimination by the combined use of qPCR-MEOW and qPCR-NHOW and HRM analysis：qPCR-MEOW后HRM可分5种谱型（A—E），qPCR-NHOW后HRM可分2种谱型（1—2）。谱型A需NHOW进一步区分A1为L. (L.) infantum、A2为L. (L.) donovani；谱型B结合NHOW可分B1变异体与B2杂合样；未扩增者判为未分型。与参考方法在成功分型样本中一致率为93/93；总灵敏度87.2%（102/117），临床样本分型率82.7%（72/87），参考株和临床分离株为100%。

Detection of L. (L.) infantum variants and hybrid-like profiles using dual-target qPCR-HRM：ME c.273C > Y杂合见于20/96（20.8%）样本，其中人源相关样本为20/58（34.5%）；c.273C > T见于36份L. (L.) infantum样本。B2对应ME c.273C > T与NH c.562T > C，和MHOM/DZ/82/LIPA59及5份临床样本一致，3株既往推定杂合体均呈B2。NH c.562T > Y见于人临床样本2604。人源样本以变异体为主（81%），犬源以A1为主（77%），分布差异有统计学意义（Fisher精确检验，P < 0.01）；4份黏膜利什曼病（ML）样本呈C1，但未发现基因型与临床表现显著相关。

讨论部分总结：区分L. (L.) infantum与L. (L.) donovani对临床和监测重要，尤其涉及黑热病后皮肤利什曼病（PKDL）等差异；现有ITS1-PCR-RFLP及WGS、MLMT、MLST等方法受酶切电泳、成本或寄生虫分离限制。该双靶标qPCR-HRM无需酶切、电泳和分离培养，分析灵敏度约1个寄生虫/反应，临床样本分型率>80%；未分型多与寄生虫DNA低量或质量差有关。方法可鉴定L. (L.) major、L. (L.) tropica/L. (L.) aethiopica、L. (L.) infantum变异体及杂合样谱型；B2仅为杂合样分子特征，不能证明杂合起源或量化基因组混合，需高分辨率基因组方法确认。研究区域临床样本未检出L. (L.) donovani等，Mundinia亚属未实验评估，Viannia可在早期流程排除；样本量限制使基因型与临床表型关系需扩大队列验证。总体优势是可直接从临床样本分型，适合大规模筛查和优先选择后续基因组分析样本。

研究结论翻译：总之，研究人员描述了一种快速、灵敏的分子方法，用于区分L. (L.) infantum与L. (L.) donovani以及主要具有临床相关性的旧世界利什曼原虫物种。该检测具有高分析灵敏度，并直接在临床样本上应用时达到>80%的分型率，无需寄生虫分离和培养。总体而言，所提出的分子方法为大规模流行病学调查和基因组监测提供了有效工具，可快速监测人和其他哺乳动物中利什曼原虫基因型的流行。